SPME-GC-MS分析高粱-大豆丹贝和大豆丹贝中的挥发性成分 丁 一,肖 愈,黄 瑾,李 伟,董明盛* (南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)
摘 要:应用本实验室分离出的少孢根霉RT-3(Rhizopus oligosporusaito RT-3)发酵大豆及高粱-大豆混合物制得大豆丹贝和高粱大豆丹贝。采用固相微萃取法(SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测丹贝中挥发性化合物。结果表明:大豆丹贝含有18种挥发性化合物,而高粱大豆丹贝中检测出20种挥发性化合物,除了包括大豆丹贝中检测出的挥发性物质外,还检出3-羟基-2-丁酮、反式石竹烯2种特有的挥发性成分。2种丹贝中都含有类似蘑菇香味的1-辛烯-3-酮成分,推测该物质可能形成丹贝的典型香味。 关键词:少孢根霉RT-3;大豆丹贝;高粱-大豆丹贝;固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术;挥发性成分
Analysis of Volatile Components in Soybean and Soybean-Sorghum Tempeh by SPME-GC-MS
DING Yi,XIAO Yu,HUANG Jin,LI Wei,DONG Ming-sheng* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract:The flavor components in soybean tempeh and soybean-sorghum tempeh fermented by Rhizopus oligosporusaito RT-3 were analyzed by SPME-GC-MS. Results showed that 18 volatile components were detected in soybean tempeh, while 20 were detected in soybean-sorghum tempeh. 3-Hydroxy-2-butanone and trans-caryophyllene were detected only in soybean-sorghum tempeh. 1-Octen-3-ol, which was responsible for a mushroom-like aroma was detected in both kinds of tempeh. Key words: Rhizopus oligosporusaito RT-3;soybean tempeh;soybean-sorghum tempeh;solid-phase micro-extraction (SPME)-gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS);volatile components 中图分类号:TS252.54 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0131-04 doi:10.7506/spkx1002-6630-201320026 丹贝是大豆经浸泡、蒸煮、调酸后经霉菌发酵而成的豆制品[1],起源于印度尼西亚,具有蛋白含量高、易被消化吸收、富含丰富的维生素、矿物质、卵磷脂及大豆异黄酮等特点[2-3]。它因结构、口感与肉类相似,深受素食者喜爱,被称作“肉的替代品”,是素食者的福音[4]。在印度尼西亚,丹贝被作为主食来食用,特别是生活在爪哇岛居民,他们每日三餐几乎都食用它。据估计,爪哇岛人平均每日食用丹贝量达30~120g。由于丹贝不仅营养丰富,有一定保健功能,又具有鲜美的风味,20世纪50年代末就引起西方各国科学家的关注,生产技术也随之传入西方,并得到发展[5]。本实验室于20世纪80年代末开始对丹贝进行研究,分离出适用于丹贝发酵的少孢根霉RT-3(Rhizopus oligosporusaito RT-3,以下简称为RT-3)菌株,建立了丹贝生产新工艺并对丹贝的营养及健康功效进行了深入研究。近年来,本实验室利用RT-3优良菌种研制出高粱大豆混合丹贝,不仅丰富了大豆丹贝的品种,也为我国高粱资源的利用提供了新途径,解决了一直以来高粱利用率低的问题[6]。固相微萃取技术(solid-phase micro-extraction,SPME)[7]是一项新型的试样分析前处理技术,具有无需溶剂、取样灵活、灵敏度高、操作方便等特点,可直接与气相色谱-质谱(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)联用,从而达到对于小分子质量、高挥发性和大分子质量、高沸点的化合物具有较低检出限的目的[8-9],适用于大豆制品风味研究[10]。目前,国内外对大豆发酵品风味物质的研究主要集中在豆豉[11-13]、豆酱[14-16]、纳豆[17]等产品的研究。对于丹贝风味物质的研究报道较少,而高粱丹贝则未见报道。本研究利用固相微萃取技术对大豆、高粱-大豆发酵前后样品进行挥发性风味物质富集,用GC-MS进行组分分析,旨在了解少孢根霉的发酵对于风味成分形成的作用,以及两种丹贝的主要风味物质组成与特点。 1 材料与方法 1.1 材料 大豆、高粱 市售;Rhizopus oligosporusaito RT-3为本实验室分离保存。 1.2 仪器与设备 SPME手动进样柄及75µm carboxen/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS)萃取头 美国Supelco公司;1200L型气相色谱-质谱联用仪、VF-5ms石英毛细管柱(30m×0.25mm,0.25µm) 美国瓦里安公司。 1.3 方法 1.3.1 丹贝制作工艺流程 将高梁与大豆浸泡12h并分别蒸煮一定时间后沥水晾干,按大豆、高粱质量比为2:1将二者混合,加入1%乳酸及2%发酵剂充分搅拌混合,装入带有小孔的保鲜袋中,置于培养箱发酵30h即得新鲜丹贝。大豆丹贝制作流程与高粱-大豆丹贝类似,不加入高粱在合适条件下发酵即可。
1.3.2 固相微萃取提取风味成分 称取5g鲜丹贝样品于20mL螺口玻璃瓶中,用聚四氟乙烯隔垫密封,于60℃条件下加热30min,插入75µm CAR/PDMS萃取头顶空取样30min,插入GC进样口解吸5min。 1.3.3 检测条件 GC条件:色谱柱:VF-5ms石英毛细管柱(30m×0.25mm,0.25µm)。采用程序升温方式,程序升温由常温升至40℃,保持3min,以6℃/min 升温速率升至120℃,再以10℃/min升至250℃保持10min;汽化室温度250℃;载气为He,流速1mL/min;不分流进样。 MS条件:电子电离离子源;发射电流200μA;电子能70eV;接口温度250℃;源温度200℃;电子倍增器电压350V;质量扫描范围:m/z 33~450;扫描速率:5.0 seans/s。 1.3.4 数据处理 样品经GC-MS石英毛细管柱程序升温分离,采集到总离子流图,各谱峰相应的质谱图由Xcalibur软件系统完成,未知化合物经计算机检索的同时与NIST 谱库和Wiley谱库相匹配,当正反匹配度均大于800(最大值1000)时参考文献[18]及标准图谱[19]确认鉴定结果,按照各组分峰面积归一化法计算各组分相对含量。 2 结果与分析 2.1 4种样品中总离子流图及挥发性化合物组成分析
A.大豆;B.大豆丹贝;C.高粱-大豆;D.高粱-大豆丹贝。 图 1 不同样品GC-MS总离子流图 Fig.1 Ion chromatogram of 4 different samples by GC-MS 采用SPME富集大豆、高粱-大豆、大豆丹贝、高粱-大豆丹贝风味物质,并用GC-MS进行分离鉴定。不同样品的总离子流图见图2。 经GC-MS检测,在4种样品共检出23种风味成分,经鉴定,4组样品中的各种化合物的种类如表1所示。 表 1 4组样品中挥发性成分的GC-MS分析结果 Table 1 Volatile components of 4 different samples analyzed by GC-MS method
注:—.未检出。下同。
在4组样品中均能检出的挥发性物质有8种,分别为丙酮、正乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、己醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、乙酸。两种不同基质的未发酵样品检测出的挥发性成分基本相同,但是其主要成分及其含量差别较大,与发酵产品相比,甲酸己酯及二丁醚两种化合物仅能在未发酵产品中检出。此外,两种不同基质的丹贝中均能检出的挥发性物质有18种,分别为丙酮、正乙醇、乙酸乙酯、2-丁酮、2-丁烯醛、乙酸丁酯、己醛、异戊醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、1-辛烯-3-酮、2-羟基-丙酸、乙酸、2,3-丁二醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇、3-甲氧基-4H-吡喃-4-酮、棕榈酸乙酯、癸醛。挥发性物质成分最丰富的样品为高粱-大豆丹贝,共检出20种挥发性物质,其中有3种物质仅能在高粱-大豆丹贝中检出,分别为3-羟基-2-丁酮、壬醛和反式石竹烯。4组样品中各挥发性化合物相对含量总体变化见表2。 表 2 不同样品中挥发性化合物的相对含量 Table 2 The relative contents of volatile components in 4 different samples
由表2可知,4种样品主要含有以下风味物质:醇、醛、酮、酯、烯、酸、醚、吡喃酮。从表2结果看,2种未发酵样品的挥发性物质组成基本相同,但是大豆未发酵样品中醇类物质为主要成分,相对含量高达81.92%,高粱-大豆未发酵样品中挥发性成分也主要为醇类,但是与其他成分含量差别不大,为35.15%,醛类仅次于醇类,含量为26.62%。两种发酵后样品风味物质组成及含量相似,大豆丹贝的酮类物质含量高于高粱-大豆丹贝,是后者的2倍,而高粱-大豆丹贝的醇类物质含量高于大豆丹贝,并且含有烯类物质,这在大豆丹贝中是不存在的。 2.2 丹贝发酵过程中醇类物质的变化 在4种样品中共检出醇类物质6种。大豆未发酵前醇类物质含量明显高于其他3种样品,这主要是由于相比其他样品大豆未发酵样品中含有大量的1-辛烯-3-醇,其相对含量高达71.19%。1-辛烯-3-醇被认为是大豆的特征挥发性物质,表现为豆腥味,是大豆主要异味成分之一[20]。发酵后样品中醇类种类明显增加,由2种增加至6种,发酵产生了异戊醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2,3-丁二醇、苯乙醇等。发酵引起醇类物质的变化主要集中在正乙醇及1-辛烯-3-醇2种物质上,正乙醇含量的提高主要由于糖的发酵作用,同时氨基酸和脂肪的代谢也可产生乙醇。而1-辛烯-3-醇含量显著减少,其原因可能是由于发生氧化反应或酯化反应。其他醇类的产生也不同程度地丰富了丹贝的风味,例如具有新鲜面包香、清甜的玫瑰样花香的苯乙醇。 2.3 丹贝发酵过程中醛类物质的变化 由表2可以看出,在4种样品中共检出醛类物质4种。发酵后醛类物质种类有所提高。发酵前只检测出己醛一种物质,而大豆丹贝中增加了2-丁烯醛、癸醛,二者相对含量分别为4.61%和0.42%。高粱-大豆丹贝中又增加了壬醛。壬醛和癸醛都具有令人愉悦的香味,而己醛被认为有不快的风味,类似于生的油脂和青草气。发酵前样品中己醛含量高于发酵后样品。这说明发酵过程可以降低这种不愉悦的风味物质。 2.4 丹贝发酵过程中酮类物质的变化 由表1、2可知,在4种样品中共检出4种酮类物质,经发酵后酮类物质种类有所提高。发酵前样品仅能检出丙酮及1-辛烯-3-酮两种物质,而发酵后,大豆丹贝中增加了2-丁酮,高粱-大豆丹贝增加了2-丁酮及3-羟基-2-丁酮。1-辛烯-3-酮具有淡淡的蘑菇清香被认为是丹贝的典型风味物质。仅存在于高粱-大豆丹贝中的3-羟基-2-丁酮有可能是微生物发酵高粱形成,具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气。 2.5 丹贝发酵过程中酯类物质的变化 由表1、2可知,在4种样品中共检出酯类物质4种,其中发酵前样品中检出3种分别为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸己酯;发酵后检测出乙酸乙酯、乙酸丁酯、棕榈酸乙酯3种酯类化合物。由表2可知,每种酯类物质含量并不高,但多种酯类物质共同作用可使丹贝增加怡人的风味。 2.6 丹贝发酵过程中酸类物质的变化 由表1、2可知,在4种样品中共检出酸类风味物质2种,其中发酵前样品及高粱-大豆丹贝中均检出乙酸,大豆丹贝中含有2-羟基-丙酸。酸类物质能使得产品具有一定酸味略带刺激性气味,是人们不太喜欢的风味物质。而在发酵过程中,微生物利用乳酸从而使得乳酸含量减低,减弱这种不良风味。 2.7 丹贝发酵过程中特有挥发性物质的形成 在丹贝的发酵过程中产生一些特有风味物质,如反式石竹烯和3-甲氧基-4H-吡喃-4-酮。这些物质都仅存在于发酵后样品中。这些物质都为大豆发酵产品的典型风味物质。这些物质在豆酱、纳豆中也有发现[21]。 3 结 论 本实验通过对大豆丹贝、高粱-大豆丹贝发酵前后风味物质成分分析,研究了发酵对大豆、高粱-大豆挥发性物质组成及含量的影响以及不同基质发酵对丹贝风味的影响。对比发酵前后样品可以得出大豆、高粱-大豆经发酵后风味物质变得更加丰富。而高粱-大豆丹贝的挥发性物质要比大豆丹贝的更丰富一些。这种差异主要是由于发酵过程中微生物作用以及发酵基质的变化所引起的。通过分析最终确定高粱大豆丹贝具有20种风味物质,其中醇类6种、酮类4种、醛类4种、烯类1种、酯类3种、酸类2种、吡喃酮1种。 参考文献: [1] 徐丽萍. 以豆渣为原料生产丹贝的研究[J]. 食品工业科技, 2008, 23(5): 212-215. [2] 高玉荣, 孙莹. 丹贝加工工艺研究[J]. 中国调味品, 2005, 12(12): 21-24. [3] Chang C T, Hsu C K, Chou S T, et al. Effect of fermentation time on the antioxidant activities of tempeh prepared from fermented soybean using Rhizopus oligosporus[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2009, 44: 799-806. [4] 王华, 陈有容. 丹贝发酵新工艺的研究[J]. 食品工业, 2002, 3(5): 18-21. [5] AMANDI E, UNEZE R, BARIMALAA I. Studies on the production of bambara groundnut (Vigna subterranea) tempe[J]. Plant Food for Human Nutrition, 1999, 53(3): 199-208. [6] 卢庆善. 高粱营养品质研究的新进展世界农业[J]. 世界农业, 1999, 7(3): 243. [7] STEFFEN A, PAW L. Analysis of flavor volatiles using headspace solid-phase micro-extraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(8): 2187-2193. [8] HIROYUKI K, HEATHER L, JANUSZ P. Applications of solid-phase microextraction in food analysis[J]. Journal of Chromatography A , 2000, 880(1/2): 35-62. [9] 刘源, 周光宏, 徐幸莲. 固相微萃取及其在食品分析中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2005, 29(7): 83-86. [10] 李锋, 华欲飞. 大豆酸奶的风味物质研究[J]. 中国乳品工业, 2004, 32(12): 19-21. [11] 孙森, 宋俊梅, 张长山. 豆豉、纳豆及天培的研究进展[J]. 中国调味品, 2008(3): 29-33. [12] 张建华, 李里特, 李再贵, 等. 三豆豉功能性的研究[J]. 食品科学, 2003, 24(7): 54-58 [13] 张世仙, 余永华, 张素英. GC-MS分析自制豆豉中挥发性风味化合物的研究[J]. 中国调味品, 2011, 7(11): 101-104. [14] 马艳莉, 李里特. 发酵豆制品酿造过程中组分和营养功能因子的变化及调控[J]. 食品科学, 2012, 33(3): 292-299. [15] 徐琳娜, 王璋, 许时婴. 固相微萃取技术在豆瓣风味物质分析中的应用[J]. 分析与检测, 2006, 32(6): 113-116. [16] LEE S, SEO B, KIM Y. Volatile compounds in fermented and acid-hydrolyzed soy sauces[J]. Journal of Food Science, 2006, 71: 146-156. [17] 黄璇, 廖卢艳, 范琳, 等. 固相微萃取法分析纳豆挥发性成分[J]. 食品工业科技, 2012, 10(6): 58-61. [18] 张国农, 顾敏锋, 李彦荣, 等. SPME-GC/MS测定再制奶酪中的风味物质[J]. 中国乳品工业, 2006, 34(13): 52-56. [19] 中国质谱学会有机专业委员会. 香料质谱图集[M]. 北京: 科学出版社, 1992. [20] 陈清婵, 徐永霞, 吴鹏, 等. 同时蒸馏萃取与顶空固相微萃取法分析豆豉挥发性成分[J]. 食品科学, 2009, 30(7): 327-330. [21] FENG X, LARSEN, T, SCHNURER J. Production of volatile compounds by Rhizopus oligosporus during soybean and barley tempeh fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 113: 133-141. 收稿日期:2012-10-23 基金项目:国家“863”计划项目(2011AA100903;2013BAD18B01-4);国家自然科学基金青年科学基金项目(31201422); 国家农业科技成果转化资金项目(2012GB23600639);江苏省自然科学基金项目(BK2011651); 教育部博士点基金(新教师类)项目(20110097120028);江苏省科技攻关重大项目(BE2006301); 江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD) 作者简介:丁一(1987—),女,硕士,研究方向为食品微生物与天然活性物质。E-mail:dingyi212@hotmail.com *通信作者:董明盛(1961—),男,教授,博士,研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail:dongms@njau.edu.cn |
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