响应面法优化黄河鲤鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白提取工艺 朱文学,邱园园,肖 枫,康帅飞,王玲玲 (河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471023)
摘 要:以新鲜的黄河鲤鱼鱼鳞为原料,在单因素试验的基础上,采用响应面法Box-Behnken试验设计,对影响酸溶性胶原蛋白提取效率的3个影响因素即乙酸浓度、液料比和提取时间进行优化,建立并分析各因素与酸溶性胶原蛋白得率关系的数学模型。结果表明:黄河鲤鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的最佳提取工艺条件为提取剂乙酸浓度0.54mol/L、液料比10:1(mL/g)、提取时间42h,在此条件下胶原蛋白的提取率达到15.89%。 关键词:黄河鲤鱼鱼鳞;胶原蛋白;响应面法;提取工艺;优化
Optimization of Extraction Process for Acid-Soluble Collagen from Cyprinus carpio Haematopterus Scale by Response Surface Methodology
ZHU Wen-xue,QIU Yuan-yuan,XIAO Feng,KANG Shuai-fei,WANG Ling-ling (College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)
Abstract:On the basis of one-factor-at-a-time experiments, Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM) were applied to explore the effects of acetic acid concentration, material/liquid ratio and extraction duration on the extraction efficiency of collagen from common carp fish scale. As a result, a mathematical model was fitted. The optimal extraction conditions were found to be 0.54 mol/L acetic acid as the extraction solvent with a material/liquid ratio of 1:10 (g/mL) for an extraction duration of 42 h. Under these conditions, the extraction efficiency of collagen was 15.89%. Key words:Yellow River common carp scale;collagen;response surface methodology;extraction process;optimization 中图分类号:TS209 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0094-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201320018 胶原蛋白也称胶原,是由动物细胞合成的一种透明、白色、无分支的纤维结构物质。广泛存在于动物的皮肤、肌膜、韧带和血管等组织结构中,是结缔组织极其重要的结构蛋白质,起着保护机体、支撑器官的作用[1-3]。胶原蛋白的结构和功能特点的复杂性和多样性,决定了其在很多领域中的广泛应用,被广泛应用于医疗、食品、卫生、美容、化妆品、科研等领域[4-6]。 鲤鱼鱼鳞的主要成分为Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石,其中胶原蛋白的经济价值和营养价值都很高,据报道,以胶原为原料所研制的各种产品,在世界范围内的年销售额已经超过70亿美元。同时国外的公司对羟基磷灰石的利用也已经取得了一定的成果,并将其制成含胶原与磷灰石的片剂罐头食品[7]。由于我国对此类水产品资源的不重视,欧美及日本的一些公司则以很低的价格从我国进口大量的干制鱼鳞,虽然我们赚取了一些外汇,可是却浪费了宝贵的资源[8-12]。为了提高对水产品资源的利用,同时避免对环境的污染,对水产品加工生产过程中产生的废弃物——鱼鳞的再利用进行研究是十分必要的。由于羟脯氨酸是胶原蛋白特有的一种氨基酸,因此胶原蛋白的提取率的测定以羟脯氨酸的含量作为标准。 响应面法设计是回归试验设计的一种,它既能分析各因子之间的交互影响,又能建立准确合理的数学模型,能更好地处理试验数据[13-14]。本实验以黄河鲤鱼鱼鳞为原料,采用酸法提取工艺,在对影响鱼鳞胶原蛋白提取效率较大的3个影响因子进行单因素试验的基础上,利用响应面分析法对酸溶性胶原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)提取工艺进行优化,并做鉴定,旨在提高黄河鲤鱼鱼鳞胶原蛋白的提取率。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 鲤鱼由济源市三佳食品有限公司提供,将新鲜的鲤鱼鱼鳞取下,清洗干净,晾干,放入冰箱,4℃冷藏备用。 胃蛋白酶 美国Sigma公司;氢氧化钠、冰乙酸 上海化学试剂有限公司;对-二甲氨基苯甲醛(PDAB) 杭州试剂科技厂;高氯酸 天津东方试剂厂;氯胺-T、醋酸钠、甲醇 天津福晨化学试剂厂;盐酸 武汉化学试剂厂;氢氧化钠 武汉联碱厂;所有试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备 DHG-A型鼓风恒温干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;722N型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;Fs4型电子分析天平 上海衡平仪器仪表厂;HR型电热恒温水浴锅 金坛市晶玻实验仪器厂;TU-2型台式离心机 天津华通实验仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 鱼鳞的前处理 取新鲜的黄河鲤鱼鱼鳞,先用自来水清洗2遍,去除混入的杂质。然后用蒸馏水清洗1遍,之后将其置于阴凉处晾干,然后准确称取1g鱼鳞,置于1mol/L的盐酸溶液中进行脱钙,处理2h后取出鱼鳞,用蒸馏水清洗干净,晾干备用。 1.3.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制及其提取率的测定 氯胺-T试剂的配制:溶解3.0g柠檬酸、1.5g氢氧化钠和9.0g乙酸钠于20mL水中,转移至100mL容量瓶中,加入29mL异丙醇,定容,制成缓冲液,取1.41g氯胺-T溶于该缓冲液中,即为氯胺试剂。 发色剂的配制:溶解10g对二甲胺基苯甲醛于35mL 60%高氯酸中,缓慢地加入65mL异丙醇,并不断搅动,制备液当天使用。 取样品约0.2g于安培瓶中,加入2mL 6mol/L的盐酸,用酒精喷灯封口后于130℃条件下水解4h。取出,移至试管中,加入1滴甲基红指示剂,然后加入氢氧化钠溶液中和,定容至100mL。取2mL水解液加入1mL氯胺试剂,振摇试管,室温条件下放置20min,再加入1mL发色剂,并充分混合,于60℃的水浴锅放置20min,然后在自来水下冷却试管5min,在558nm波长处测其吸光度,同时做空白实验。 羟脯氨酸标准曲线的测定:取羟脯氨酸0.0121g定容到100mL,质量浓度为121μg/mL,再取10mL定容至100mL,稀释至12.1μg/mL。配制不同质量浓度羟脯氨酸溶液按照上述方法进行操作,在558nm波长处测其吸光度绘制标准曲线[15-16]。得到标准曲线方程:y=0.0652x+0.0028,R2=0.9995。该方程拟合度较好,可以用于羟脯氨酸含量的计算。 羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸,因此胶原蛋白的含量测定以羟脯氨酸的量来计算。胶原蛋白提取率按下式计算:
1.3.3 单因素试验 准确称取经处理的1.000g鱼鳞,加入一定浓度和体积的乙酸溶液。按不同的实验设计条件提取胶原蛋白,对提取时间、提取剂浓度、液料比进行单因素试验,做3个平行,取平均值。 1.3.4 胶原蛋白提取工艺优化试验设计 在单因素试验的基础上,采用响应面法中的Box-Behnken试验设计方案[17-21],以羟脯氨酸的提取率为响应值,利用Design-Expert.V8.0.6进行二次旋转正交分析,优化胶原蛋白的提取率,确定最佳的提取工艺,因素及水平见表1。 表 1 响应面试验因素及水平表 Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design
1.3.5 胶原蛋白的鉴定 胶原蛋白由附在其周围的黏多糖和蛋白质组成,与其他蛋白质一样有四级结构,它的四级结构决定了胶原的形状、结构、物理化学性质、生物功能等。胶原的分子质量一般在20~30万D,由3条多肽链组成,2条α链和1条β链相互缠绕成右手螺旋结构-三螺旋结构。这是胶原蛋白的特有结构,因此可由此鉴定所提取的物质为胶原蛋白。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定所提取物为胶原蛋白,分离胶含量7.5%,浓缩胶含量3.5%。取ASC和酶溶性胶原蛋白(pepsin soluble collagen,PSC)(使用胃蛋白酶在一定的提取工艺条件下从黄河鲤鱼鱼鳞中获得的,是为了与酸法提取的ASC作对比)各lmg,用样品处理液配成lmg/mL溶液。电泳上样20μL,直流稳压电源,浓缩胶80V,分离胶120V。电泳5~6h。电泳结束后,凝胶用考马斯亮兰R-250染色,而后用7.5%乙酸、5.0%甲醇溶液脱色。使用凝胶成像系统分析各条带的分子质量。 2 结果与分析 2.1 单因素试验 2.1.1 提取剂浓度对胶原蛋白提取率的影响 经过前处理的黄河鲤鱼鱼鳞置于乙酸溶液中提取其胶原蛋白,在提取时间48h、液料比10:1(mL/g)、提取温度4℃的条件下,研究不同浓度的乙酸溶液对黄河鲤鱼鱼鳞胶原蛋白提取率的影响,结果如图1所示。随着乙酸溶液浓度的提高,胶原蛋白的提取率先不断升高,到达最高点后下降。当乙酸溶液浓度为0.5mol/L时,提取率达到最大。胶原蛋白的酸法提取多采用0.05~0.5mol/L的乙酸溶液,其可以使胶原蛋白从鱼鳞中分离,胶原蛋白在乙酸溶液中溶解度随着浓度的提高而增大,当胶原蛋白在乙酸溶液中的溶解度达到饱和时,会阻止胶原的提取,使胶原蛋白的提取率降低。当乙酸溶液浓度为0.5mol/L时,胶原的溶解性最好,此时的提取率最高。
图 1 提取剂浓度对胶原蛋白提取率的影响 Fig.1 Effect of solvent concentration on the extraction efficiency of collagen 2.1.2 提取时间对胶原蛋白提取率的影响
图 2 提取时间对胶原蛋白提取率的影响 Fig.2 Effect of extraction duration on the extraction efficiency of collagen 由图2可以看出,当提取时间为12~40h时,胶原蛋白的提取率随着时间的延长而升高,这是因为开始提取时间较短,胶原蛋白未能全部溶出,同时也与使用的液料比较低有关,使提取率不能达到最大。当提取时间达到40h以后,胶原蛋白的提取效率再不能显著提高,因此选取40h为最佳提取时间。 2.1.3 液料比对胶原蛋白提取率的影响 由图3可以看出,当液料比在4:1~8:1的范围时,胶原蛋白的提取率随着液料比的增大而提高,当液料比较低时,不能最大程度地溶解鱼鳞中胶原蛋白,不能使提取率达到最大。在液料比达到8:1时,胶原蛋白的提取效率达到最大,之后便不再增加,因此选取8:1为最佳的液料比。
图 3 液料比对胶原蛋白提取率的影响 Fig.3 Effect of liquid/material ratio on the extraction efficiency of collagen 2.2 响应面法优化试验 Box-Behnken试验设计结果见表2,对表2进行拟合的二次模型方差分析见表3。 表 2 胶原蛋白提取工艺Box-Behnken试验设计及结果 Table 2 Box-Behnken design and corresponding experimental results for collagen extraction
表 3 提取工艺回归模型方差分析结果 Table 3 ANOVA for the regression equation describing the extraction process
注:**. P<0.01,差异极显著;*. P<0.05,差异显著。下同。
对表2结果进行多元回归分析,得到各因素对胶原蛋白提取率影响的多元二次回归方程模型: Y=15.54+0.69X1+0.89X2+0.86X3-0.20X1X2-1.68X1X3+1.08X2X3-2.15X12-1.84X22-3.75X32 对上述方程进行分析求解,得到黄河鲤鱼鱼鳞胶原蛋白提取工艺的最佳工艺条件为:提取剂浓度0.54mol/L、提取时间42.59h、液料比10.53:1。考虑实际操作的方便,将胶原蛋白的酸法提取的最佳工艺条件修改为提取剂浓度0.54mol/L、提取时间42h、液料比10:1,在此条件下,黄河鲤鱼鱼鳞胶原蛋白的提取率的理论预测值为15.751%,实际测得的提取率为15.89%,表明该模型合理可行。 由表3可以看出,该工艺建立的回归模型的P<0.01,当P<0.05时,表明该项指标显著,由此可知该工艺的模型是及其显著的,失拟项P=0.2291>0.05,不显著;由表中可以得出多元相关系数R2=0.9983,说明该模型与实际试验拟合情况很好,故可以使用该回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析;变异系数(variable coefficient,CV)=1.48%,说明方程的变异性较小。
a.提取时间与液料比
b.提取剂浓度与液料比 图 4 各两因素交互作用对胶原蛋白提取率影响的响应面图 Fig.4 Response surface plots for the effects of various operating parameters on the extraction efficiency of collagen 回归方程中的各个变量对响应值即提取率的影响的显著程度由F检验来进行判断,即P值越小,表明该变量对响应值的影响的显著程度越高。表3中的显著性检验结果说明,一次项X2、X3的影响显著,交互项X1X3、X2X3影响显著,二次项X12、X22、X32影响极显著。由上述结果可以得出,各因素对胶原蛋白提取率的影响并不是简单的线性关系。 各两因素交互作用对胶原蛋白提取率影响的响应面图见图4。将其他的水平固定为提取剂浓度0.5mol/L、提取时间48h、液料比10:1。 由图4a可以看出,提取时间固定不变时,随着液料比的增大,胶原蛋白提取率呈现升高的趋势。因为黄河鲤鱼鱼鳞的主要成分为Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石,经过前处理后的鱼鳞主要成分就是胶原蛋白,胶原蛋白易溶于乙酸溶液,故随着液料比的增大,鱼鳞中的胶原更易溶出,从而提高了胶原蛋白的提取率;当液料比大于10:1时,胶原蛋白提取率呈现下降趋势。 由图4b可以看出,当提取剂浓度固定不变时,随着液料比的增大,提取率呈现先升高后减缓的趋势。鱼鳞中的蛋白质有多种,Ⅰ型胶原蛋白和其他的杂蛋白都能溶于乙酸溶液,当料液比为10:1左右时提取率达到最大,随着液料比再增大,胶原的提取率趋于平缓,原因可能是由于杂蛋白的干扰,同时由于乙酸溶液对胶原蛋白的溶解度达到饱和,使溶入到乙酸中的胶原含量不再增加,从而使提取率增长趋势趋于平缓。 2.3 胶原蛋白的活性鉴定 SDS-PAGE凝胶电泳结果如图5所示。
1. Marker分别为200kD肌球蛋白重链、130kD钙调素结合蛋白、97.4kD兔鳞酸化酶B、66.2kD牛血清白蛋白、43.0kD兔肌动蛋白;2. ASC;3. PSC。 图 5 胶原蛋白的电泳图谱 Fig.5 Electrophoresis patterns of acid-soluble collagen and pepsin-soluble collagen from common carp scale 由图5可以看出,黄河鲤鱼鱼鳞中ASC和PSC包括两条不同的α链(α1和α2)和它们的交联体β链。从图中可以看出ASC的α1的分子质量大概为127.3kD,α2为114.5kD。相较之ASC,PSC的分子质量较小,α1为124.8kD,α2为112.7kD。其原因可能是胃蛋白酶非特异性切断了胶原蛋白的部分尾肽,使得PSC的分子质量稍小。从电泳图可以证明所提取的物质为胶原蛋白,符合胶原蛋白的三螺旋结构。 3 结 论 通过使用响应面分析法优化黄河鲤鱼鱼鳞胶原蛋白酸法提取工艺过程中的胶原蛋白提取率这个参数,借助于Design-Expert.V8.0.6软件进行二次旋转正交分析,最终得出胶原蛋白提取的最优工艺条件为提取剂乙酸浓度0.54mol/L、提取时间为42h、液料比10:1(mL/g)。按照上述最佳工艺条件进行验证实验,所得结果与预测结果基本上一致,同时通过SDS-PAGE凝胶电泳可以证明提取的蛋白质为胶原蛋白,符合文献所述的生理活性,证明本实验结果合理可靠。 参考文献: [1] 吴缇, 陈舜胜. 选择不同提取剂制备斑点叉尾鮰鱼皮胶原蛋白的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 321-325. [2] Zelechowska E, Sadowska M, Turk M. Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod (Gadus morhua)[J]. Food Hydrocolloids, 2010, 24(4): 325-329. [3] Pati F, Adhikari B, Dhara S. Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(10): 3737-3742. [4] 林琳, 郑钰, 吕顺, 等. 有机酸提取草鱼皮胶原蛋白的工艺研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(5): 2246-2247. [5] 刘丽莉, 马美湖, 杨协力, 等. 牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取及结构表征[J]. 食品科学, 2010, 31(2): 87-91. [6] LIN Yungkai, LIU Dengcheng. Effects of pepsin digestion at different temperatures and times on properties of telopeptide-poor collagen from bird feet[J]. Food Chemistry, 2006, 94(4): 621-625. [7] 钟朝辉, 李春美, 梁晋鄂, 等. 鱼鳞胶原蛋白提取工艺的优化[J]. 食品科学, 2006, 27(7): 162-166. [8] Sadowska M, Kolodziejska I, Niecikowska C. Isolation of collagen from the skins of Baltic cod (Gadus morhua)[J]. Food Chemistry, 2003, 81(2): 257-262. [9] DUAN Rui, ZHANG Junjie, DU Xiuqiao, et al. Properties of collagen from skin, scale and bone of carp (Cyprinus carpio)[J]. Food Chemistry, 2009, 112(3): 702-706. [10] 陈小娥, 方旭波, 钟秋琴, 等. 安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺研究[J]. 食品工业科技, 2007, 28(3): 131-133. [11] Skierka E, Sadowska M, Karwowska A. Optimization of condition for demineralization Baltic cod (Gadus morhua) backbone[J]. Food Chemistry, 2007, 105(1): 215-218. [12] LIN Yungkai, LIN Tungyung, SU Houpin. Extraction and characterisation of telopeptide-poor collagen from porcine lung[J]. Food Chemistry, 2011, 124(4): 1583-1588. [13] 赵睿, 王晓丹, 祖国仁, 等. 热水法抽提鳕鱼皮胶原蛋白条件的响应面分析[J]. 大连工业大学学报, 2011, 30(2): 98-100. [14] Zelechowska E, Sadowska M, Turk M. Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod (Gadus morhua)[J]. Food Hydrocolloids, 2010, 24(4): 325-329. [15] 陈申如, 蔡扬鹏, 周琼, 等. 鱼骨胶原蛋白的纯化及其特性的初步研究[J]. 食品科学, 2006, 27(11): 177-181. [16] Woo J W, Yu S J, Cho S M, et al. Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna (Thunnus albacares) dorsal skin[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(5): 879-887. [17] Ahmad M, Benjakul S. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from the skin of unicorn leatherjacket (Aluterus monocerous)[J]. Food Chemistry, 2010, 120(3): 817-824. [18] 杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 68-71. [19] Kolodziejska I, Sikorski Z E, Niecikowska C. Parameters affecting the isolation of collagen from squid (Illex argentinus) skins[J]. Food Chemistry, 1999, 66(2): 153-157. [20] 焦道龙, 陆剑锋, 张伟伟, 等. 水产动物胶原蛋白的研究现状及发展趋势[J]. 食品科学, 2009, 30(17): 334-338. [21] ZHANG Yan, LIU Wentao, LI Guoying, et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry, 2007, 103(3): 906-912. 收稿日期:2012-10-26 作者简介:朱文学(1967—),男,教授,博士,主要从事农产品干燥和农产品功能性成分分离及提取研究。 E-mail:zwx@mail.haust.edu.cn |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||