抑制氧化罗丹明B光度法测定贝类中牛磺酸含量

李咏梅1,2，李人宇3,*，施鹏飞2

(1.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏 连云港 222005；

2.淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005；3.连云港师范高等专科学校，江苏 连云港 222006)

摘 要：在pH11.0氨-氯化铵缓冲溶液中，痕量牛磺酸能抑制高锰酸钾氧化罗丹明B的反应，使体系吸光度明显减小，据此建立了分光光度法测定牛磺酸的新方法。最大褪色波长为760nm，体系的褪色程度与牛磺酸质量浓度在0～100μg/L范围内呈线性关系，表观摩尔吸光系数为1.07×106L/(mol•cm)，检出限为2.25μg/L。方法用于测定缢蛏、文蛤、四角蛤蜊和菲律宾蛤仔中牛磺酸含量，结果与高效液相色谱法一致，相对标准偏差为0.76%～1.08% (n=6)，回收率为96.93%～102.40%。

关键词：牛磺酸；分光光度法；罗丹明B；贝类

Spectrophotometric Determination of Taurine in Shellfish Using Inhibition of Rhodamine B Oxidation

LI Yong-mei1,2，LI Ren-yu3,*，SHI Peng-fei2

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；

2. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；

3. Lianyungang Teacher’s College, Lianyungang 222006, China)

Abstract：A novel method for the spectrophotometric determination of taurine was developed. The method was based on the inhibitory effect of trace taurine on the reaction of potassium hypermanganate oxidizing rhodamine B in ammonium chloride/ammonia buffer solution at pH 11.0, resulting in an obvious decrease in the absorbance. The maximum detection wavelength for fading reaction was 760 nm. A linear relationship was observed between the fading grade and the concentration of taurine in the range of 0–100 μg/L with an apparent molar absorption coefficient of 1.07 × 106 L/(mol•cm) and the detection limit was 2.25 μg/L. This method was applied to determine taurine in Sinonovacula constricta, Meretrix meretrix, Mactra veneriformis and Ruditapes philippinarum. The results revealed good agreement with those obtained by high performance liquid chromatography (HPLC). The relative standard deviations were 0.76%–1.08% (n = 6), and the average recovery rates were 96.93%–102.40%.

Key words：taurine；spectrophotometry；rhodamine B；shellfish

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0117-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320023

牛磺酸是人体内一种条件性必需氨基酸，具有重要的生理功能，能促进大脑发育、提高神经传导和视觉机能、维持正常生殖功能、防治心血管病、调节渗透压、增强免疫力、调节脂类吸收、影响糖代谢、抗氧化、抗衰老等[1-5]。人体内适量的牛磺酸可起到积极作用，但过量牛磺酸会抑制体内其他营养物质的吸收，造成体内营养失衡[5]。人体内的牛磺酸主要来源于食品，海洋贝类的牛磺酸含量丰富，是人体补充牛磺酸的经济来源。因此，准确测定贝类中的牛磺酸含量具有重要意义。

目前，国内外牛磺酸的测定方法有高效液相色谱法[6-9]、薄层扫描法[6,10-11]、氨基酸分析仪法[12-13]、荧光法[14-15]、分光光度法[16-18]等。其中分光光度法具有仪器价格低廉、操作简便、易于推广普及等特点，但在牛磺酸测定方面很少应用。已报道的分光光度法存在灵敏度较低、显色反应条件苛刻等不足。本研究拟利用痕量牛磺酸对高锰酸钾在氨-氯化铵缓冲溶液中氧化罗丹明B的反应具有显著抑制作用，通过优化反应条件，建立分光光度法测定贝类中牛磺酸含量，为贝类中牛磺酸资源的研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

缢蛏(新鲜)、文蛤(新鲜)、四角蛤蜊(新鲜)和菲律宾蛤仔(新鲜) 市购。

牛磺酸(纯度99.8%) 中国食品药品检定研究院；氨水、氯化铵、高锰酸钾、罗丹明B(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

牛磺酸标准溶液：精密称取0.0500g牛磺酸，加水溶解后移入50mL容量瓶中配制成1.0mg/mL牛磺酸标准储备液，于冰箱4℃保存。实验时稀释为0.5μg/mL牛磺酸标准工作液；氨-氯化铵缓冲液：pH11.0[19]；高锰酸钾溶液：1.0×10-2mol/L；罗丹明B溶液：5.0×10-4mol/L。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

WFJ7200型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器公司；HH-2数字恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SYZ-550石英亚沸高纯水蒸馏器 江苏金坛市白塔石英玻仪厂。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将购买来的新鲜缢蛏、文蛤、四角蛤蜊和菲律宾蛤仔在清水中分别浸泡4h以上，去除杂质，去壳，沥干。准确称取4种新鲜贝肉各25.0g，分别置匀浆机中制浆，加适量水煮沸1h，双层纱布过滤。残渣再加适量水煮沸1h，过滤，合并2次滤液，用水定容至500mL[20]。精密吸取2.0mL于离心管中，加入2.0mL 60g/L磺基水杨酸，混匀，静置10min，4000r/min离心15min，弃去蛋白质沉淀，上清液用滤纸过滤，滤液通过0.45μm滤膜后，滴加氢氧化钠溶液调节滤液pH4～5，将其通过001×7强酸性阳离子交换柱，控制流速1.5mL/min，用50mL水洗脱，弃去最初流出液，用1L容量瓶收集后面流出液，用水定容摇匀，过滤，得样品溶液。

1.3.2 实验步骤

在两支10mL比色管中，都加入1.8mL pH11.0氨-氯化铵缓冲液、2.5mL 1.0×10-2mol/L高锰酸钾溶液和1.0mL 5.0×10-4mol/L罗丹明B溶液，再向其中一支加入一定量牛磺酸标准工作液或样品溶液，另一支不加(试剂空白)，用水定容并摇匀，室温条件下反应6min。以水为参比，用1cm比色皿在波长760nm处分别测量试样溶液的吸光度A和试剂空白的吸光度A0，并计算ΔA=A0－A。

2 结果与分析

2.1 测定条件的优化

2.1.1 测定波长的选择

按实验步骤，在600～1000nm波长范围内扫描体系的吸收光谱，由图1可知，以水为参比，在pH11.0氨-氯化铵缓冲液中，罗丹明B溶液的最大吸收峰位于620nm波长处(曲线1)；高锰酸钾溶液的最大吸收峰位于630nm波长处(曲线2)；当两者混合后，最大吸收峰位于630nm波长处，体系吸光度显著增大(曲线3)；当牛磺酸加入其中后最大吸收峰仍位于630nm波长处，但体系吸光度明显减小(曲线4)，若以试剂空白为参比，最大吸收峰则位于760nm波长处(曲线5)，故选择760nm为测定波长。

1.罗丹明B溶液(以水为参比)；2.高锰酸钾溶液(以水为参比)；3.罗丹明B-高锰酸钾溶液(以水为参比)；4.罗丹明B-高锰酸钾-牛磺酸溶液(以水为参比)，ρ(牛磺酸) = 50μg/L；5.罗丹明B-高锰酸钾-牛磺酸溶液(以试剂空白为参比)，ρ(牛磺酸) = 50μg/L。

图 1 吸收光谱

Fig.1 Absorption spectra

2.1.2 酸度的影响

图 2 pH值(A)和缓冲液用量(B)对吸光度的影响

Fig.2 Effect of pH on absorbance

分别考察了盐酸-乙酸钠(pH1.99～4.19)、乙酸-乙酸钠(pH3.6～5.7)、乙酸铵(pH7.0)、氨-氯化铵(pH7.5～11.0)缓冲液、氢氧化钠(pH11、12)和氢氧化钾(pH13.7)溶液对反应体系的影响。实验结果表明，酸度直接影响反应的进程以及体系的稳定性。由图2A可知，以pH11.0氨-氯化铵缓冲液控制体系酸度时，痕量牛磺酸对高锰酸钾氧化罗丹明B显色反应的抑制作用最明显，即ΔA值最大。如图2B所示，当缓冲液用量在1.8mL时，ΔA值最大。故实验选用1.8mL pH11.0氨-氯化铵缓冲液。

2.1.3 高锰酸钾溶液用量的影响

分别考察5.0×10-2、1.0×10-2、1.0×10-3mol/L这3种浓度的高锰酸钾溶液对反应体系的影响，结果表明，加入5.0×10-2mol/L高锰酸钾溶液，反应体系不稳定，ΔA值变化太快，难以准确测定；加入1.0×10-3mol/L高锰酸钾溶液，氧化罗丹明B反应不充分，痕量牛磺酸对此氧化反应的抑制作用不明显，导致ΔA值过小；而加入1.0×10-2mol/L高锰酸钾溶液效果最佳。如图3所示，当用量在2.5mL时，ΔA值最大且相对恒定。选用2.5mL高锰酸钾溶液。

图 3 高锰酸钾溶液用量对吸光度的影响

Fig.3 Effect of buffer solution dosage on absorbance

2.1.4 罗丹明B溶液用量的影响

考察5.0×10-4mol/L罗丹明B溶液加入量对吸光度的影响，图4结果显示，当罗丹明B溶液加入量为1.0mL时，ΔA值最大，实验选用加入1.0mL罗丹明B溶液。

图 4 罗丹明B溶液用量对吸光度的影响

Fig.4 Effect of potassium hypermanganate dosage on absorbance

2.1.5 反应温度的影响

反应温度对体系吸光度的影响情况如图5所示。当反应温度在10～25℃时，抑制与氧化反应速率均增大，且抑制反应速率大于氧化反应速率，牛磺酸的抑制作用增强，ΔA值达到最大；当反应温度在30～60℃时，抑制与氧化反应速率继续增大，但抑制反应速率小于氧化反应速率，牛磺酸抑制作用减弱，ΔA值减小。当温度在70～100℃时，空白溶液中产生大量的细小颗粒并絮集形成沉淀。为了确保体系稳定和测定的灵敏度，选择室温(10～25℃)为反应温度。若室温太高，实验需在恒温槽控温条件下进行，以保证测定的灵敏度。

图 5 反应温度对吸光度的影响

Fig.5 Effect of rhodamine B dosage on absorbance

2.1.6 反应时间与稳定性

反应时间对体系吸光度的影响情况如图6所示。室温条件下反应一开始，ΔA值随着反应时间的延长而增大，当反应6min时，吸光度达到最大，而在6min以后吸光度减小，故固定反应时间为6min进行测定。在0～6min内，ΔA值与反应时间(t)有良好的线性关系，其线性回归方程ΔA = 0.1443t＋0.0283，相关系数r = 0.9968。

图 6 反应时间对吸光度的影响

Fig.6 Effect of reaction temperature on absorbance

2.2 标准曲线与检出限

图 7 标准曲线

Fig.7 Effect of reaction time on absorbance

在一组10mL比色管中，分别准确加入0.5μg/mL牛磺酸标准工作溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL。按1.3.2节方法测量体系吸光度，绘制标准曲线，如图7所示。吸光度与牛磺酸质量浓度在0～100μg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为ΔA = 0.0088ρ＋0.0041，相关系数r = 0.9994。表观摩尔吸光系数为ε760nm=1.07×106L/(mol•cm)。重复11次测定试剂空白溶液的吸光度，求得标准偏差s = 6.59×10-3，按式DL=3s/k (式中，k为斜率)计算出方法检出限为2.25μg/L，显著低于GB/T 5009.169—2003《食品中牛磺酸的测定》中高效液相色谱法和薄层色谱法的检出限(80mg/kg(L))[6]。

2.3 共存物质的影响

测定体系中常见物质的允许倍量如下：蔗糖、葡萄糖(10000)，磺基水杨酸(2500)，可溶性淀粉(1000)，抗坏血酸、柠檬酸、柠檬酸三钠、草酸、草酸钠、Hg2+、Al3+(500)，尿素、K+、SO42－(400)，Na+、NH4+、Ag+、Mn2+、Cl－、F－、CO32－、HCO3－(200)，β-环糊精、Cu2+、Ni2+、Co2+、Cr3+、Pb2+、Br-、IO3－、PO43－(100)，Ba2+(80)，Zn2+、Mg2+、Cd2+(60)，Fe2+、Fe3+、Sn4+、I－、NO2－、SO32－、S2O32－、Se(Ⅳ)、Mo(Ⅵ)、V(Ⅴ)、Cr2O72－(50)，苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸(20)，脯氨酸、谷氨酸、白氨酸、甘氨酸(10)，精氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸(5)。实验表明，大量的糖类、盐类、氧化性和还原性物质对测定无明显影响，仅精氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸对测定有干扰。而氨基酸的干扰可用阳离子交换树脂分离除去，简单样品则可以不经分离直接测定。在最佳条件下，对100μg/L牛磺酸进行测定，相对误差均在±5%范围内，因此方法有良好的选择性。

2.4 样品分析

表 1 样品中牛磺酸的测定结果(n=6)

Table 1 Comparison of the results obtained by HPLC and the spectrophotometric method for the determination of taurine in samples (n=6)

表 2 加标回收实验结果

Table 2 Results of spiked recovery rate tests

按1.3.1节方法处理样品，分别精密吸取0.5～1.0mL样品溶液于10mL比色管中，按1.3.2节方法测定牛磺酸含量，并与GB/T 5009.169—2003的高效液相色谱法(HPLC)[6]对照，结果见表1，相对标准偏差为0.76%～1.08%(n=6)。然后在样品中加入一定量标准工作溶液，按1.3.1节方法处理，并测定其牛磺酸含量，加标回收实验结果见表2，回收率为96.93%～102.40%。

3 结 论

本实验根据痕量牛磺酸对高锰酸钾在氨-氯化铵缓冲溶液中氧化罗丹明B的反应具有显著的抑制作用，对反应条件进行优化，结合离子交换树脂分离技术，建立了分光光度法测定贝类中牛磺酸，检出限(2.25μg/L)显著低于国标法(80mg/kg(L))。该方法测定牛磺酸含量的结果与国标法-高效液相色谱法的测定结果一致，RSD为0.76%～1.08%，回收率为96.93%～102.40%，方法灵敏、准确、简便、快速、重复性和选择性好，无环境污染，有推广应用价值。

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