北五味子叶总黄酮的提取及生物活性

许瑞波,万蓓蓓,高颖颖,章 蕊,周洪英

(淮海工学院化工学院,江苏 连云港 222005)

 

要:以北五味子叶为原料,用单因素试验考察提取温度、乙醇体积分数、料液比、提取时间及提取次数对北五味子叶总黄酮(FSL)提取率的影响。在单因素试验的基础上,通过正交试验设计优化FSL提取的工艺条件,确定最佳提取工艺参数。结果表明:最佳工艺条件为提取温度85℃、乙醇体积分数60%、料液比1:45(g/mL)、提取时间3.5h、提取2次。在此条件下,FSL提取率为9.03%。用聚酰胺树脂初步提纯,经红外光谱表征,证明其具备黄酮类化合物的基本光谱特征。此外,利用琼脂扩散抑菌法研究了FSL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用;并利用邻苯三酚法和DPPH法研究了FSL的抗氧化活性。结果表明,PSL具有良好的抑菌作用,对超氧阴离子自由基和DPPH自由基具有一定的清除能力。

关键词:北五味子叶;黄酮类化合物;提取;抑菌作用;抗氧化活性

 

Extraction and Bioactivities of Total Flavonoids from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill Leaves

 

XU Rui-bo,WAN Bei-bei,GAO Ying-ying,ZHANG Rui,ZHOU Hong-ying

(School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

 

Abstract:The effect of extraction temperature, ethanol concentration, solid/solvent ratio, extraction time and number of extraction cycles on the yield of total flavonoids from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill leaves (FSL) was studied by single factor designs. Based on the results obtained, an orthogonal array design was proposed to optimize the extraction process. The optimal extraction process was obtained by two cycles of extraction with 60% ethanol at a solid/solvent ratio of 1:45 (g/mL) for 3.5 h at 85 ℃, resulting in an FSL yield of 9.03%. Primary purification of FSL was performed using polyamide resin, and infrared spectroscopic studies demonstrated that the purified products possessed spectral characteristics of flavonoids. The purified FSL had strong inhibitory effects against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus subtilis as determined by agar diffusion method, and showed free radical scavenging activity against superoxide anion and DPPH radicals.

Key wordsSchisandra chinensis (Turcz.) Baill leaves;flavonoids;extraction;antibacterial effect;antioxidant activity

中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0072-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320014

五味子又名五梅子、山花椒等,产于中国、韩国、日本和俄罗斯远东等地[1-2],为木兰科多年生落叶藤本植物五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill,即北五味子)及华中五味子(Schisandra sphenanthera Rehd. Et Wils.,即南五味子)干燥成熟果实,是药食同源的功能性保健食品[3-7]。五味子被誉为植物软黄金,以北五味子为上品[8]。北五味子全身都是宝,其果实可入药,也可做饮料、果酒、果茶;其茎皮、花蕾可作调料、香料;其嫩茎、叶可食用或制茶[9]。由于北五味子需求量大,野生资源不能满足市场需求,而且由于人为因素造成北五味子野生资源濒临枯竭,因此,北五味子的人工栽培技术已经在东北多个地区得到了推广。

文献调研发现五味子叶中含有黄酮类化合物、蛋白质、多糖、木脂素、挥发油等活性成分[10-12]。目前,关于五味子果实的化学成分及开发利用的研究报道很多[1,13-15],而关于五味子叶的研究较少[3,8,10-12]。因此,有必要对五味子叶这一丰富资源进行深入研究,变废为宝,同时,为寻找天然、无毒和安全的食品、药品添加剂的来源拓宽选择的范围。

北五味子在栽培过程中,要修枝剪叶,而且秋季叶片自然凋落,这些富含活性成分的叶片被作为废弃物扔掉,不仅造成新的环境污染,而且造成资源浪费。五味子叶中含有丰富的黄酮类化合物,而且该类化合物具有清除自由基、抑制自由基的生成、抗菌和抗癌等生物活性,在药品、食品添加剂等领域的应用越来越吸引人们的关注[16-19]。因此,本实验以吉林省白山地区人工种植的北五味子叶为原料,通过单因素和正交试验考察其总黄酮(flavonoids from Schisandra chinensis(Turcz.) Baill leaf,FSL)的提取工艺,并进一步研究其对超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用,为充分开发利用北五味子资源提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北五味子叶(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill leaf):2010年8月初采自吉林省白山市抚松县种植地。阴干后置于50℃烘箱中干燥至质量恒定后粉碎,制成北五味子叶粉。用石油醚按照1:30(g/mL)料液比50℃加热回流处理2h后过滤,滤渣置于50℃烘箱中干燥2h制成原料粉,保存于磨口瓶中,置于干燥避光处,备用。

所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFJ 7200型可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;RE-5285A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;UV-Vis2550型紫外分光光度计 日本岛津公司;NEXUS-870型傅里叶红外光谱仪 美国Nicolet公司;B-220恒温水浴锅 浙江舟山市海源仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 北五味子叶黄酮提取的单因素及正交试验

称取适量原料粉,以乙醇为提取剂,按一定料液比(g/mL)在某温度条件下提取一定时间,离心、真空抽滤,收集滤液;相同条件下,将滤渣进行再1次(不同提取次数)提取,合并滤液,即得FSL提取液。以FSL提取率为考察指标,首先通过单因素试验考察提取温度、乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数对FSL提取率的影响,初步确定适宜于提取FSL的相应水平范围。然后在单因素试验的基础上,选用标准的L9(34)正交试验表进行正交试验设计,从而优化提取FSL的工艺条件。

1.3.2 黄酮含量测定及提取率的计算

采用简便易行的紫外分光光度法测量提取液中黄酮含量。精密称取质量恒定的10.2mg芦丁标准品,用体积分数70%乙醇溶解后定容于100mL容量瓶中,即得到质量浓度0.0102g/100mL的芦丁标准品溶液。避光保存备用。精确量取标准品溶液0、1、2、3、4、5mL分别置于10mL具塞试管中,用体积分数70%乙醇定容至刻度,摇匀静置10min,由预实验得出芦丁标准品与FSL提取液的最大吸收波长出现在268nm,因此在268nm波长处进行紫外吸光度测定。以体积分数70%乙醇为空白对照,以吸光度A为纵坐标,标准液质量浓度ρ(g/100mL)为横坐标,回归方程为:A=32.375ρ-0.0032,r=0.9998,在0.00102~0.00510g/100mL范围内呈良好的线性关系。

将1.3.1节中所得的FSL提取液移入100mL容量瓶,用相应体积分数的乙醇定容至刻度,摇匀。然后,准确移取1mL该提取液置于25mL具塞试管并定容,摇匀,即得稀释25倍的FSL待测液。按照标准曲线制备的方法,测定待测液在268nm波长处的吸光度A,根据式(1)计算出FSL的提取率:

414191.jpg (1)

式中:V为FSL总体积,即100mL;ρ为黄酮质量浓度/(g/100mL);m为原料质量(1g);n为稀释倍数7,此为25。

1.3.3 北五味子叶黄酮的初步纯化

将FSL提取液经旋转蒸发仪浓缩后,加入到盛有聚酰胺树脂的烧杯中,吸附一段时间后,过滤。用水冲洗吸附有黄酮的树脂,然后再加入体积分数95%乙醇解吸,抽滤,滤液倒入小烧杯,并置于70℃水浴锅挥发至膏状,密封保存。

1.3.4 北五味子叶黄酮的红外光谱表征

用红外光谱法对FSL进行初步鉴定。采用KBr压片法:先研磨好KBr,压片。然后,将FSL膏状样品用少量乙醇溶解后,直接涂在压好的KBr晶片上,待乙醇挥发完后,测量其在4000~600cm-1波数范围内的谱图。

1.3.5 FSL的抗氧化活性研究

1.3.5.1 对DPPH自由基的清除作用

采用DPPH法[20]测定FSL对DPPH自由基的清除作用,以VC为标准对照物。在10mL具塞试管中加入2mL 0.1g/100mL DPPH乙醇溶液,分别加入样品液或VC溶液(质量浓度0.1g/100mL)0、10、20、50、100、200、400、800、1000μL,用蒸馏水定容至5mL,摇匀。置于37℃水浴锅中,避光反应20min后立即测定524nm波长处吸光度A。以体积分数50%乙醇为参比,空白对照以体积分数50%乙醇代替样品。按式(2)计算FSL及VC对DPPH自由基的清除率:

414184.jpg (2)

式中:A0为空白对照吸光度;Ai为加样品液后的吸光度;Aj为样品液本底吸光度。

1.3.5.2 对超氧阴离子自由基(O2¯)的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法[21-22]研究FSL对O2-的清除作用,以VC为标准对照物。在10mL具塞试管中,加入0.05mol/L pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL,再加入2mL不同质量浓度的样品液或VC溶液。摇匀后在25℃水浴锅中预热20min,再加入经25℃水浴锅预热的邻苯三酚-盐酸溶液(0.003mol/L)1mL,混匀后,于25℃水浴中反应4min,时间要准确。最后加入1mL 0.01mol/L的HCl溶液终止反应。以Tris-HCl缓冲液为参比,空白对照以蒸馏水代替样品。测定325nm波长处的吸光度A,按式(3)计算FSL及VC对O2-的清除率。

414176.jpg (3)

式中:A0为空白对照吸光度;Ai为加样品溶液后的吸光度;Aj为样品溶液本底吸光度。

1.3.6 FSL的抑菌活性

称取34g营养琼脂,加1L蒸馏水,溶解后置于高压灭菌锅内,120℃灭菌30min。冷却至50~60℃制成平板,取0.1mL活化菌液,在平板上涂抹均匀,以等距离均匀、垂直放置5个牛津杯。在牛津杯中加入0.1mL样品液,盖好平皿,置于37℃生化培养箱中培养24h[23]。取出后,测量每个牛津杯周围所产生的透明抑菌圈直径(mm)。所有待测液均平行测试3次,以平均值作为最后的实验结果。

1.3.7 数据统计

数据用平均值±标准偏差表示,采用t检验方法进行分析。当P≤0.05时,有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 提取北五味子叶黄酮的单因素试验

2.1.1 提取温度对北五味子叶黄酮提取率的影响

432173.jpg 

提取液用量为每克原料粉所需提取液体积。提取时间、提取次数对提取率的影响以右侧提取率为参考,其他因素以左侧提取率为参考。

图 1 单因素试验结果

Fig.1 Results of single factor designs

准确称取1g原料粉,用体积分数70%乙醇提取,在料液比1:30(g/mL)、提取时间3h、提取1次条件下,考察提取温度(50、60、70、80、90℃)对FSL提取率的影响,结果见图1。可以看出:随着温度的升高,从北五味子叶中提取出的黄酮增多,当温度在80℃附近时,提取率最高;超过80℃时黄酮提取率又略有下降,故提取北五味子叶中黄酮的适宜温度在80℃左右。

2.1.2 乙醇体积分数对北五味子叶黄酮提取率的影响

设定提取温度80℃,其他条件同2.1.1节。从图1可知,乙醇体积分数的增加,FSL的提取率不断减小。当乙醇体积分数为50%和60%时,提取率相差不大,60%乙醇作提取剂时抽滤很容易进行,而50%乙醇的则很难过滤,因此,最佳乙醇体积分数选60%。

2.1.3 料液比对北五味子叶黄酮提取率的影响

设定乙醇体积分数60%,其他条件同2.1.2节,由图1可知,随着提取液使用量的增大,FSL提取率不断增大,在实验选择的水平范围内,料液比1:45(g/mL)有益于从北五味子叶中提取黄酮类化合物。

2.1.4 提取时间对北五味子叶黄酮提取率的影响

设定料液比1:45(g/mL),其他条件同2.1.3节,由图1可知,随着提取时间的延长,北五味子叶黄酮的提取率也逐渐提高,当提取超过4h时,FSL提取率增加幅度很小。由于高温条件下长时间提取可能会造成黄酮类化合物性质的改变,因此,提取时间选择为4h。

2.1.5 提取次数对北五味子叶黄酮提取率的影响

设定提取时间4h,其他条件同2.1.4节,由图1可知,随着提取次数的增加,黄酮的提取率先增加,后下降。提取2次时,提取率最高。当提取3次时,提取率又略有减小。故选择提取次数为2次。

2.2 提取北五味子叶黄酮的正交试验

为了确定从北五味子叶中提取黄酮的最佳工艺参数,根据单因素试验的结果,固定提取次数为2次,选择提取温度、提取时间、乙醇体积分数和料液比为试验因素,采用L9(34)正交表对北五味子叶黄酮的提取工艺条件进行优化,其因素水平、结果与分析见表1,方差分析结果见表2。

表 1 L9(34)正交试验设计及结果

Table 1 Orthogonal array design and results

试验号

A提取

温度/℃

B提取

时间/h

C乙醇体积

分数/%

D料液比

(g/mL)

FSL提取

率/%

1

1(75)

1(3.0)

1(50)

1(1:35)

8.18

2

1

2(3.5)

2(60)

2(1:45)

8.58

3

1

3(4.0)

3(70)

3(1:55)

7.55

4

2(80)

1

2

3

8.87

5

2

2

3

1

7.80

6

2

3

1

2

9.07

7

3(85)

1

3

2

7.92

8

3

2

1

3

9.11

9

3

3

2

1

8.84

k1

8.103

8.323

8.787

8.273

 

k2

8.580

8.497

8.763

8.523

 

k3

8.623

8.487

7.757

8.510

 

R

0.520

0.174

1.030

0.250

 

 

 

由表2可知,在试验研究范围内,提取温度、提取时间、乙醇体积分数和料液比对北五味子叶中黄酮的提取率都有不同程度的影响,其中乙醇体积分数对FSL的提取率有显著性影响,各因素对提取率影响的主次顺序为CADB,与表1直观分析结果一致。故提取FSL的最适宜工艺参数为A3B2C1D2,即乙醇体积分数50%、料液比1:45(g/mL),在85℃提取3.5h,共提取2次。在最适宜的工艺条件下进行从北五味子叶中提取黄酮的验证实验,共做3组平行实验,提取率分别是9.42%、9.21%、9.34%,平均提取率为9.32%。说明该工艺比较稳定,重复性好。

表 2 方差分析表

Table 2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

方差来源

偏差平方和

自由度

F

F临界值(α=0.05)

显著性

A

0.499

2

8.754

19.000

 

B

0.057

2

1.000

19.000

 

C

2.075

2

36.404

19.000

*

D

0.119

2

2.088

19.000

 

误差

0.06

2

 

 

 

 

 

由于乙醇体积分数为50%时,固液分离很困难。在乙醇体积分数的单因素试验中,发现乙醇体积分数为50%和60%时,FSL的提取率相差不大,而且60%时固液分离很容易,因此,考察其他因素保持最佳水平条件,而仅改变乙醇体积分数为60%的情况下,进行FSL的提取实验,结果发现该条件下FSL的提取率为9.03%。虽然略低于乙醇体积分数为50%时的提取率,但是综合考虑提取操作过程的固液分离的难易程度,选择提取北五味子叶中黄酮的最佳工艺条件是:乙醇体积分数60%、料液比1:45(g/mL)、在85℃提取3.5h、共提取2次。

2.3 FSL的红外光谱表征

414135.jpg 

图 2 纯化FSL的红外光谱图

Fig.2 IR spectrum of purified FSL

由图2可知,北五味子叶黄酮具有一般黄酮类化合物的特征吸收峰(3475、3414、2924、2852、1638、1618、1576、1417、1177、1127、1109、637、618cm-1)。其中,3475cm-1和3442cm-1附近的强宽谱带是缔合羟基的伸缩振动引起的,说明FSL中含有较多的羟基;2924cm-1和2825cm-1处较弱的峰是-CH2中C-H伸缩振动产生的;1638cm-1附近的中强吸收峰为羰基C-O伸缩振动引起的,1618cm-1和1576cm-1附近的峰是苯环骨架振动[24];1417cm-1是酚羟基的振动峰[25],637cm-1是O-H面外弯曲振动峰;1177cm-1附近的峰是酚羟基C-O伸缩振动引起的;1127cm-1和1109cm-1附近的强峰是醚键C-O-C的伸缩振动[24-25]。综上分析可知,本实验提取的FSL是具有
2-苯基色原酮母核的黄酮类化合物,而且含有多个羟基。

2.4 FSL抗氧化活性

2.4.1 对DPPH自由基的清除作用

414128.jpg 

图 3 FSL、VC对DPPH自由基的清除能力

Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of FSL and VC

从图3可以看出,随着FSL、VC用量的增加,清除DPPH自由基的能力也增大。通过计算可知VC与FSL清除DPPH自由基的IC50分别是0.0004g/100mL和0.0042g/100mL,说明FSL对DPPH自由基的清除能力约为VC的1/10,虽然不如VC的效果好,但是也具有很强的清除DPPH自由基能力,具有开发利用的价值。

2.4.2 O2的清除作用

414121.jpg 

图 4 FSL、VC对O2-的清除能力

Fig.4 Superoxide anion radical scavenging capacity of FSL and VC

从图4可以看出,随着VC质量浓度的增加,清除O2-能力也增强。通过计算可知VC清除O2-的IC50为0.007g/100mL。对于FSL而言,随着FSL质量浓度的增加,清除O2-能力先不断增强,当质量浓度为0.038g/100mL时,对O2-的清除率达到最高值,仅为36.72%;再升高质量浓度,清除率降低。说明从北五味子叶中提取出来的黄酮对O2-具有一定的清除能力,但清除率远低于VC。

2.5 FSL的抑菌活性

表 3 FSL对3种细菌的抑制作用

Table 3 Inhibitory effects of FSL against three bacterial strains

FSL质量浓度/

(g/100mL)

抑菌圈直径/mm

金黄色葡萄球菌

Staphyloccus aureus

大肠杆菌

Escherichia coli

枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis

1.00

19.2±2.13

18.2±0.98

19.1±2.47

0.50

18.3±0.97

15.3±1.65

17.5±2.05

0.25

14.2±1.03

14.1±2.12

15.2±0.76

0.125

9.3±1.25

10.3±1.78

13.4±1.88

0.0625

8.2±0.47

9.7±1.07

13.0±1.96

 

 

不同质量浓度的FSL的抑菌实验结果见表3。由于牛津杯外径是7.8mm,所以抑菌圈直径大于该数值,表明样品有抑菌活性,抑菌圈直径越大,抑菌作用越强。从表3可以看出:FSL对3种受试菌株均具有良好的抑制作用,而且质量浓度越高,抑菌效果越好,尤其是对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,即使在低质量浓度下也有良好的抑制活性。

3 结 论

3.1 通过单因素和正交试验设计优化了从北五味子叶中提取黄酮的工艺条件,结果表明乙醇体积分数对FSL提取率具有显著性影响,并最终确定提取FSL的最适宜工艺条件是:乙醇体积分数60%、料液比1:45(g/mL)、提取温度85℃、提取时间3.5h、提取2次,提取率为9.03%。

3.2 用聚酰胺树脂对粗提物FSL进行初步提纯,然后采用红外光谱对其进行表征,谱图中具有苯环、羰基、羟基、醚键等黄酮母核2-苯基色原酮骨架的特征吸收峰,说明提取、纯化的产物为黄酮类化合物,而且其含有多个羟基。

3.3 以VC为标准对照品,研究了FSL的体外抗氧化能力,结果表明,FSL对DPPH自由基和O2-具有一定的清除能力,而且对DPPH自由基的清除效果明显优于对O2-的清除效果。虽然抗氧化效果不如VC,但是对DPPH自由基的清除能力约为VC的1/10,具有开发利用价值。

3.4 采用琼脂扩散抑菌法研究了FSL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用,发现FSL对3种受试菌株具有广谱抑菌作用,而且样品质量浓度越高,抑菌活性越强,尤其对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强。

3.5 北五味子的栽培技术在东北多个地区已经推广,其叶子被作为废物丢弃。本实验结果证明北五味子叶所含的黄酮类化合物不仅具有良好的抗氧化能力,而且表现出很好的抑菌作用,因此,北五味子叶是一种值得开发的富含活性成分的天然资源。

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收稿日期:2012-07-03

基金项目:江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放基金课题(2009HS06);连云港市科技攻关计划项目(CG1132);

淮海工学院博士科研启动项目(KQ10130)

作者简介:许瑞波(1972—),女,副教授,博士,研究方向为天然产物提取及配位化学。E-mail:xuruibo9125@163.com