大孔树脂纯化西番莲果皮花色苷工艺

曾绍校，彭 彬，陈 洁，林志钦，郑宝东*

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

摘 要：通过静态吸附-解吸实验筛选适合西番莲果皮花色苷纯化的大孔树脂，并进行静态、动态吸附-解吸工艺条件优化。结果表明：在供试树脂中，HP-20大孔树脂为西番莲果皮花色苷纯化最适用的吸附剂，其静态吸附最优条件为温度40℃、pH4.0、洗脱液为90%酸化乙醇(pH3.5)；动态吸附-解吸最适工艺条件为：上样液流速4.5BV/h、上样液质量浓度18.176μg/mL、洗脱剂用量6BV、洗脱流速3BV/h。

关键词：西番莲果皮；花色苷；HP-20大孔树脂；吸附

Purification of Pigments from Passiflora edulis Rind by Macroporous Resin Adsorption

ZENG Shao-xiao，PENG Bin，CHEN Jie，LIN Zhi-qin，ZHENG Bao-dong*

(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Abstract：Static adsorption and desorption experiments were conducted to screen the suitable macroporous resin for purifying pigments from Passiflora edulis rind. The conditions for static and dynamic adsorption and desorption were optimized. Results showed that macroporous resin HP-20 was the most favorable adsorbent for Passiflora edulis rind anthocyanins. The optimal static adsorption and desorption conditions were adsorption at 40 ℃ of samples at pH 4.0 and desorption with 90% acidified ethanol (pH 3.5). The optimal dynamic adsorption and desorption conditions were loading of 18.176 μg/mL sample solution at a flow rate of 4.5 BV/h and gradient desorption with 6 BV of the desorption solvent at a flow rate of 3 BV/h.

Key words：Passiflora edulis rind；anthocyanins；macroporous resin HP-20；adsorption

中图分类号：TS255.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0061-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320012

西番莲(Passionfora edulis f. flavicarpa Degener)又名百香果、鸡蛋果，因其含有一百多种芳香物质，被世人冠以世界上最芳香水果，果汁之王等美誉[1]。笔者通过前期研究发现紫果西番莲表皮含有花色苷类色素，具有潜在开发应用前景。花色苷类是自然界中最常见的一种水溶性植物色素，广泛分布于植物的花和果实中，具有抗氧化、清除自由基、增强机体免疫力等生理功能[2-5]。采用有机溶剂提取得到的花色苷粗提物往往含有大量杂质，需要进一步除杂和精制。大孔吸附树脂法是根据吸附性和分子筛原理将具有一定极性的有机大分子物质进行分离，该方法具有吸附选择性好、处理容量大、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、成本低等优点，适合于工业化生产[6-10]。目前，大孔树脂纯化西番莲果皮花色苷的研究尚未见报道，本实验对西番莲果皮花色苷纯化树脂的筛选及西番莲果皮花色苷吸附-解吸性质进行研究，探讨HP-20树脂分离纯化西番莲果皮花色苷的工艺条件，为西番莲果皮花色苷工业化生产工艺的建立及优化提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表 1 几种大孔吸附树脂的理化性质

Table 1 Physical and chemical characteristics of macroporous adsorption resins

西番莲果皮由福州市闽清丰达农业公司提供，－18℃冰箱中冷冻保藏。

HP-20、X-5、D101、AB-8、NKA-9、S-8型大孔吸附树脂，其具体性能参数见表1；乙醇、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅 金坛市双捷实验仪器厂；WFZ UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司；R205B旋转蒸发仪 上海夏丰实业有限公司；KS-Ⅱ循环水式多用真空泵 杭州大卫科教仪器有限公司；PL602-L电子天平(0.0001g) 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；L-530台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司；BS-100A自动部分收集器、HL-2B恒流泵 上海沪西仪器设备厂；玻璃层析柱。

1.3 方法

1.3.1 西番莲果皮花色苷的提取

室温条件下用86%乙醇溶液(含0.054%盐酸、0.1%柠檬酸)提取西番莲果皮花色苷120min，过滤后滤液于40℃条件下真空浓缩。花色苷浓缩液用pH3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液按所需比例稀释，用于大孔树脂吸附性能的研究。

1.3.2 吸附及解吸指标

Qra/%=(A0－Aa)/A0×100 (1)

C0= A0×DF×Mr/ε (2)

Ca= Aa×DF×Mr/ε (3)

Cd= Ad×DF×Mr/ε (4)

Q a= (C0－Ca)×V/m (5)

Q d= Cd×Vd/m (6)

Qrd/%= Qd/Qa×100 (7)

式中：Qra为吸附率/%；Qa为吸附量/(mg/g)；Qd为解吸量/(mg/g)；Qrd为解吸率/%；A0为吸附前溶液吸光度；Aa为吸附后溶液吸光度；Ad为解吸后溶液吸光度；C0为吸附前溶液花色苷质量浓度/(mg/mL)；Ca为吸附后溶液花色苷质量浓度/(mg/mL)；Cd为解吸后溶液花色苷质量浓度/(mg/mL)；V为花色苷溶液体积/mL；Vd为解吸液体积/mL；m为树脂质量/g；DF为稀释倍数；Mr为花色苷相对分子质量，为449.2；ε为摩尔消光系数，以矢车菊素-3-葡萄糖苷计，为29600[2]。

1.3.3 静态吸附及解吸实验

1.3.3.1 各种树脂静态吸附率比较

分别称取8.000g经预处理后的树脂于100mL锥形瓶中，加入50mL等质量浓度花色苷液，封口，室温条件下遮光振荡(100r/min)。分别于1、2、3、4、5、24h后吸取上清液2mL于510nm波长处测定吸光度，测后倒回锥形瓶。

1.3.3.2 花色苷液质量浓度对树脂静态吸附率的影响

准确称取HP-20、X-5、D101这3种树脂每份8.000g于100mL锥形瓶中，移取不同质量浓度的花色苷液各50mL，室温条件下遮光振荡(100r/min)24h，测定吸光度。

1.3.3.3 树脂的解吸实验

选取吸附性能较好的树脂HP-20、X-5、D101，通过控制吸附时间使3种树脂的吸附率基本接近，计算并记录3种树脂的吸附率Qra。准确称取已吸附树脂2.000g于锥形瓶中。依次用蒸馏水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液(含0.054%盐酸和0.1%柠檬酸)梯度洗脱，每次洗脱振荡30min，速率为100r/min，洗脱剂用量25mL。过滤，以蒸馏水作为空白，在510nm波长处测定滤液吸光度，A总表示梯度洗脱液吸光度累加，以参数A总/Qra表示解吸效果。

1.3.3.4 大孔树脂对西番莲果皮花色苷静态吸附及解吸率测定

准确称取已处理树脂HP-20、X-5、D101每份4.000g，加入花色苷液50mL，室温100r/min振荡吸附2h，过滤，测定滤液吸光度。用25mL蒸馏水清洗已吸附树脂后吸干树脂表面水分，然后用80%乙醇(含0.054%盐酸和0.1%柠檬酸)50mL洗脱树脂30min，测定洗脱液吸光度，根据1.3.2节的公式计算各种树脂的吸附率及解吸率。

1.3.4 HP-20树脂静态吸附及解吸条件优化

1.3.4.1 花色苷液pH值对树脂吸附率的影响

准确称取已处理HP-20树脂1.000g，分别加入用pH1、2、3、4、5缓冲液稀释的花色苷液25mL，室温100r/min避光振荡60min，测定吸附后花色苷液吸光度。

1.3.4.2 温度对树脂吸附率的影响

称取已处理树脂3.000g于100mL锥形瓶，加入以pH3的磷酸缓冲液稀释的花色苷液75mL，恒温振荡(100r/min)24h，温度设置为20、25、30、35、40、45、50℃。分别在1、2、3、4、5、6、7、24h后吸取上清液2mL于510nm波长处测定吸光度，测后倒回锥形瓶。记吸附前花色苷液吸光度为A0，吸附后吸光度为A1，考虑到温度对吸光度的影响，以不加树脂的花色苷液为对照，记为A2。实际吸附率=(A2－A1)/A0，理论吸附率=(A0－A1)/A0。

1.3.4.3 乙醇体积分数对树脂解吸率的影响

准确称取已处理HP-20树脂4.000g(吸附量1.037mg/g)，分别加入不同体积分数的乙醇或酸化乙醇(含0.054%盐酸和0.1%柠檬酸)25mL，室温条件下振荡30min(100r/min)，过滤，浓缩至干，以25mL pH3的磷酸缓冲液溶解，稳定1h，510nm波长处比色。

1.3.4.4 洗脱剂pH值对树脂解吸率的影响

以90%乙醇为洗脱剂，以盐酸调洗脱液pH值为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0。准确称取已吸附HP-20树脂4.000g(吸附量1.037mg/g)，加25mL洗脱剂，室温条件下振荡30min(100r/min)，洗脱液真空浓缩至干，以25mL pH3的磷酸缓冲液溶解，稳定1h，510nm波长处比色。

1.3.5 HP-20树脂动态吸附-解吸条件研究

1.3.5.1 流速对HP-20树脂动态吸附性能的影响

准确称取80.000g树脂，用恒流泵控制不同的流速，使花色苷液上柱吸附，用自动部分收集器以10mL/管收集流出液。流出液在510nm波长处吸光度达到花色苷原液吸光度的10%时，记录泄漏点(V，mL)、处理时间(T，h)，计算吸附量(Qa，mg/g)。

1.3.5.2 花色苷液质量浓度对HP-20树脂动态吸附性能的影响

准确称取80.000g树脂，用恒流泵将流速控制在4.5BV/h，用不同质量浓度花色苷液上柱吸附，以10mL/管收集流出液。当流出液在510nm波长处吸光度达到花色苷原液吸光度的10%时，即认为达到泄漏点。

1.3.5.3 洗脱速度对解吸率的影响

准确称取80.000g树脂，花色苷液以6BV/h 的速度上柱吸附至饱和，用2BV蒸馏水冲洗树脂床，计算吸附量Qa。以10BV洗脱剂(90%乙醇含0.054%盐酸和0.1%柠檬酸)分别按2.0、3.0、4.5、6.0、7.5BV/h的流速洗脱，计算不同洗脱速度时的解吸率。

1.3.5.4 洗脱剂用量对解吸率的影响

准确称取80.000g树脂，花色苷液以6BV/h的速度上柱吸附至饱和，用2BV蒸馏水冲洗树脂床，计算吸附量Qa。以90%乙醇(含0.054%盐酸和0.1%柠檬酸)为洗脱剂，控制洗脱液流速为3BV/h，设定洗脱剂用量为4～14BV，计算不同洗脱剂用量下的解吸率。

1.3.6 HP-20动态吸附-解吸效果

HP-20树脂经预处理后湿法上柱。花色苷液采用pH3.0磷酸缓冲液稀释，测定质量浓度后以4.5BV/h流速上柱吸附。采用自动部分收集器收集流出液，当流出液吸光度与上样液相同时，树脂吸附达到饱和，停止进样。以2BV蒸馏水清洗树脂床，以8BV洗脱剂洗脱，洗脱速率为3BV/h，收集流出液，真空浓缩，测定510nm波长处吸光度，计算树脂饱和吸附量、解吸量及得率。

1.3.7 数据的处理

采用Excel 2003进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 静态吸附及解吸实验

2.1.1 各种树脂静态吸附率比较

如图1所示，实验所用6种树脂在1h内吸附速率较快，2h后逐渐趋于平缓。6种树脂中HP-20对西番莲表皮花色苷的吸附效果最好，其对西番莲果皮花色苷的吸附率(平衡后)相当于X-5的1.09倍，D101的1.12倍，AB-8、S-8、NKA-9对花色苷的吸附效果相对较差。

图 1 各种树脂静态吸附率比较

Fig.1 Statistic adsorption efficiency of the macroporous resins

2.1.2 花色苷液质量浓度对树脂静态吸附率的影响

图 2 花色苷液质量浓度对树脂吸附率的影响

Fig.2 Effect of sample concentration on the adsorption efficiency

由图2可知，随着花色苷液质量浓度增大，3种树脂吸附率均呈现下降趋势；在不同花色苷液质量浓度下HP-20均表现出比其他两种树脂更优的吸附能力。

2.1.3 几种树脂的解吸性能

表 2 各种树脂的解吸性能

Table 2 Desorption characteristics of the selected resins

从表2各种树脂总洗脱效果来看，HP-20树脂的解吸率明显高于X-5、D101两种树脂；从解吸液乙醇体积分数看，3种树脂的梯度洗脱峰均出现在乙醇体积分数为40%处，这一性质有利于避免糖、蛋白质等物质的残留，获得高纯度的花色苷[11-12]。

2.1.4 3种树脂对西番莲果皮花色苷静态吸附和解吸性能比较

表 3 3种大孔树脂对西番莲果皮花色苷静态吸附及解吸性能比较(n=3)

Table 3 Comparison of adsorption and desorption properties among the selected resins (n=3)

注：同列肩标不同字母表示差异显著，显著性水平α=0.05。

比较HP-20、X-5、D101这3种树脂的静态吸附-解吸性能发现，3种树脂中HP-20对西番莲果皮花色苷吸附效果最好，X-5对花色苷的解吸率最高，花色苷得率为HP-20最高。综合考虑吸附量、解吸率和花色苷得率，选择HP-20为西番莲果皮花色苷的纯化树脂。

2.2 HP-20树脂静态吸附及解吸条件

2.2.1 花色苷液pH值对HP-20树脂吸附率的影响

图 3 花色苷液pH值对HP-20树脂吸附率的影响

Fig.3 Effect of pH on the adsorption efficiency of HP-20

由图3可见，在pH1～4范围内，HP-20树脂对西番莲果皮花色苷的吸附率随pH值增大而明显上升，花色苷液pH4～5时，吸附率下降。考虑到花色苷的稳定性，应控制花色苷在pH4以下进行吸附。

2.2.2 温度对HP-20树脂吸附率的影响

图 4 HP-20在不同温度条件下的理论吸附率

Fig.4 Theoretical adsorption isotherms of HP-20 under different temperatures

图 5 HP-20在不同温度条件下的实际吸附率

Fig.5 Real adsorption isotherms of HP-20 under different temperatures

由图4、5可以看出，在吸附时间为1～7h时，40℃温度条件下的吸附效果最好，其次是45℃，20℃和25℃温度条件下的吸附效果较差，当吸附时间延长至24h时，在30、35、40、45、50℃条件下进行吸附的树脂均达到饱和，这说明适当提高温度有利于提高树脂对花色苷的吸附率。实验确定40℃为HP-20树脂吸附西番莲果皮花色苷的最佳温度。

2.2.3 乙醇体积分数对HP-20树脂解吸率的影响

图 6 乙醇体积分数对解吸率的影响

Fig.6 Effect of ethanol concentration on the desorption efficiency

由图6可知，随着乙醇体积分数的增大，解吸率增大，当乙醇体积分数大于70%后，解吸率开始逐渐下降。这是由于低体积分数的乙醇极性较大，难以渗透入HP-20树脂的空隙结构中，表现出较差的解吸率，而高体积分数乙醇对花色苷溶解性差，因此解吸效果也不佳。酸化乙醇对花色苷的解吸效果明显优于乙醇，体积分数为90%的酸化乙醇溶液对花色苷的解吸效果最好。这是因为加酸改善了花色苷的溶解性能[13-14]。

2.2.4 洗脱剂pH值对HP-20树脂解吸效果的影响

图 7 洗脱剂pH值对HP-20树脂解吸效果的影响

Fig.7 Effect of solvent pH on the desorption efficiency

确定洗脱剂为90%的乙醇溶液，考察洗脱剂pH值对解吸效果的影响。由图7可知，随着pH值的增大，西番莲花色苷的解吸率逐渐增大，pH3.5条件下取得最佳洗脱效果。

2.3 HP-20树脂动态吸附及解吸条件

2.3.1 流速对HP-20树脂动态吸附性能的影响

从图8可看出，上样液流速越大，流出液吸光度的上升越快，树脂对西番莲果皮花色苷的吸附量越小，泄漏点出现越早。这是因为流速过快时，花色苷分子无法和树脂充分接触，而直接随上样液的流动一起泄漏出去[15-17]。在实验条件下，3.0、4.5BV/h的流速吸附量最大，且泄漏点接近，6.0、7.5BV/h和9.0BV/h流速下树脂吸附量较小，泄漏点明显提前。考虑上样速度过慢影响吸附效率，因此确定西番莲果皮花色苷动态吸附的速率为4.5BV/h。

图 8 上样流速对HP-20树脂动态吸附性能的影响

Fig.8 Effect of loading flow rate on the adsorption efficiency

2.3.2 花色苷液质量浓度对HP-20树脂动态吸附性能的影响

表 4 花色苷液质量浓度对HP-20树脂动态吸附性能的影响

Table 4 Effect of sample concentration on dynamic adsorption

由表4可知，花色苷液质量浓度过低时，吸附时间长，且质量浓度过低造成吸附动力小，吸附量低[18-21]；浓度过高时，泄漏点提前，吸附量减少。在4.5BV/h的流速下，上样液质量浓度为18.176μg/mL时，吸附量最大，且处理时间较适宜。

2.3.3 洗脱速度对解吸率的影响

图 9 洗脱速度对解吸率的影响

Fig.9 Effect of desorption flow rate on the desorption efficiency

从图9可以看出，洗脱速度越快，花色苷的解吸率越低，这是因为洗脱速度过快时，洗脱剂来不及与树脂充分接触，就直接流出吸附柱。在2BV/h和3BV/h的洗脱速度下，花色苷的解吸率均能达到90%，且两者差异不大。从提高效率的角度出发，可以选择3BV/h的洗脱速度。

2.3.4 洗脱剂用量对解吸率的影响

图 10 洗脱剂用量对解吸率的影响

Fig.10 Effect of eluent amount on the desorption efficiency

由图10可知，随着洗脱剂用量的增大，树脂的解吸率先增大后基本保持不变。6BV的用量能获得与14BV用量相接近的解吸率，故确定洗脱剂用量为6BV。

2.3.5 HP-20树脂动态吸附-解吸效果

研究HP-20树脂对西番莲果皮花色苷动态吸附-解吸效果，结果如表5所示。HP-20树脂对西番莲果皮花色苷的动态饱和吸附量为1.371mg/g，用8BV洗脱剂以3BV/h洗脱速率洗脱树脂，得到西番莲果皮花色苷1.150mg/g，得率为83.94%。

表 5 HP-20树脂动态饱和吸附量和解吸量

Table 5 The saturated amounts of dynamic adsorption and desorption of HP-20

3 结 论

3.1 在实验的6种大孔树脂中，HP-20对西番莲果皮花色苷表现出最优的吸附-解吸性能，其对西番莲果皮花色苷的吸附率(平衡后)相当于X-5的1.09倍，D101的1.12倍，AB-8、S-8、NKA-9对花色苷的吸附效果相对较差。对HP-20、X-5、D101这3种树脂的吸附-解吸性能测试结果得到，3种树脂纯化西番莲果皮花色苷的得率为HP-20＞X-5＞D101。

3.2 HP-20纯化西番莲果皮花色苷静态吸附-解吸最佳条件为：上样液pH4.0、温度40℃、洗脱剂为pH3.5的90%乙醇溶液。

3.3 HP-20用于纯化西番莲果皮花色苷，其最适的动态吸附-解吸工艺条件为：上样液流速4.5BV/h、上样液质量浓度18.176μg/mL、洗脱剂用量6BV、洗脱流速3BV/h。

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