响应曲面法优化辣椒油树脂分离条件及分离产物的抗氧化活性测定

陶 红1，蒋 林1,*，郑锡康1，钟文俊1，胡继藤1，王晓娟1，杜 卓2，陈金龙1

(1.中山大学药学院生药与天然药物化学实验室，广东 广州 510006；

2.佛山科学技术学院医学院药学系，广东 佛山 528000)

摘 要：采用分子蒸馏技术对辣椒油树脂进行分离纯化，考察蒸馏温度、蒸馏压力、刮膜转数对辣椒碱类物质和辣椒红色素分离的影响。应用响应面法对其工艺参数进行优化，通过Box-Behnken试验设计，研究各因素及其交互作用对响应值的影响，建立了二次多项回归方程的预测模型，确定了最佳的纯化工艺条件为蒸馏温度144℃、蒸馏压力9.5Pa、刮膜转数313r/min。在此条件下，辣椒碱类物质的含量为75.30%，辣椒红色素的色价为19.84。同时，通过清除DPPH自由基抗氧化活性实验测定分离得到的辣椒碱类物质具有良好的抗氧化活性。

关键词：辣椒碱；分子蒸馏；响应曲面法；抗氧化活性

Optimization of Molecular Distillation Separation Conditions for Capsicum Oleoresin by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity of Its Separated Components

TAO Hong1，JIANG Lin1,*，ZHENG Xi-kang1，ZHONG Wen-jun1，HU Ji-teng1，WANG Xiao-juan1，DU Zhuo2，CHEN Jin-long1

(1. Laboratary of Pharmacognosy and Natural Medicine Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China；2. Department of Pharmacy, School of Medical, Foshan University, Foshan 528000, China)

Abstract：Molecular distillation (MD) was used to purify capsicum oleoresin, and three important process parameters such as distillation temperature, distillation pressure and wiper rolling speed were optimized by response surface methodology for better separation between capsaicinoids and capsicum red pigment. Individual variables and their interactions on the response values capsaicinoid concentration and color value were explored according to Box-Behnken design. A mathematical quadratic polynomial regression equation was established. The optimal process conditions for distillation temperature, distillation pressure and wiper rolling speed were 144 ℃, 9.5 Pa and 313 r/min, respectively. Under these conditions, the capsaicinoids concentration was increased to 75.30%, and the color value of capsicum red pigment separated was 19.84. DPPH radical scavenging assay showed that the capsaicinoids separated had good antioxidant activity.

Key words：capsaicin；molecular distillation；response surface methodology；antioxidant activity

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0087-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320017

辣椒为茄科植物辣椒(Capsicum annuum L.)栽培变种的干燥成熟果实[1]，其茎、根亦可药用，是一种药食同源的一年生草本植物，在我国作为调味剂已具有悠久的历史。辣椒油树脂是从辣椒中提取、浓缩得到的一种暗红色黏稠油状液体，是多种物质的混合物，主要含有辣椒碱类物质、辣椒红素、辣椒黄素、β-胡萝卜素等。辣椒碱类物质主要由辣椒碱和二氢辣椒碱组成[2]，其中有文献[3-5]报道辣椒碱类物质具有较强的抗炎、抗氧化、降脂、减肥及抗肿瘤等作用。辣椒红色素色泽鲜美、着色力强、安全性高，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)列为A类色素，在使用中不加以限量，被广泛应用于食品、保健品、医药和化妆品生产领域的着色过程，因此辣椒油树脂中辣椒碱类物质和辣椒红色素的分离工艺的研究对辣椒的开发和利用具有非常重要的意义。

传统的辣椒油树脂的分离纯化方法有碱液处理法、硅胶柱层析法、大孔吸附树脂法等，新型的分离手段有超临界CO2流体萃取法、分子蒸馏法等[6-7]。碱液处理法工艺复杂，产品收率较低，很难得到高纯度的产品；硅胶柱层析法消耗流动相量大、硅胶不能再生，生产成本高，不适用于工业化大生产；大孔吸附树脂法可以得到高纯度的辣椒碱类，但收率较低。超临界CO2流体萃取法对辣椒红色素的分离效果好，但技术投资比较大，设备要求高，难以实现大规模工业生产。且目前对这些分离手段的报道都只单一针对辣椒油树脂中辣椒碱类物质或辣椒红色素进行分离纯化。

分子蒸馏是纯物理分离过程，操作简便，对设备的要求较低，可节省大量溶剂，同时减少对环境的污染，而且不会带入新的杂质和有毒物质且收率较高，条件温和，克服了传统蒸馏操作温度高、受热时间长的缺点，解决了传统蒸馏方法无法对高沸点、热敏性及易氧化物料分离的工业化难题[8-9]，现已广泛应用于化工、医药、食品和化妆品等领域[10]。目前，国内对分子蒸馏分离辣椒碱类物质和辣椒红色素的研究报道主要为单因素和正交试验考察[11]，均只单一地获得辣椒碱类物质或辣椒红色素，且纯化效率低、资源利用率低，采用响应曲面法[12-13]对分子蒸馏工艺条件进行优化同时获得辣椒碱类物质和辣椒红色素的研究还未见详细报道，缺乏具体的工艺参数。因此本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法中的Box-Behnken设计对分子蒸馏分离工艺进行优化，考察蒸馏温度、蒸馏压力以及刮膜转数对辣椒碱类物质和辣椒红色素分离的影响，同时采用DPPH法对分离得到的辣椒碱类物质和辣椒红色素进行抗氧化活性研究，以期为辣椒油树脂的分离纯化研究与开发应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干红辣椒购自广州东旺市场；辣椒碱及二氢辣椒碱对照品(纯度＞98%) 中国食品药品检定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT) 美国Sigma公司；甲醇(色谱纯) 德国Merck公司；丙酮(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪(配有SPD-M20A二极管阵列检测器，LC solution色谱工作站) 日本岛津公司；TU-1901双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；MD-S80实验型分子蒸馏装置 广州汉维冷气机电设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣椒油树脂提取工艺

辣椒粉碎过40目筛，加药材质量的10倍量体积的丙酮(g/mL)，水浴加热回流提取，温度为60℃，提取3次，每次提取1h，减压浓缩提取液即为辣椒油树脂。

1.3.2 分子蒸馏纯化工艺

1.3.2.1 单因素试验

将辣椒油树脂加入分子蒸馏仪器的进料瓶，系统真空度达到所需要求后，物料以设定流速从进料器进入分子蒸馏装置进行蒸馏，在刮膜器的作用下，料液流入内壁被滚刷成薄膜，均匀分布于加热面上。在一定温度和高真空条件下，辣椒碱等轻组分成分沿冷凝器流入轻组分收集瓶；辣椒红色素的平均自由程较短而达不到冷凝器，沿着蒸馏器筒体的内壁流入重组分收集瓶，分别收集轻组分和重组分收集瓶中的成分，并分别对其进行检测分析。

1.3.2.2 响应面设计试验

根据前期的单因素试验，根据Box-Behnken的试验设计原理，运用Design-Expert(version 8.0)软件程序，对辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价的响应值有显著影响的因素进行响应面试验，以蒸馏温度、蒸馏压力和刮膜转数为考察因素，辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价为响应值，采用三因素三水平的响应曲面法，对试验数据进行回归分析，预测提取辣椒碱类物质和辣椒红色素的优化工艺条件，试验因素水平及编码见表1。

表 1 Box-Behnken试验因素水平及编码

Table 1 Factors and levels used in response surface design

注：X1=(A－140)/10，X2=(B－50)/50，X3=(C－300)/50。

1.3.3 辣椒碱含量测定

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：迪马Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(70:30，V/V)；流速1.0mL/min；检测波长280nm；柱温25℃；进样量20μL。

1.3.3.2 标准曲线的制作

精密称取处理过的辣椒碱和二氢辣椒碱对照品置于25mL容量瓶中，加无水甲醇溶解至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，作为混合对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液10、15、20、25、30、35、40μL注入液相色谱仪，测定其峰面积积分值，平行实验3次。以进样量(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制辣椒碱和二氢辣椒碱的标准曲线。

1.3.3.3 轻组分的检测分析

按照Box-Behnken设计方案进行试验，按所设计的不同试验条件对分子蒸馏后的轻组分进行检测分析。取轻组分样品定容于10mL的容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤，备用。精密吸取各供试品溶液20μL，按1.3.3.1节色谱条件测定峰面积，以回归方程计算产物中辣椒碱类物质的含量。

1.3.4 色价(E)的计算

辣椒红色素的含量是辣椒油树脂的重要质量指标，一般通过分光光度计测定色价，色价的高低与辣椒红色素含量的高低成正比。常用的方法为国家标准GB 10783—2008《食品添加剂：辣椒红》，即采用紫外分光光度计在其最大吸收峰(一般为460nm波长)处的吸光度[15]。分析步骤：准确称取0.1g重组分样品，精确至0.0002g，用丙酮稀释于100mL容量瓶中，再精确吸取稀溶液10mL，稀释至100mL，用分光光度计在460nm波长处，用丙酮作参比液，于1cm比色皿中测定其吸光度。按照式(1)计算：

(1)

式中：E为1g/100mL被测样品1cm比色皿，在最大吸收峰460nm波长处的吸光度，即为色价；A为实测试样的吸光度；f为稀释倍数；m为试样质量/g。

1.3.5 清除DPPH自由基的测定[16]

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化反应的作用。DPPH自由基有个单电子，在517nm波长处有最大吸收度，其甲醇溶液显深紫色。当抗氧化剂存在时，DPPH溶液的颜色变浅，吸光度减小。

具体操作步骤：精确称取DPPH标准品0.0039g，用甲醇定溶至100mL。取2mL样品溶液与2mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液加入同一试管中，摇匀室温避光反应放置30min，在517nm波长处测定其吸光度，以无水甲醇调仪器零点。清除率用式(2)计算，结果与合成抗氧化剂BHT清除率进行比较。

(2)

式中：A0为2mL DPPH溶液＋2mL甲醇溶液的吸光度；Ai为2mL DPPH溶液＋2mL待测溶液的吸光度；Aj为2mL待测溶液＋2mL甲醇溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 辣椒碱和二氢辣椒碱分析检测

以标准品色谱峰面积(Y)和进样量(X)进行回归，得出回归方程，标准品与供试品的HPLC色谱图见图1。

辣椒碱和二氢辣椒碱的回归方程分别为Y=107X－15633(R2=0.9999)、Y=107X－30378(R2=0.9999)。平行实验3次，重复性良好，计算辣椒碱的RSD为1.16%、二氢辣椒碱的RSD为0.34%，表明仪器精密度良好。

A.辣椒碱tR1=12.000min，二氢辣椒碱tR2=17.215min；B.辣椒碱tR1=12.273min，二氢辣椒碱tR2=17.711min。

图 1 标准品(A)和分子蒸馏轻组分(B)的HPLC图

Fig.1 HPLC chromatograms of mixture of capsaicin and dihydrocapsacin standards (A) and light components (B) from molecular distillation

2.2 单因素试验

2.2.1 蒸馏温度的影响

设定分子蒸馏的操作压力10Pa、刮膜器转速300r/min、进料速率3mL/min左右、进料温度40℃、内冷凝器温度13℃，在此操作条件下，加入200mL辣椒油树脂，以辣椒碱和二氢辣椒碱的总含量的质量分数及辣椒红色素色价为指标，考察不同蒸馏温度对分离纯化的影响。

图 2 蒸馏温度对辣椒碱类物质含量和辣椒红色素的色价的影响

Fig.2 Effect of distillation temperature on capsaicinoids concentration and color value of capsicum red pigment

如图2所示，当温度上升时，响应值(辣椒碱类物质的质量分数以及辣椒红色素色价)增幅较大，但当温度达到130℃后，响应值增幅逐渐趋于平缓。因此，兼顾辣椒碱类物质的含量以及辣椒红色素色价，选择蒸馏温度为130～150℃。

2.2.2 蒸馏压力的影响

图 3 蒸馏压力对辣椒碱类物质含量和辣椒红色素的色价的影响

Fig.3 Effect of distillation pressure on capsaicinoids concentration and color value of capsicum red pigment

蒸馏压力是影响分子蒸馏效果的一个重要因素，蒸馏压力越低，物质的气体分子运动平均自由程越大，组分更容易被分离。如图3所示，在0Pa时辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价达到最大值，随着蒸馏压力的增大，其呈迅速下降的趋势，且在0～100Pa压力下辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价下降迅速，因此蒸馏压力可选择为0～100Pa。

2.2.3 刮膜转数的影响

图 4 刮膜转数对辣椒碱类物质含量和辣椒红色素的色价的影响

Fig.4 Effect of wiper rolling speed on capsaicinoids concentration and color value of capsicum red pigment

刮膜转数对响应值的影响如图4所示，在较低转速时，响应值(辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价)较低，在一定转数内，随着转速的增加，辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价均有所上升，说明转子转速一定量的提高有利于原料在蒸发器内壁形成均匀的液膜，使传热效率上升，当转速为300r/min时，响应值达到最大值，随着转速的增加，辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价呈逐渐降低的趋势。因此，刮膜转数可选择为为250～350r/min。

2.3 响应曲面试验

2.3.1 响应曲面设计与结果

以X1、X2、X3为自变量，以试验所得辣椒碱类物质的含量(Y1)和辣椒红色素色价(Y2)为响应值，结果见表2。

表 2 Box-Behnken试验设计及结果

Table 2 Three-variable-three-level Box-Behnken design and results

2.3.2 模型的建立及其显著性检验

2.3.2.1 辣椒碱类物质含量的响应面分析

利用Design-Expert (version 8.0)数据处理系统对表2试验结果进行二次多项式逐步回归拟合，得到数学模型：Y1 = 71.05＋6.36X1－10.48X2＋5.04X3＋1.81X1X2－2.98X1X3＋1.06X2X3－6.76X12－4.92X22－5.67X32。

表 3 辣椒碱类物质含量的回归方程方差分析表

Table 3 Analysis of variances for the developed response surface regression model for capsaicinoids concentration

注：**.差异极显著(P＜0.01)；*.差异显著(P＜0.05)。下同。

模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察，由表3可知，模型的F=32.19，P=0.0007，说明试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性。此外，还可以明显看出X1X2、X1X3、X2X3不显著，X22有显著影响，X1、X2、X3、X12、X32有极显著影响，F失拟=7.85，失拟项P=0.1151＞0.05，表明失拟不显著。由此可见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳分离纯化工艺条件。该回归模型的调整确定系数为R2Adj=0.9525，即该模型能解释95.25%响应值的变化，模型拟合程度良好，试验误差小，说明应用响应曲面法优化辣椒碱类物质的纯化工艺条件是可行的。

2.3.2.2 各因素及交互作用对辣椒碱类物质含量的影响

a. 蒸馏温度与蒸馏压力

b. 蒸馏温度与刮膜转数

c. 蒸馏压力与刮膜转数

图 5 两各因素交互作用对辣椒碱类物质含量的影响的响应面图

Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of various parameters on capsaicinoids concentration

Response Surface Analysis(RSA)等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆形表示二因素交互作用显著。由图5可知，蒸馏温度与刮膜转数的相互作用较显著。对回归方程求一阶偏导，令其等于零，求解得各因素最佳水平值，分别为X1=0.28，X2=－0.98，X3=0.28，经过转换后得到辣椒碱类物质分离纯化的最佳工艺条件为蒸馏温度142.77℃、蒸馏压力0.80Pa、刮膜转数313.98r/min，在此条件下纯化得到辣椒碱类物质含量的理论值为77.79%。

2.3.2.3 辣椒红色素色价的响应面分析

利用Design-Expert (version 8.0)数据处理系统对表2试验结果进行二次多项式逐步回归拟合，得到数学模型：Y2=20.03＋0.89X1－0.77X2＋1.0X3－0.33X1X2－0.17X1X3＋2.50×10-3X2X3－0.92X12－0.84X22－1.76X32。

当P＜0.0001时，说明试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性。由表可知，X1X3、X2X3不显著，X1X2有显著影响，X1、X2、X3、X12、X22、X32有极显著影响，F失拟=4.87，失拟项P=0.1751＞0.05，表明失拟不显著。由此可见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的变化关系，可以利用该回归方程确定最佳分离纯化工艺条件。该回归模型的调整系数为R2Adj=0.9853，即该模型能解释98.53%响应值的变化，模型拟合程度良好，试验误差小，说明应用响应曲面法能较好的优化辣椒红色素的纯化工艺条件。

表 4 辣椒红色素色价回归方程方差分析表

Table 4 Analysis of variances for the developed response surface regression model

2.3.2.4 各因素及交互作用对辣椒红色素色价的影响

a. 蒸馏温度与蒸馏压力

b. 蒸馏温度与刮膜转数

c. 蒸馏压力与刮膜转数

图 6 各因素交互作用对辣椒红色素色价影响的响应面图

Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of various parameters on the color value of capsicum red pigment

由图6可以看出，蒸馏温度与刮膜转数、以及蒸馏压力与刮膜转数的相互作用较为显著。对回归方程求一阶偏导，令其等于零，解得各因素最佳水平值分别为X1=0.56，X2=―0.57，X3=0.26，经过转换后得到辣椒碱分离纯化的最佳工艺条件为蒸馏温度145.62℃、蒸馏压力21.54Pa、刮膜转数312.82r/min，在此条件下纯化得到辣椒红色素色价的理论值为20.63。

2.3.2.5 最终优化工艺参数的确定

本研究的主要目的是获得最大的辣椒碱类物质的含量，同时以辣椒红色素色价为参考指标，获得最优的分离纯化工艺。由上述响应面分析可知，获得最大的辣椒碱类物质的含量和最高辣椒红色素色价的工艺参数不一致，为综合考虑两方面因素，结果如表5所示，确定最优工艺条件为蒸馏温度144℃、蒸馏压力9.5Pa、刮膜转速313r/min，此条件下的结果与理论预测值相比，其相对误差小于5%。因此，基于响应曲面法所得的优化分离纯化工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。

表 5 最佳条件下实际试验值与预测值

Table 5 Experimental and predicted values of capsaicinoids content and color value of capsicum red pigment under optimal conditions

2.4 最终纯化工艺产物的抗氧化活性的测定

通过对采用最佳分离纯化工艺获得的辣椒碱类物质及辣椒红色素进行抗氧化活性的测定，结果见图7，溶剂提取辣椒油树脂的DPPH自由基清除IC50为365.62μg/mL，辣椒红色素的DPPH自由基清除IC50为364.58μg/mL，辣椒碱类物质的DPPH自由基清除IC50为32.27μg/mL，BHT的DPPH自由基清除IC50为2.39μg/mL。结果说明辣椒碱类物质相比于辣椒油树脂和辣椒红色素具有较好的抗氧化活性，因此可以考虑将辣椒作为一种天然抗氧化剂的提取原料加以开发和利用。

图 7 不同成分对DPPH自由基的清除效果

Fig.7 Comparison of DPPH radical scavenging activity of

different components

3 结 论

通过分子蒸馏纯化辣椒油树脂的单因素试验和响应曲面分析法对工艺进行优化，确定最优工艺条件为蒸馏温度144℃、蒸馏压力9.5Pa、刮膜转数313r/min。在此条件下，辣椒碱类物质的含量为75.30%，辣椒红色素的色价为19.84，与理论值的相对误差不大，均小于5%。经检验证明该模型合理可靠，能较好地预测辣椒碱类物质的含量和辣椒红色素色价，同时抗氧化活性试验结果表明辣椒碱类物质具有很好的抗氧化活性。

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