中国传统发酵豆豉中生物胺含量

胡 鹏1，索化夷1，阚建全1,2,3,*，陈光静1，胡国洲1

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；

3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400715)

摘 要：采用高效液相色谱法对中国传统发酵豆豉中生物胺的含量进行测定。结果表明，豆豉样品提取液经苯甲酰氯柱前衍生后，其腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、精胺、亚精胺、组胺、酪胺于25min内在Agilent XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5µm)上能得到很好分离，各生物胺质量浓度在1.0～80µg/mL时其与相应峰面积有良好的线性关系；最低检测限(以信噪比大于3计)：腐胺、色胺、精胺0.10µg/mL，尸胺、组胺0.03µg/mL，2-苯乙胺、亚精胺、酪胺0.05µg/mL，样品加标各生物胺的回收率均为96.80%～106.10%。该方法快速、灵敏、重复性好，能够满足中国传统发酵豆豉中生物胺的检测需要。结果表明中国传统发酵豆豉中所含生物胺的种类及含量因豆豉的品种而异，8种生物胺总量的范围为101.07～427.19mg/kg。

关键词：中国传统发酵豆豉；生物胺；高效液相色谱法

Biogenic Amine Content of Traditionally Fermented Douchi

HU Peng1，SUO Hua-yi1，KAN Jian-quan1,2,3,*，CHEN Guang-jing1，HU Guo-zhou1

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Key Laboratory of Produce

Processing and Storage, Chongqing 400715, China；3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract：A method for detecting the content of biogenic amine in traditionally fermented Douchi by HPLC was developed. The method was based on a reversed-phase column (Agilent XDB C18 column, 250 mm × 4.6 mm × 5 µm) for pre-column derivatization with benzoyl chloride. Douchi samples were separated by HPLC using gradient elution (methanol and ultra pure water), and detected with a UV-visible detection at 254 nm. The method allowed simultaneous determination of 8 amines in less than 25 min including putrescine, cadaverine, tryptamine, 2-phenyl-ethylamine, spermidine, spermine, histamine and tyramine. A good linearity for each amine was observed between 1 µg/mL and 80 µg/mL. The detection limits ranged from 0.03 to 0.10 µg/mL. The average recovery rate for biogenic amines in traditionally fermented Douchi was 96.80%–106.10%. Due to its high sensitivity, precision and repeatability, the developed method was feasible for the determination of biogenic amines in traditionally fermented Douchi. Our results indicated that biogenic amine types and contents varied among different traditionally fermented Douchi. The variation of total biogenic amine in traditionally
fermented Douchi was 101.07–427.19 mg/kg.

Key words：traditionally fermented Douchi；biogenic amines；high performance liquid chromatography (HPLC)

中图分类号： TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0108-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320021

生物胺是生物体内基本的含氮化合物之一，主要由食品微生物体内的游离氨基酸脱羧而成[1]。生物胺是动物、植物和多数微生物体内的生理物质，在机体生命活动中发挥着重要作用。高浓度的生物胺会严重影响食品风味甚至改变其成分，还会对人体产生严重的危害作用，造成人体神经系统和心血管系统损伤[2-3]。食品中生物胺的存在还是一些食品新鲜程度和被微生物污染程度的标志，是预测某些食品成熟程度和加工过程是否遵循“良好操作规范”的依据，对生物胺进行研究和认识可以提高和改善食品的质量和安全[4]。因此，近年来食品中生物胺的毒性和检测方法倍受关注和重视，一些国家对食品中个别生物胺含量还制定了限量标准[5-7]。

豆豉是以黄豆或黑豆为主要原料，利用毛霉、曲霉和细菌蛋白酶的作用，分解大豆蛋白质，达到一定程度时，采用加盐、加酒、干燥等方法，抑制酶的活力，延缓发酵过程而制成。按豆豉生产时参与发酵的微生物不同，豆豉可以分为毛霉型豆豉、细菌型豆豉、米曲霉型豆豉和根霉型豆豉四大类。我国主要生产毛霉型豆豉、曲霉型豆豉和细菌型豆豉。国外以日本纳豆和印度尼西亚的丹贝最为著名。豆豉不仅具有良好的风味，而且具有营养价值高、人体易消化吸收等特点[8]。豆豉中生物胺类物质一直受到食用安全性的质疑，然而中国传统发酵豆豉制品中生物胺的研究报导很少。因此，测定中国传统发酵豆豉中生物胺的含量具有十分重要的意义，将为中国传统发酵豆豉制品中生物胺的安全风险评估提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆豉样品：分别购于重庆、贵州、云南、湖南和广东的超市(表1)。

表 1 中国传统发酵豆豉样品名称、种类及产地

Table 1 The type and origin of traditionally fermented Douchi

腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、酪胺、苯甲酰氯(纯98%以上) 美国Sigma公司；甲醇(色谱级) 天津四友精细化工厂；高氯酸、盐酸(均为分析纯) 重庆川东化工有限公司；氢氧化钠、氯化钠(均为分析纯) 成都科龙化工试剂厂；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-10A高效液相色谱仪(含紫外检测器) 日本岛津公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；可调式氮吹仪 北京中诺远东公司；微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；台式高速离心机 德国Eppendorf公司；移液枪 上海汉林实验仪器有限公司；FS-2可调高速匀浆机 江苏金坛科析仪器有限公司；DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的衍生

2mL生物胺标准混合溶液，加入1mL 2mol/L NaOH溶液，10µL苯甲酰氯，然后旋涡振荡30s，置于30℃水浴条件下避光反应40min，期间每隔10min振荡1次。反应完后用2mL饱和NaCl溶液中断反应。然后用3mL乙醚萃取，1200r/min离心10min，用移液枪移取乙醚层，再重复1次，将乙醚层移置于规格为10mL的离心管中，35℃条件下氮气吹干，然后用1mL甲醇(色谱级)溶解，微滤(0.45µm)后用于测定生物胺含量[9]。

1.3.2 标准生物胺溶液的配制及标准曲线的绘制

准确称取腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、酪胺各50mg，用0.1mol/L的HCl溶液定容至50mL，制成标准储备液备用。

分别取以上标准储备液，用0.1mol/L HCl溶液配制成终质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10、20、40、80µg/mL的混合标准溶液。然后按1.3.1节方法进行衍生处理和分析，并绘制标准曲线。

1.3.3 样品预处理

称取10.0g用研钵研磨均匀的豆豉样品，置于100mL离心管中，加20mL 0.4mol/L HClO4溶液分散，用匀浆机匀浆1min，振荡提取5min，静置5min，然后6800r/min离心30min；将上清液移入50mL容量瓶中，用20mL HClO4溶液重复提取1次，上清液合并，用0.4mol/L HClO4溶液定容至50mL，取2mL该溶液按1.3.1节中的方法衍生处理。

1.3.4 高效液相色谱分析条件[10]

色谱柱为Agilent XDB-C18(250mm×4.6mm，5µm)，流动相A为超纯水，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱，洗脱程序见表2。流速1.0mL/min，紫外检测波长254nm，进样量20µL。

表 2 梯度洗脱程序

Table 2 Gradient elution program

1.4 数据处理

所有实验均重复3次，利用Excel程序对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 生物胺的HPLC测定方法验证实验

由图1可知，各种生物胺标准品在液相色谱上分离效果好、出峰速度快，25min内8种生物胺衍生物全部岀峰。其中，腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亚精胺、精胺、组胺、酪胺的保留时间分别为7.068、8.144、9.826、11.490、12.778、18.346、20.359、23.980min。

1.腐胺；2.尸胺；3.色胺；4. 2-苯乙胺；5.亚精胺；6.精胺；7.组胺；8.酪胺。下同。

图 1 生物胺标准品的液相色谱图

Fig.1 Chromatogram of biogenic amine standards

图 2 豆豉样品中生物胺的液相色谱图

Fig.2 Chromatograms of a Douchi sample

由图2可知，豆豉样品中生物胺在液相色谱上分离效果也很好，可由生物胺标准品图谱的保留时间来确定每种生物胺。

表 3 HPLC法测定生物胺的特征指标

Table 3 Analytical characteristics of biogenic amines detected by HPLC

由表3可见，8种生物胺的峰面积与其相应质量浓度1.0～80µg/mL范围内呈良好的线性关系，其R2均在0.9931～0.9997之间。以信噪比大于3作为判断标准，腐胺、色胺、精胺的检测限为0.10µg/mL，尸胺、组胺的检测限为0.03µg/mL，2-苯乙胺、亚精胺、酪胺的检测限为0.05µg/mL。方法的重复性是通过将生物胺标准样品重复测定8次，其结果是各种生物胺RSD在1.40%～7.59%之间，均小于10%，表明具有良好的重复性。

由表4可知，8种生物胺的回收率均在96.80%～106.10%之间，可见该方法回收率高，准确度高。

表 4 8种生物胺的回收率测定(n=7)

Table 4 Recovery tests for eight biogenic amines (n=7)

2.2 中国传统发酵豆豉样品中生物胺的种类和含量

表 5 豆豉中的生物胺含量

Table 5 Contents of biogenic amines in Douchi

mg/kg

注：每个样品检测3次；ND.未检测到。

由表5可知，生物胺的种类和含量因豆豉的品种而异，每1种豆豉样品中至少含有5种生物胺，只有精胺、亚精胺和酪胺在部分豆豉样品中不能检出。腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亚精胺、精胺、组胺、酪胺以及生物胺总量在豆豉中的含量范围分别为：16.34～136.12、16.47～154.42、19.56～35.22、26.53～87.88、ND～29.03、ND～29.42、7.79～64.45、ND～29.51、101.07～427.19mg/kg。有研究表明，已经发现一些因素可以影响组胺的形成。例如，4℃的低温保藏不利于组胺的形成，这是因为生成生物胺的嗜温细菌生存所需要的温度高于14℃，且组氨酸脱羧酶的最适温度为30℃[11]。生物胺含量的高低可被视为发酵过程中微生物污染的指标，因为生物胺的形成与污染微生物(乳酸细菌)的存在紧密相关 。同时，生物胺的形成还可能与原料的来源、加工条件密切相关。

图 3 中国传统发酵豆豉中不同生物胺平均含量的比较

Fig.3 Average contents of various biogenic amines in traditionally fermented Douchi

由图3可见，18种中国传统发酵豆豉中腐胺的平均含量高于其他生物胺的平均含量，而精胺的平均含量为最低。腐胺、尸胺、2-苯乙胺、组胺和色胺是中国传统发酵豆豉中的主要生物胺，这5种单体生物胺在所有豆豉样品中都能检出，酪胺、亚精胺和精胺的检出率分别为94%、67%和33%。8种生物胺中毒性最强的是组胺，研究发现尸胺和酪胺可以增强组胺的毒性作用，这是因为尸胺和酪胺能够抑制肠道中二胺氧化酶和组胺-N-甲基转移酶的活性，从而增强组胺的毒性作用[12-14]。腐胺和尸胺还可以和亚硝酸盐反应生成致癌物质亚硝胺，并粘附一些肠黏膜上的肠道致病菌[15]。

图 4 不同种类中国传统发酵豆豉样品中生物胺的比较

Fig.4 Comparison of various biogenic amines in different types of traditionally fermented Douchi

由图4可见，毛霉型、细菌型和曲霉型3类传统发酵豆豉样品的8种生物胺的平均含量有明显差别。毛霉型豆豉中除亚精胺平均含量高于曲霉型豆豉外，其余7种生物胺平均含量均低于细菌型和曲霉型豆豉；曲霉型豆豉除色胺和亚精胺平均含量低于毛霉型和细菌型豆豉外，其余6种生物胺平均含量均高于毛霉型和细菌型豆豉。3类中国传统发酵豆豉中总生物胺平均含量的变化也较大，其中毛霉型豆豉中总生物胺平均含量为128.34mg/kg，细菌型豆豉总生物胺平均总量为198.19mg/kg，曲霉型豆豉总生物胺平均总量为245.28mg/kg，这可能是由于3类中国传统发酵豆豉的生产工艺和微生物种类不同的原因所致，不过还有待于进一步研究。

生物胺的毒性与人体摄入生物胺的剂量、其他生物胺的联合效应、胺氧化酶的活性以及个人肠道生理功能等有关[16-17]。因此，生物胺的安全限量难以确定。美国食品药品监督局规定了水产品中组胺含量为不得超过50mg/kg[18]。Nout等[19]认为发酵食品中2-苯乙胺含量在30mg/kg以上就可对人体构成潜在的危险。Santos[20]认为食品中总生物胺的含量超过1000mg/kg会对人体健康产生极大威胁。在18种中国传统发酵豆豉样品中，94%的豆豉中组胺的含量都低于50mg/kg，而只有38%的豆豉中2-苯乙胺的含量低于30mg/kg，但生物胺总量均低于1000mg/kg。

3 结 论

本研究采用高效液相色谱-紫外检测方法，苯甲酰氯衍生，梯度洗脱测定中国传统发酵豆豉中生物胺，能使8种生物胺在25min内良好分离。该方法快速、灵敏、重复性好，能够满足豆豉中生物胺的检测需要。采用该法测定了中国传统发酵豆豉中的生物胺含量，结果表明中国传统发酵豆豉中所含生物胺的种类及含量因豆豉的品种而异，8种生物胺总量范围为101.07～427.19mg/kg。因此需进一步研究不同的发酵工艺、储存条件和储存时间等因素对中国传统发酵豆豉制品中生物胺合成的影响，为确保中国传统发酵豆豉制品的食用安全性提供理论依据。

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