石蒜加兰他敏及石蒜碱的超声波提取工艺

王 鹏，田春莲*，刘小攀

(吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

摘 要：研究超声波法提取石蒜中石蒜碱及加兰他敏的工艺条件，采用高效液相色谱(HPLC)同时检测两种物质。以石蒜碱和加兰他敏得率为指标，通过单因素试验分别考察浸提时间、浸提温度、超声作用时间和料液比对石蒜碱及加兰他敏得率的影响；并用正交试验得出最佳工艺。结果表明：由方差分析得到各因素的显著性依次是浸提时间＞超声波作用时间＞浸提温度；正交试验得出的最佳工艺条件为料液比1:10(g/mL)，在70℃条件下浸提2.5h，然后在超波功率500W条件下提取30min，提取2次，石蒜碱和加兰他敏得率最高，分别达0.1561%、0.0253%。

关键词：石蒜；石蒜碱；加兰他敏；超声处理

Ultrasonic Extraction of Lycorine and Galanthamine from Red Spider Lily Bulb (Lycoris radiate)

WANG Peng，TIAN Chun-lian*，LIU Xiao-pan

(Hunan Province Key Laboratory of Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)

Abstract：Optimal conditions for the ultrasonic extraction of lycorine and galanthamine from red spider lily bulb were established in this study. The compounds were determined simultaneously by HPLC. The effects of extraction time, temperature, ultrasonic treatment time and material-to-solvent ratio on extraction efficiency were investigated. Analysis of variance showed that three extraction parameters in the decreasing order of importance were extraction time, ultrasonic radiation time and temperature. An extraction temperature of 70 ℃ and 2.5 h extraction followed by 30 min ultrasonic treatment repeated in sequence twice proved optimal, which provided maximum yields of lycorine and galanthamine, 0.1561% and 0.0253%, respectively.

Key words：red spider lily；lycorine；galanthamine；ultrasonic treatment

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0077-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320015

石蒜(Lycoris radiate.Herb)是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)的多年生草本植物，主要分布在亚洲，我国有17种，在我国湖南、湖北、江苏、浙江、福建等省均有分布[1-2]。石蒜属植物具有较高的观赏价值，被誉为“中国郁金香”[3]，石蒜鳞茎富含淀粉，如将其磨碎后用大量水淘洗，脱毒后食用，味如糯米粉，《救荒本草》中记载，可将其炒熟，水浸过食[4]。石蒜性味辛、甘、温，具有消肿、杀虫的作用，其所含丰富的生物碱也得到广泛应用，尤其是加兰他敏，随着人口老龄化的严重加剧，阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)造成的疾病负担日益增加，而石蒜鳞茎中的加兰他敏因毒副作用小、疗效显著[5-7]，是目前被美国FDA认可的抗AD药物之一，国内外需求量巨大；其次，它还可用于闭角型青光眼、术后肠肌麻痹、脊髓灰质炎引起的瘫痪、重症肌无力的治疗[8-9]。石蒜中的石蒜碱是临床用于小儿麻痹后遗症治疗的传统药物，近来研究证明，石蒜碱具有抗炎、抗病毒、抗疟疾、保护心血管等功效，尤其能诱导肿瘤细胞的凋亡等多种作用[10]。石蒜是加兰他敏和石蒜碱两种原料药的植物来源之一[11]，但含量低，其提取通常采用溶剂的抽提方法[12]，提取较为耗时，并且资源浪费、环境污染严重，超声波提取法利用空化和机械振动作用瞬间使细胞壁结构破裂，具有提取时间短、溶剂用量少、提取率高、成本低、对目标化合物破坏小等优点[13-16]，但目前只有对石蒜中石蒜碱或加兰他敏单一物质的超声波提取的报道[17-18]，未见用超声波法同时提取两种物质的报道，因此研究了采用超声波提取法对石蒜中加兰他敏及石蒜碱进行提取，探讨了提取率较高且经济环保的提取技术，提高了石蒜生物碱的综合利用，对经济价值和社会效益均具有较重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石蒜于2012年3月采自湖南省怀化市沅陵县官庄。

加兰他敏标准品(纯度＞98%) 中国食品药品检定研究院；石蒜碱标准品(纯度＞98%) 上海金穗生物科技有限公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯) 美国Tedia公司；浓硫酸、磷酸二氢钾、三乙胺均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；数显水浴锅 金坛富华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-磷酸缓冲液(17:83，V/V)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm。磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定容至1L，其pH值为7.02。

1.3.2 标准曲线的制备

分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1.0mg/mL的加兰他敏及1.0mg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中，配成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/mL的混合标准溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定，得回归方程。

1.3.3 石蒜碱及加兰他敏的提取

称取石蒜粉末2.0g，加入硫酸水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，然后再超声作用一定时间，5000r/min离心20min，取上清液。采用色谱测定，计算石蒜碱及加兰他敏得率(y，%)。

式中：ρ为加兰他敏或石蒜碱的质量浓度/(mg/mL)；V为提取液定容体积/mL；m0为石蒜粉末的质量/mg。

1.3.4 提取工艺优化

1.3.4.1 单因素试验

按1.3.3节方法，分别考察不同提取剂、硫酸质量分数、浸提时间、浸提温度、超声波作用时间和料液比对石蒜碱和加兰他敏得率的影响，确定各个单因素的最佳水平。

1.3.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选取浸提时间(A)、浸提温度(B)、超声作用时间(C)3项考察因素，每个因素选取3个水平，以加兰他敏及石蒜碱得率为考察指标，采用L9(34) 正交表进行试验。

2 结果与分析

2.1 石蒜碱及加兰他敏的检测

图 1 石蒜碱、加兰他敏标准品(A)及样品(B)HPLC图谱

Fig.1 HPLC chromatograms of lycorine and galanthamine standards and samples

以1.3.1节所示色谱条件进行检测，如图1所示，石蒜碱的出峰时间约在7.9min，加兰他敏的出峰时间约在10.1min。以标准品的含量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。石蒜碱的回归方程为：Y=16212X＋5.5084，r=0.9999，加兰他敏的回归方程为：Y=8968.6X＋4.5795，r=0.9999。

取同一个试样，在上述色谱条件下，连续进样6次，经计算加兰他敏及石蒜碱峰面积的相对标准差(RSD)分别为1.35%和1.32%。取同一个试样，在上述色谱条件下，每隔2h进样1次，共进样6次，经计算加兰他敏及石蒜碱峰面积的相对标准差(RSD)分别为1.66%和1.88%，这说明该检测方法精密度良好，方法稳定可靠。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取溶剂的筛选

图 2 不同提取剂对得率的影响

Fig.2 Effect of extraction solvents on extraction efficiency

以水、甲醇、乙醇、氯仿为提取剂在料液比1:10，60℃浸提2.5h，然后在500W条件下超声30min，过滤，HPLC检测。考察提取剂对石蒜碱及加兰他敏得率的影响，结果见图2。

图2显示，各提取剂对石蒜碱及加兰他敏提取效果均为水＞甲醇＞乙醇＞氯仿，随提取剂极性的降低，石蒜碱及加兰他敏的得率均降低，因为石蒜碱及加兰他敏均为极性物质，故确定水为提取溶剂。

2.2.2 硫酸质量分数的影响

按料液比1:10分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%硫酸溶液，60℃浸提2.5h，然后500W超声30min，过滤，HPLC检测。考察硫酸质量分数对石蒜碱及加兰他敏得率的影响，结果见图3。

图 3 硫酸质量分数对得率的影响

Fig.3 Effect of sulfuric acid concentration on extraction efficiency

由图3可知，在0～0.5%范围内石蒜碱及加兰他敏的得率随着硫酸质量分数的升高均提高，但硫酸质量分数超过0.5%后得率均随硫酸质量分数的升高而降低，这是由于石蒜碱及加兰他敏均为弱碱性物质，随硫酸质量分数的升高会提高这两种物质在提取剂中的溶解度，进而促进提取的进行，但质量分数过高时这两种物质会与酸发生反应，从而影响他们的得率。

2.2.3 浸提时间的影响

按料液比1:10加入0.5%硫酸溶液，60℃条件下分别浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，然后500W超声30min，过滤，HPLC检测。考察浸提时间对石蒜碱及加兰他敏得率的影响，结果见图4。

图 4 浸提时间对得率的影响

Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency

图4表明，提取时间在1～2.5h，石蒜碱及加兰他敏得率随提取时间的延长而增加，超过2.5h后两种物质得率随时间的延长呈下降趋势。原因是浸提的前段时间，随时间的延长石蒜粉末得到充分的浸泡有利于物质扩散，但时间过长可能会发生降解而造成损失[19]。浸提时间为2.5h时提取效果最佳。

2.2.4 超声时间的影响

按料液比1:10加入0.5%硫酸溶液，60℃浸提2.5h，然后500W分别超声10、20、30、40、50min，过滤，HPLC检测，结果见图5。

图 5 超声时间对得率的影响

Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on extraction efficiency

由图5得出，石蒜碱及加兰他敏得率均随超声波处理时间的延长而增加，超声处理30min，得率达最大值，随后急剧下降，可能由于超声波会使植物的细胞壁破裂从而减小提取阻力，但当超声波处理时间过长会对石蒜碱及加兰他敏的结构造成破坏，从而得率降低[18]。超声波处理时间应在30min时提取效果最佳。

2.2.5 料液比的影响

分别按料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25加入0.5%硫酸溶液，60℃浸提2.5h，然后在500W超声30min，过滤，HPLC检测。结果见图6。

图 6 料液比对得率的影响

Fig.6 Effect of material-to-solvent ratio on extraction efficiency

图6显示，石蒜碱及加兰他敏得率随提取液用量增加而上升，当料液比为1:10时，石蒜碱得率最大，1:15时加兰他敏得率最大，虽然加兰他敏在料液比1:15时比1:10时得率高，但从图中可看出差别较小，考虑到节约试剂及后续浓缩工作的方便选择料液比为1:10进行提取。

2.2.6 浸提温度的影响

按料液比1:10加入0.5%硫酸溶液，分别在40、50、60、70、80℃浸提2.5h，然后再500W超声30min，过滤，HPLC检测。结果见图7。

图 7 浸提温度对得率的影响

Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由图7可知，石蒜碱及加兰他敏得率均随着浸提温度的升高而增加，60℃后逐渐降低。因为提取温度升高会加快溶液的扩散速率，温度超过一定范围后会对石蒜碱及加兰他敏造成破坏。所以浸提温度确定为60℃。

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，选取浸提时间、浸提温度、超声波处理时间为考察因素，进行正交试验。结果及方差分析见表1、2。

表 1 正交试验设计与结果

Table 1 Orthogonal array design and results

通过表1直观分析，可以看出石蒜碱提取最佳工艺组合为A2B1C2，加兰他敏提取最佳工艺组合为A2B3C2，对于因素B石蒜碱在50℃时得率最高，70℃次之，加兰他敏在70℃时得率最高，60℃次之，综合考虑选择70℃进行提取。根据方差分析(表2)，浸提时间对加兰他敏的得率的影响极显著(P＜0.01)，对石蒜碱得率的影响显著(P＜0.05)；超声波处理时间对石蒜碱及加兰他敏提取效果影响显著(P＜0.05)；浸提温度对加兰他敏得率影响较显著，对石蒜碱得率影响不显著。影响石蒜碱及加兰他敏得率的各因素主次顺序均为浸提时间＞超声波处理时间＞浸提温度。因此，超声波法提取的最优工艺参数为A2B3C2，即浸提时间2.5h、浸提温度70℃、超声波处理时间30min。在此最优工艺条件下进行多次提取，至第3次时已检测不出这两种物质，提取2次石蒜碱得率为0.1561%，加兰他敏得率为0.0253%。

表 2 正交试验方差分析表

Table 2 Analysis of variance for the experimental results of

orthogonal array design

3 结 论

建立了HPLC法同时检测石蒜碱及加兰他敏的方法，探索了浸提时间、浸提温度、超声波处理时间、液料比对石蒜中石蒜碱及加兰他敏提取得率的影响，经单因素及正交试验，最后验证得出超声波法同时提取石蒜中石蒜碱及加兰他敏的最佳工艺优化为浸提时间2.5h、浸提温度70℃、超声波处理时间30min、料液比1:10，在此工艺条件下提取2次，石蒜碱得率为0.1561%，加兰他敏得率为0.0253%，本研究同时对石蒜碱及加兰他敏进行提取，提高了植物的利用率，采用的提取剂为水，这使得提取过程极大的节约了资源并减少了对环境的破坏。由于超声波空化效应破坏了植物的细胞壁，减小了提取时的阻力而使提取得率得到提高[20]，与传统的溶剂提取法相比，超声波提取法节约时间，操作简单，并较大程度地提高了得率。但是目前只进行了提取方面的研究，还有待于进一步进行纯化方面的研究。

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