MTT法测定瑞士乳杆菌MB 2-1活菌数

杨培洁,李 腾,陈晓红,李 伟,董明盛*

(南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

 

摘 要:以赛里木拉丝酸奶中提取的瑞士乳杆菌MB 2-1(Lactobacillus helveticus MB 2-1)为研究对象,探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围,优化MTT法用于瑞士乳杆菌活菌计数的工作波长、MTT和DMSO用量、反应时间。结果表明:在107~109CFU/mL内测出的OD值与细菌浓度呈正向线性关系(R2>0.99),最佳反应条件为:1.0mL待测菌液与0.2mL MTT溶液在40℃条件下染色反应1h,反应液需要经过12000r/min离心10min,取离心沉淀物溶解于1.0mL二甲基亚砜中,于工作波长510nm处测定此溶液的OD值。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。

关键词:MTT染色计数法;瑞士乳杆菌MB 2-1;活菌计数;条件优化

 

MTT Colorimetric Method for Lactobacillus helveticus MB 2-1 Viable Cell Counting

 

YANG Pei-jie,LI Teng,CHEN Xiao-hong,LI Wei,DONG Ming-sheng*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

 

Abstract:The feasibility of MTT colorimetric method for Lactobacillus helveticus MB2-1 viable cell counting was evaluated, and the wavelength, MTT dosage, DMSO dosage and incubation time were optimized. Results showed that the OD value was linear with the cell concentration (R2 > 0.99) at cell concentrations between 107 CFU/mL and 109 CFU/mL. The best working procedure was described as following: 1.0 mL of bacterial suspension reacted with 0.2 mL of MTT solution for 1 h min at 40 ℃. After centrifugation at 12000 r/min for 10 min, 1.0 mL of DMSO was added to dissolve the precipitate. OD510nm values were measured. This study indicates that the MTT colorimetric method can be applied for lactobacillus viable cell counting.

Key words:MTT colorimetric method;Lactobacillus helveticus MB 2-1;viable cell counting;optimization

中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0099-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320019

微生物计数的方法有多种,如平板稀释计数法[1]、细胞干质量法、FISH荧光染色法[2]、MTT染色法[3-4]等,传统的平板计数法操作繁琐、耗时长、可重复性差,结果又容易受到多种因素的影响。研究表明采用平板稀释计数法计测瑞士乳杆菌的活菌数其准确度往往偏低[5]。但是平板稀释计数法能直接反映样品中活细胞数量,所以被广泛用于生物制品中活细胞的测定。微生物细胞干质量法操作简单易行,但无法直接反映活菌的数量[6]。FISH荧光染色法则是一种精确的微生物计数方法,它不仅排除了死菌的影响,同时荧光染色使菌落的生长情况清晰可见。但是此方法耗时长,操作繁琐,并且在细胞营养饥饿情况下可能会出现假阴性而造成此方法的灵敏性降低[7-9]。

MTT染色法是一种检测活细胞生长与活力的方法[10-11]。其原理是水溶性的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(俗称噻唑蓝,MTT)染色剂可以与活细胞中的脱氢酶反应,还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中[12]。由于死细胞不具备这一反应,因此用二甲基亚砜(DMSO)溶解所生成的甲瓒,通过检测光密度值变化,可间接反映细胞生长及增殖活性[13]。此方法广泛用于免疫细胞以及动物细胞的活性检测[14]。并且逐渐有将MTT法应用于细菌活细胞计数的报告,对于实施该方法的影响因素和测定条件进行了系统的研究[15-20]。在前期研究过程中,本实验组从传统新疆赛里木拉丝酸奶中分离到一株高产黏瑞士乳杆菌MB 2-1(Lactobacillus helveticus MB 2-1,以下简称MB 2-1),为实现其工业化应用中,并且缩短生产过程中细菌活细胞计数的时间,本实验以MB 2-1为研究对象,以平板稀释计数法作为参照方法,探讨并优化了与MTT法定量检测MB 2-1活细胞数有关的条件——分析前培养时间、MTT还原反应时间、MTT和DMSO用量、以及针对反应产物的最适检测波长,旨在检测乳酸菌活菌数量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

瑞士乳杆菌L. helveticus MB 2-1 本实验室保存。

8g/L乳清培养基、8.5g/L生理盐水、MRS培养基 自制;MTT染色液、DMSO 北京索来宝科技有限公司;Multiskan GO全波长酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

40℃条件下4%的接种量在乳清培养基中2次活化菌种后培养10~12h。此时培养液中菌体菌数约为0.5×109CFU/mL。

1.2.2 MTT染色计数法前处理[14]

5mL细菌液加入35mL生理盐水中,于4℃条件下以3500r/min离心10min后去除上清液。重复此清洗过程1次后将离心所得的菌泥复溶于5mL生理盐水中,制成悬菌液。

1.2.3 MTT染色计数法

一定量的待测菌液与MTT染色液混匀后置于40℃培养箱中染色反应,然后在4℃条件下12000r/min高速离心10min,分离出离心沉淀物甲瓒溶解于DMSO中,取样于96孔平底培养板中,采用酶标仪测定此溶液的OD值[14]。

1.2.4 MTT染色计数方法条件的确定

通过染色效果对比,确定最佳工作波长、相对于待测菌体液、最佳MTT染色液的加入量和最佳DMSO加入量、最佳染色时间,得到MTT染色法与平板稀释计数法的关系标准曲线以及此标准曲线的有效应用测试范围。

2 结果与分析

2.1 MTT染色计数方法工作波长的确定

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图 1 波长对OD值的影响

Fig.1 Selection of optimal wavelength for MTT cell-counting method

采用MTT染色计数方法进行细菌染色后取样,在波长400~700nm之间进行读数,取间隔范围为5nm的OD值,每份样品3个平行,结果如图1所示。

从图1可以看出,DMSO溶解的甲瓒晶体最大吸收峰出现在波长510nm处。由于酶标仪的精确度随OD值的增大而增大,为了实验的精确性,选择MTT染色计数法的最佳工作波长为510nm。

2.2 MTT染色液最佳加入量的确定

固定MTT染色液体积,改变待测菌液的加入量使得MTT染色液的加入量与待测菌液的体积比分别为1:1.25、1:2.5、1:3.75、1:5。在工作波长500~700nm之间读数OD值,验证MTT染色液的加入量对最佳工作波长的影响。实验设3个重复,结果如图2所示。

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图 2 MTT染色液加入量对OD值的影响

Fig.2 Effect of MTT solution content on OD value as a function of wavelength

从图2可以看出,不同MTT染色液加入量对OD值的影响显著,随着MTT染色液加入量比例的减小,OD值上升,OD值曲线的起伏变化加大。考虑到实验精确性,选择MTT染色液与待测菌液的混合比例比为1:5。从图2还可以看出,MTT染色液的加入量不影响OD值最大吸收峰,最佳工作波长仍然保持在510nm。

2.3 DMSO最佳加入量的确定

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图 3 DMSO加入量对OD值的影响

Fig.3 Effect of DMSO content on OD value as a function of wavelength

按MTT染色液与待测菌液1:5的混合比例进行实验,改变DMSO加入量使得待测菌液与DMSO体积比分别为1:0、1:1、1:2、1:3。在工作波长500~700nm之间进行测定。由于高浓度菌体下以体积比1:1加入DMSO时,已出现甲瓒晶体溶解困难的现象,因此从操作的可行性考虑,本实验不讨论DMSO加入量更少的情况,设3个重复实验,结果如图3所示。

如图3所示,DMSO溶剂的加入量对OD值的影响显著,DMSO溶剂加入量与所测菌液的比例为1:1时OD曲线变化加大,OD值更加显著,可能原因为增大DMSO的加入量促进了甲瓒的充分溶解。此外,从图3还可以看出,DMSO加入量对吸收峰有一定的影响,当不加入DMSO时,最佳吸收峰的位置从510nm移到了575nm波长处,并且此曲线与其他MTT染色所得曲线明显趋势不同。因此,选择DMSO溶剂加入量与所测菌液的比例为1:1,此时最佳工作波长保持为510nm。

2.4 染色时间的确定

将待测菌液用8.5g/L的无菌盐水分别稀释为1:0(原样)、1:0.25、1:0.5、1:0.75、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:16、1:32、1:64、1:128,然后进行MTT活菌测试,每个稀释度5个重复。同时,采用平板稀释计数法对各稀释度进行活菌计数。以染色时间为变量建立3个对照组,使得其在40℃条件下染色时间分别为1、2.5、4h。用两种活菌计数方法所得结果,以MTT法所得OD510nm值为X轴,平板稀释所得菌体浓度(109CFU/mL)为Y轴,得到不同染色时间(1、2.5、4h)条件下的标准曲线,如图4所示。

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图 4 不同MTT染色时间条件下的标准曲线

Fig.4 Effect of staining time on OD510nm value

从图4可以看出,MTT染色法所得OD510nm值与平板计数法所得菌体浓度(×109)呈线性关系。MTT染色法可以适用于MB 2-1的活菌计数。不同染色时间条件下的标准曲线的相关系数表明反应时间1h最佳,此时活菌与MTT染色液的反应已经充分,因此选定在40℃条件下1h染色培养。

2.5 MTT法可测量范围的确定

将经过平板稀释计数法确认菌体浓度在109CFU/mL的菌液用无菌盐水进行梯度稀释。得到菌体浓度在109、108、107、106、105、104、103CFU/mL范围内的样品。用MTT染色法测得这些样品的OD510nm值,每个梯度6个重复,结果如表1所示。

由表1可知,6组实验的平均值直观地表明了107~109CFU/mL菌液的OD510nm值与103~106CFU/mL菌液的OD510nm值有显著的差异。而后者的OD510nm值与96孔平底培养板空白的OD510nm值相同。由此可知,MTT染色计数方法只适用于107~109CFU/mL的瑞士乳杆菌液。

表 1 不同菌体浓度所得OD510nm

Table 1 OD510nm values of different concentrations of bacterial suspensions

实验组

菌液浓度/(CFU/mL)

109

108

107

106

105

104

103

1

0.650

0.305

0.215

0.043

0.042

0.042

0.042

2

2.050

0.345

0.215

0.042

0.044

0.044

0.042

3

2.770

0.475

0.210

0.035

0.035

0.035

0.036

4

1.362

0.198

0.051

0.037

0.035

0.033

0.034

5

1.075

0.177

0.050

0.040

0.043

0.038

0.039

6

2.640

0.282

0.044

0.046

0.046

0.047

0.045

平均值

1.760

0.297

0.131

0.041

0.041

0.040

0.040

 

 

2.6 MTT染色计数法数据处理与优化

由图4可知,3条标准曲线的R2均未达到0.99以上,所有数据点的分布显示出一定的规律,如图5所示。

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图 5 菌体浓度与OD510nm值的关系

Fig.5 The relationship between bacterial concentration and OD510nm

当OD510nm值小于0.5时,数据点的直线斜率比OD510nm值大于0.5的数据点的直线斜率明显偏大。为了提高实验精确度,考虑分区域制作标准曲线,如图6所示。

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A. OD510nm<0.5

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B. OD510nm>0.5

图 6 菌体浓度与OD510nm的关系

Fig.6 The relationship between bacterial concentration and OD510nm

由图6可知,当根据OD510nm值区间制作标准曲线时,相关系数更高,两者的R2都大于0.99。实验的精确程度得到提高。根据得到的两直线公式计算得到它们的重合点为(0.48,0.66×109)。因此,MTT染色计数方法的计算公式为:当OD510nm值小于0.5时,平板稀释计数法得菌体浓度/(109CFU/mL) = 1.267×OD510nm+0.044;而当所测OD510nm值大于0.5时,平板稀释计数法得菌体浓度/(109CFU/mL) = 0.335×OD510nm+0.493。通过后续的实验对该方法进行验证,证实了该方法的有效性和准确性。

3 结 论

本实验证明MTT染色法用于MB 2-1活菌计数方法是可行的。此计数方法前处理用3500r/min离心10min洗涤后收集菌体,重复2次此洗涤过程后制成菌悬液。其最佳工作条件为菌液1mL、MTT 0.2mL、培养温度40℃、反应时间1h、12000r/min离心10min收集甲瓒、DMSO 1mL、最佳工作波长510nm。所得到的OD510nm值通过以下标准直线求得活菌实际浓度:菌液浓度在107~109CFU/mL范围内,当OD510nm小于0.5时,平板稀释计数法得活菌数/(109CFU/mL)=1.267×OD510nm+0.044,而当所测OD510nm值大于0.5时,平板稀释计数法得活菌数(109CFU/mL)=0.335×OD510nm+0.493。两关系方程的相关系数均大于0.99。

参考文献:

[1] 袁飞, 徐宝梁, 陈颖, 等. 使用微孔板光谱分析仪和平板计数测定阪崎肠杆菌的生长[J]. 食品科学, 2008, 29(7): 281-285.

[2] 李娜肖, 凯军, 王兆梅, 等. MTT法测定甲壳低聚糖对肠道微生物生长的影响[J]. 食品科学, 2012, 33(3): 101-104.

[3] 黄菲, 罗曼. MTT比色法在抗肿瘤香精油筛选中的应用[J]. 食品科学, 2009, 30(1): 75-79.

[4] 邓黛青, 李光明, 周仰原, 等. FISH荧光原位杂交技术在污水生物脱氮研究中的应用[J]. 微生物学报, 2006, 33(2): 132-136.

[5] NORTON S, LACROIX C, VUILLEMARD J C. Effect of pH on the morphology of Lactobacillus helveticus in free cell batch and immobilized cell continuous fermentations[J]. Food Biotechnology, 1993, 7: 235-251.

[6] ADOLF W, JULES T, CHRISTOPHE L. Comparison of simple neural networks and nonlinear regression models for descriptive modeling of Lactobacillus helveticus growth in pH-controlled batch cultures[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26: 431- 445.

[7] 李冰冰, 肖波, 李蓓. FISH技术及其在环境微生物监测中的应用[J]. 生物技术, 2007(5): 94-97.

[8] WAGNER M. In situ analysis of nitrifying bacteria in sewage treatment plants[J]. Water Science Technology, 1996, 34: 237-244.

[9] 梁毓, 王树玉, 贾婵维. 荧光原位杂交技术的研究进展[J]. 中国优生与遗传杂志, 2005(5): 119-120.

[10] TIM M. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. Journal of Immunological Methods, 1983, 65: 55-63.

[11] MORGAN D, MORGAN T. MTT assay for cellular viability and activity[J]. Method of Molecular Biology, 1998, 79: 179-183.

[12] MICHAEL V, PATRIES M H A, TAN S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction[J]. Biotechnology Annual Review, 2005, 11: 127-152.

[13] CETIN Y, BULLERMAN L. Cytotoxicity of Fusarium mycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the MTT bioassay Fusarium mycotoxins[J]. Food and Chemical Toxicology, 2005, 43: 755-764.

[14] 汪志荣, 高琼, 马传鑫, 等. MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究[J]. 环境科学学报, 2011, 31(12): 2642-2650.

[15] 杨翠云, 刘永. MTT方法评价微生物细胞活性的探讨[J]. 水生物学报, 2009, 33(4): 577-580.

[16] 黄立坤, 杜鹏, 霍贵成. MTT法测定乳酸菌活菌数的研究[J]. 食品工业, 2008(4): 62-64.

[17] 杨浩, 王春婷, 吴玉梅, 等. MTT试验中细胞特性状态及细胞数与OD值的关系探讨[J]. 动物医学进展, 2002, 23(5): 49-51.

[18] 杨翠云, 刘永. MTT方法评价微生物细胞活性的探讨[J]. 水生物学报, 2009, 33(4): 577-580.

[19] 魏鸿刚, 李元广, 刘健, 等. 一种快速的活菌计数新方法研究[J]. 微生物学通报, 2002, 29(2): 89-93.

[20] 王忠朝, 范丽苑, 蔡祎, 等. MTT法用于检测伴放线嗜血菌的研究[J]. 现在医药卫生, 2010, 26(8): 1121-1123.

 

收稿日期:2012-10-22

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31371807);国家自然科学基金青年科学基金项目(31201422);

国家“863”计划项目(2011AA100903;2013BAD18B01-4);国家农业科技成果转化资金项目(2012GB23600639);

江苏省自然科学基金项目(BK2011651);教育部博士点基金新教师类课题(20110097120028);

江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

作者简介:杨培洁(1987—),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail:peijie_yang@163.com

*通信作者:董明盛(1961—),男,教授,博士,研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail:dongms@njau.edu.cn