响应面法优化姜黄素提取工艺及其对类淀粉样蛋白聚集形成的抑制

张 良1,2，杨 松3，何剑为1，邹志远1，贾丽娇1，蒋 坤1，孟宪军4，张慧丽1,4,*

(1.辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036；2.沈阳农业大学生物技术学院，辽宁 沈阳 110866；

3.沈阳军区联勤部药品仪器检验所，辽宁 沈阳 110026；4.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

摘 要：目的：半胱氨酸酶抑制剂(cC)L68Q突变后能够以二聚体开始进一步产生类淀粉样聚集。研究姜黄素对基因重组突变cC的毕赤酵母Pichia pastoris X-33表达菌的生长和分泌的影响，以及抑制突变cC的类淀粉样聚集的作用。方法：采用响应面法优化姜黄素的提取工艺，通过液体比浊法探究姜黄素对基因重组菌株生长抑制的作用，通过SDS-PAGE研究不同浓度的姜黄素对cC的分泌的作用，通过刚果红染色法研究姜黄素对cC蛋白聚集的抑制作用。结果：由Design-Expert响应面分析软件得到姜黄素最佳提取条件为：液固比30:1(mL/g)、超声功率300W、提取时间15min，此条件下提取率达3.97mg/g。姜黄素对重组菌体生长的抑制作用的相对稳定，但随着姜黄素添加量的增加，其对蛋白分泌量和聚集沉淀量均抑制明显。结论：姜黄素对基因重组cC的生长、分泌和聚集有抑制作用。

关键词：姜黄素；半胱氨酸酶抑制剂；响应面法优化

Optimization of Curcumin Extraction by Response Surface Methodology and Its Inhibitory Effect on Amyloid Aggregation

ZHANG Liang1,2，YANG Song3，HE Jian-wei1，ZOU Zhi-yuan1，JIA Li-jiao1，JIANG Kun1，MENG Xian-jun4，ZHANG Hui-li1,4,*

(1. College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China；

2. College of Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；

3. Shenyang Joint Logistics Department of Military Institute for Drug and Instrument Control, Shenyang 110026, China；

4. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract：Objective: The L68Q mutation in the cystatin C (cC) gene can form amyloid through dimers at the initial stage. The curcumin was used to explore the growth of yeast and the quantity of secretory cC in mutated recombinant yeast Pichia pastoris as well as its inhibitory effect on amyloid accumulation of cC. Methods: The extraction of curcumin was optimized using response surface methodology. The inhibitory effect of curcumin on the growth of recombinant cC yeast was measured. The quantity of cC, secreted by yeast in media with curcumin at different concentrations, was evaluated by SDS-PAGE. The degree of cC amyloid in the presence of curcumin was explored by Congo red staining. Results: The optimal extraction conditions for solid/solvent ratio, ultrasonic power and time were 30:1 (mL/g), 300 W and 15 min, respectively. Under these conditions, the yield of curcumin was 3.97 mg/g. The inhibitor effect of curcumin on recombinant yeast growth was relatively mild, but increased curcumin concentration could more effectively inhibit the secretion of cC and cC amyloid. Conclusion: Curcumin can inhibit the growth, protein secretion of recombinant yeast and amyloidogenic characteristics of recombinant cystatin.

Key words：curcumin；recombinant cystatin；response surface methodology

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0055-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320011

姜黄是一种古印第安植物[1]，姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种黄色色素[2]，最早作为调味品——咖喱粉和草药使用，安全无毒，不仅被联合国世界卫生组织，食品药品管理局批准为天然食品添加剂，同时还具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗血管病、抗HIV整合酶和抗菌等药理活性[3-10]。自2001年Park等[11]发现姜黄素能通过阻断聚集链的延伸防治阿尔茨海默症，Lim等[12]发现给年老的小鼠喂食姜黄素，大脑内聚集物斑块会减少；Zhang等[13]发现姜黄素可通过减少聚集前体而降低小鼠脑内聚集单体的水平；其他关于姜黄素预防类淀粉样蛋白聚集的神经退化性疾病的预防机制的研究也有报道[14-15]。

淀粉样脑血管病也是一种类淀粉样蛋白聚集的神经退化性疾病，是由L68Q基因突变的半胱氨酸酶抑制剂(cystatin，cC)形成二聚体，进一步聚合后引发血管内壁淀粉样蛋白的沉积，血管壁弹力下降；同时组织蛋白酶局部的过度表达，从而也能引起颅内反复出血，导致中风、精神错乱、甚至死亡[16-17]。

以淀粉样脑血管病致病机制的半胱氨酸酶抑制剂cC的基因重组菌为细胞模型，主要研究姜黄素对类淀粉样蛋白聚集形成的抑制作用。首先利用响应面法优化姜黄素提取工艺，解决姜黄素溶出度的问题[18]，然后通过姜黄素对基因重组菌的生长、分泌和分泌蛋白聚集形成的抑制作用效果，进一步为姜黄素作为食品添加剂和食用咖喱对脑淀粉样血管病、阿尔茨海默病症和帕金森氏等类淀粉样聚集的神经退化性疾病的预防作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜黄产自四川乐山市。

L68Q突变cC的基因重组毕赤酵母Pichia pastoris X-33菌株(本实验室构建) 辽宁大学生命科学院菌种贮藏室；姜黄素标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

JYC-LQ超声波提取器 上海矩源有限公司；U3010紫外-可见分光光度计 日本日立公司；Dolphin-Doc凝胶成像系统 美国Wealtec公司；Powerpac Universal电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 响应面法优化姜黄素提取工艺

1.3.1.1 最佳波长确定

精确配制5.0μg/mL的姜黄素乙醇溶液，使用紫外分光光度计进行全波长扫描，确定最佳波长。

1.3.1.2 姜黄素标准曲线及回归方程

以95%乙醇为溶剂，准确配制0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、4.0μg/mL的姜黄素溶液，利用紫外分光光度计测定，并绘制标准曲线，回归方程为：y=48.649x＋1.1017，R2=0.9966。

1.3.1.3 单因素试验

分别以液固比、超声功率、提取时间为因素，提取率为指标，确定最佳液固比、超声功率及提取时间。

1.3.1.4 提取条件的优化

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[19]，以液固比、超声功率和提取时间为自变量，提取率为响应值，设计响应面分析试验，在前期单因素试验基础上设定试验的因素和水平值(表1)。

表 1 因素水平表

Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.2 姜黄素对重组菌株生长的影响

取6个50mL的康宁离心管加15mL的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基和0.2mL的104基因重组毕赤酵母Pichia pastoris X-33菌悬液，分别加0.15mL水(对照)、95%乙醇和姜黄素溶液5、10、20、30mmol/L。同上述操作，不加菌悬液为阴性对照。实验组重复3次。29℃条件下250r/min恒温振荡培养28h，波长600nm处测量OD值。

1.3.3 姜黄素对半胱氨酸酶抑制剂的分泌的影响

接种重组酵母到添加2g/100mL葡萄糖YPD液体培养基中，29℃条件下250r/min恒温振荡培养至OD值为5时，转接0.25mL菌体至新鲜的25mL YPD液体培养基中进行次级培养24h后，1500×g离心5min，弃上清液，用添加0.5%甲醇YPM液体培养基稀释菌体至OD值为1后，分别加0.15mL水(对照)、95%乙醇和姜黄素溶液5、10、20、30mmol/L。29℃条件下250r/min培养72h，每隔24h补加100%甲醇溶液至甲醇终体积分数为0.5%。硫酸铵分级沉淀蛋白，电泳检测。

1.3.4 分泌蛋白的底物活性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在添加0.1g/100mL酪蛋白的变性电泳中加蛋白样品混合液10μL，75V电泳至染料前沿进入分离胶后，150V电泳至结束。凝胶先用2.5g/100mL的TritonX-100洗2次，每次30min，然后在含有底物木瓜蛋白酶的0.10mol/L磷酸缓冲液中40℃条件下水浴2.5h。经染色、脱色后检测。

1.3.5 姜黄素对半胱氨酸酶抑制剂聚集的抑制作用[20-21]

将2mL质量浓度为1mg/mL的蛋白样品溶于15mL pH2.0的66mmol/L甘氨酸-HCl反应缓冲液中，分别加0.15mL水(对照)、95%乙醇和姜黄素溶液5、10、20、30mmol/L。混合均匀后于57℃条件下培养30d。牛血清白蛋白为对照，重复以上实验。实验组重复3次。30d后各组取出1.5mL加入相同体积新鲜配制的30µmol/L刚果红溶液混合，25℃条件下放置30min，在波长480nm和540nm处测定OD值，重复3次计算平均值。沉淀浓度按下式[22-23]计算：

沉淀浓度/(µmol/L)=(

OD540nm

25295

－

OD480nm

46306)

)×1000

2 结果与分析

2.1 最佳波长确定

图 1 姜黄素全波长扫描

Fig.1 Full wavelength scanning of curcumin

由图1可见，姜黄素提取液最大吸收波长为423nm。

2.2 单因素试验

图 2 提取时间对姜黄素提取率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of curcumin

在超声功率300W、液固比30:1条件下，测定不同提取时间对姜黄素提取率的影响，如图2所示，提取时间从5～25min，提取率先增大后减小，提取15min时姜黄素提取率达到最大。

图 3 超声功率对姜黄素提取率的影响

Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of curcumin

在提取时间15min、液固比30:1条件下，测定不同超声功率对姜黄素提取率的影响，如图3所示，超声功率300W时，姜黄素提取率达到最大。

在提取时间15min、超声功率300W条件下，测定不同液固比对姜黄素提取率的影响，如图4所示，液固比从15:1～40:1变化过程中，提取率先增大后逐渐下降，液固比30:1时姜黄素提取率达到最大。

图 4 液固比对姜黄素提取率的影响

Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of curcumin

2.3 Box-Behnken试验

响应面试验方案及结果见表2，将试验数据进行多元回归拟合，得到以姜黄素提取率(Y)为目标函数的二次回归方程模型为：

Y=12.86625＋0.44750x1＋0.056175x2＋0.23562x3－2.1×
10－4x1x2＋1.7×10－3x1x3－1×10－4x2x3－6.9×10－3x12－8.2×
10－5x22－8.2×10－3x32

对该数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数。

表 2 响应面设计方案和试验结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表 3 试验结果方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the experimental results of

Box-Behnken design

由表3可知，模型极显著(P＜0.0001)，其决定系数R2=0.9894，说明用此模型可以预测提取率(Y)对液固比(x1)、超声功率(x2)和提取时间(x3)3个因素的响应值。此模型中，x12、x22对姜黄素提取率(Y)的影响达到5%水平，x2、x3对姜黄素提取率(Y)的影响达到1%水平。

由图5的响应面和等高线图可以看出液固比(x1)、超声功率(x2)和提取时间(x3)存在极值点，在此条件下提取率达到3.97mg/g，与预测值(3.93mg/g)十分接近，表明预测值和实际值有很好的拟合性，验证了模型的可靠性。由Design-Expert响应面分析软件RSM分析得到姜黄素最佳提取条件为：液固比30:1(mL/g)、超声功率300W、提取时间15min。

图 5 姜黄素提取率的响应面和等高线图

Fig.5 Response surface and contour plots for the extraction yield of curcumin as a function of various extraction conditions

2.4 姜黄素对重组菌株生长的影响

图 6 姜黄素添加浓度对重组酵母生长影响趋势对比图

Fig.6 Effect of curcumin at various concentrations on the growth of recombinant yeast

从图6可以看出，空白组的菌体浓度OD均值在0.283，乙醇组菌体浓度OD均值在0.273，由于乙醇的作用使菌体生长受到一定的抑制。随着姜黄素浓度的增加，菌体的生长受到抑制，乙醇和姜黄素浓度的OD差值就是姜黄素的作用效果，从中还可以得到姜黄素浓度在20～30mmol/L时，姜黄素的菌体浓度趋于稳定，因此可以用于蛋白分泌的变化规律的研究。

2.5 姜黄素对菌体分泌cC的的影响

图 7 不同浓度的姜黄素对cC分泌的影响

Fig.7 SDS-PAGE showing the effect of curcumin at various concentrations on the secretion of cC

诱导表达72h的上清液经Bradford法测定蛋白含量，按水(对照)、95%乙醇和姜黄素溶液5、10、20、30mmol/L的次序蛋白含量依次为：2.82、1.89、0.95、0.31、0.19、0.09、0.02mg/mL，和图7正好顺序相反，根据图7重组cC电泳条带的灰度可定性和半定量判断，活性cC的分泌量按图示依次增加。

表 4 姜黄素对蛋白分泌的作用效果

Table 4 Effect of curcumin on the secretion of cC

注：比率值=姜黄素OD值/乙醇OD值。

由表4可知，比较姜黄素在同一浓度下的菌体生长和蛋白分泌比率可知，排除对生长的抑制作用，姜黄素对蛋白分泌的作用效果非常明显。

2.6 姜黄素对cC聚集形成的抑制作用

图 8 姜黄素对重组cC聚集的抑制效果

Fig.8 Inhibitory effect of curcumin on recombinant cystatin aggregation

由图8可知，各组蛋白培养30d后，经刚果红染色测定，重组cC蛋白在缓冲液中聚集沉淀浓度达到了约1.31µmol/L，牛血清白蛋白在同样条件下培养聚集沉淀为0.085µmol/L，按图8姜黄素的添加量，得到的蛋白聚集沉淀分别为1.28、1.13、0.98、0.78、0.70µmol/L，随着姜黄素浓度的增加抑制作用增强，姜黄素对重组cC有明显的抑制聚集形成的作用。

3 结 论

由Design-Expert响应面分析软件RSM分析得到姜黄素最佳提取条件为液固比30:1(mL/g)、超声功率300W、提取时间15min，此条件下提取率达3.97mg/g。5mmol/L姜黄素对菌体生长和蛋白分泌就有作用，比较姜黄素在同一浓度下的菌体生长和蛋白分泌比率可知，排除对生长的抑制作用，姜黄素对蛋白分泌的作用效果也非常明显。5mmol/L姜黄素对重组cC有抑制聚集形成的作用，到30mmol/L只有少量的聚集蛋白形成，因此，姜黄素对重组cC有明显的抑制聚集形成的作用。

在提取阶段得到的醇溶姜黄素对重组蛋白分泌和聚集的影响效果比较明显，由于表达蛋白为分泌蛋白作用效果直接，而人体突变cC分泌机制不同于重组菌体的分泌机制，胞内的蛋白聚集还要更多的研究，从而才能证明姜黄素对人体突变cC具有抑制作用[24-25]。对于抑制作用主要是在二聚体形成阶段还是阻断聚集纤维的延伸，这也将在后续的实验中用电镜进行验证[16]，同时，也能进一步证明姜黄素自身结构是如何嵌入蛋白，抑制聚集物的形成和延伸，从而发挥抗淀粉样蛋白的作用的[26]，也能更好地解释食用咖喱主要成分的区域的类淀粉样神经退化性疾病发病率低的现象[2]，确定在食品中添加姜黄素能安全预防类淀粉样神经退化性疾病的适用范围[8]。

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