高效液相色谱法测定不同品种苹果芽中根皮苷的含量

冉军舰1,2,樊明涛1,*,赵政阳3,梁 俊3

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100;2.河南科技学院食品学院,河南 新乡 453003;

3.西北农林科技大学园艺学院,陕西 杨凌 712100)

 

摘 要:建立了检测苹果芽中根皮苷含量的高效液相色谱联合二极管阵列检测器的方法。色谱条件为Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm),柱温30℃,流动相为体积分数1%的乙酸溶液和甲醇,梯度洗脱,检测波长280nm,标准曲线的线性范围6.25~100μg/mL,决定系数0.9999,检测限为0.0313μg/mL,定量限为0.0939μg/mL,回收率范围95.38%~100.12%。检测了富士、国光、乔纳金、粉红女士、秦阳、秦冠、嘎啦、澳洲青苹、红玉、红星10个品种的苹果芽,结果表明:根皮苷含量最高的是红星,含量达到17.284mg/g;秦阳芽中根皮苷的含量最低,为12.569mg/g。

关键词:苹果芽;根皮苷;高效液相色谱

 

Determination of Phloridzin in Apple Buds from Different Varieties by HPLC-DAD

 

Ran Jun-jian1,2,Fan Ming-tao1,*,Zhao Zheng-yang3,Liang Jun3

(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;

2. School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China;

3. College of Horticulture, Nothwest A & F University, Yangling 712100, China)

 

Abstract:A method to detect phloridzin in apple buds was established using high performance liquid chromatography (HPLC) with a diode array detector (DAD). Chromatographic separation was conducted on a Diamonsil C18 (250 mm × 4.6 mm, particle size 5 μm) with a gradient elution program using a mobile phase made up of 1% acetic acid (V/V) and methanol as at 280 nm. The method had a linear range from 6.25 to 100 μg/mL with correlation coefficient of 0.9999, the limit of detection was 0.0313 μg/mL and the limit of quantification was 0.0939 μg/mL. The recovery ranged from 95.38% to 100.12%. Phloridzin in apple buds from 10 different varieties (Fuji, Ralls, Jonagold, Pink lady, Qinyang, Qinguan, Gala, Granny Smith, Jonathan, Starkrimzon) grown in Baishui county, Shaanxi province were determined by the HPLC method. The results showed that the highest content of phloridzin in Starkrimzon buds was 17.284 mg/g among the varieties studied, and the lowest content in Qinyang was 12.569 mg/g.

Key words:apple buds;phloridzin;high performance liquid chromatography (HPLC)

中图分类号:S661.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0157-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320032

根皮苷是由de Koninck[1-2]在1835年从苹果树的树皮中分离出来的一种苦味物质,属于植物类黄酮的二氢查尔酮苷,是根皮素的2-β-D-葡萄糖苷,是苹果中的特征酚类物质[3],广泛存在于苹果的根、茎、芽、叶、果实中,因此苹果常常作为提取根皮苷的重要资源。从被发现到现在的170多年来,根皮苷广泛应用于人体药物和生物膜的生理研究,包括肥胖症、高血压、抗氧化性、膜渗透性、食品和饮料的保质期、食品添加剂、药物和化妆品等方面[4-12]。也有学者研究根皮苷与葡萄糖的摄取、糖尿病的控制[4,13-14]及根皮苷生物合成的重组酶[15-16]和植物蛋白[17]的相关性。

高效液相色谱法常用于多酚的检测,有关的测定方法报道大多集中在苹果、海棠和多穗柯甜茶等植物中的多酚测定[18-20],对于根皮苷检测的报道很少,而且仅存在于苹果的根、枝、叶、果实中,对于苹果芽中根皮苷的含量和其在不同品种苹果的差异性还未见报道,本实验拟建立高效液相色谱法测定苹果芽中的根皮苷,分析不同品种苹果芽中根皮苷含量的差异,为苹果的育种优化、提高苹果品质研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果芽采自陕西白水苹果试验站,包括富士、国光、乔纳金、粉红女士、秦阳、秦冠、嘎啦、澳洲青苹、红玉、红星10个品种,采摘时间2012年4月8日,采摘后放在-40℃冰箱保存;根皮苷标品(含量>99.9%) 美国Sigma公司;甲醇(色谱纯) 美国Tedia公司;冰乙酸、乙醇(均为分析纯) 天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

cp2245型分析天平 德国Sartorius公司;高效液相色谱(含1525二元泵、2998双通道紫外检测器、2707自动进样器、Breeze色谱管理软件等) 美国Waters公司;FA1204B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;KH-250DE型数控超声波清洗器 昆山禾创有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;R-200型旋转蒸发器 瑞士Büchi公司;Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取1mg标准品,用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,-40℃冰箱中储存备用,使用时根据需要稀释成相应质量浓度,过0.45μm滤膜后进样。

1.3.2 样品的制备

准确称取1.00g苹果芽放置在研钵中,加入少量抗坏血酸以防止氧化,研碎,用30mL体积分数70%的乙醇溶液移到100mL的三角瓶中,超声提取30min,过滤后滤渣再次加入20mL体积分数70%的乙醇溶液超声提取30min。合并两次滤液,38℃条件下旋转减压蒸干,然后用甲醇溶解残留物并定容至10mL棕色容量瓶中,-40℃冰箱中储存备用,进样前过0.45μm滤膜,根据保留时间定性,用外标法定量。

1.3.3 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相A:体积分数1%的乙酸溶液,流动相B:甲醇,梯度洗脱时间程序:0~10min,5%~30%B,10~25min,30%~50%B,25~35min,50%~70%B,35~40min,70%~5%B;柱温为30℃;流速为1.0mL/min;进样量:20μL;检测器:紫外检测器,波长:280nm。

1.3.4 标准曲线的建立

取1.3.1节配制好的标准溶液,用0.45μm微孔滤膜过滤,准确吸取一定体积的标准溶液,逐级稀释,配制成7个不同质量浓度的标准样品,分别是6.25、12.5、25、37.5、50、75、100μg/mL,进样20μL,同一质量浓度的溶液连续进样3次,记录峰面积,取平均值。以峰面积为纵坐标,根皮苷的含量为横坐标做标准曲线。

1.3.5 最低检测限和定量限的测定

将一定质量浓度的标准溶液逐级稀释,依次进样,当信噪比等于3时所对应的标准溶液的质量浓度为检测限,当信噪比等于10时所对应的标准溶液的质量浓度为定量限。

1.3.6 精密度实验

精确吸取一定浓度的根皮苷标准液20μL,重复进样5次,测定根皮苷峰面积,计算平均值和相对标准偏差(RSD)。

1.3.7 加标回收率的测定

吸取一定质量浓度的根皮苷标准品溶液1mL添加到苹果芽提取液中,进液相色谱检测,计算根皮苷回收率,并做空白对照。

2 结果与分析

2.1 分离条件的优化

为了获得较好的峰形,试用了不同的流动相和检测波长,最终确定流动相采用甲醇和体积分数1%的乙酸溶液,采用梯度洗脱,检测波长为280nm,在这个条件下根皮苷标准品的色谱图如图1所示,根皮苷的保留时间是29.509min。

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图 1 根皮苷标品在280nm波长处的色谱图

Fig.1 HPLC chromatogram of phloridzin at 280 nm

2.2 标准曲线、检测限和定量限

以峰面积(y)为纵坐标与标品质量浓度(x)为横坐标,进行线性回归,建立回归方程:y=5.32×107x-4.48×104,R2=0.9999,线性范围:6.25~100.0μg/mL,结果表明,在该实验条件下,标品的质量浓度与其峰面积线性关系良好。

按照信噪比等于3计算出检测限为0.0313μg/mL,信噪比等于10计算出定量限为0.0939μg/mL。

2.3 精密度检测

表 1 精密度检测结果(n=5)

Table 1 Results of precision experiments (n=5)

进样次数

含量/(μg/mL)

平均值/(μg/mL)

RSD/%

1

25.043

25.02

0.16

2

25.124

3

24.889

4

24.963

5

25.102

 

 

精确吸取质量浓度为25μg/mL的根皮苷标准液20μL进样,平行测定5次,计算进样标准溶液中根皮苷含量的平均值和相对标准偏差(RSD),结果见表1所示。RSD为0.16%,说明精密度良好。

2.4 加标回收率测定

精确吸取质量浓度为25μg/mL的根皮苷标准品溶液1mL加入苹果芽提取液中,按照1.3.7节的方法,计算加标回收率,结果如表2所示。

表 2 根皮苷的加标回收率结果(n=5)

Table 2 Recovery rates of phloridzin (n=5)

加入量/μg

回收量/μg

回收率/%

平均回收率/%

RSD/%

25

24.568

98.27

98.11

1.88

25

24.351

97.40

25

25.034

100.12

25

23.845

95.38

25

24.842

99.37

 

 

2.5 样品测定

按照1.3.2节对样品进行前处理,并进液相色谱进行分析,每个样品进样3次,取平均值,富士、国光、乔纳金、粉红女士、秦阳、秦冠、嘎啦、澳洲青苹、红玉、红星的色谱图如图2所示。

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图 2 10种苹果芽色谱图

Fig.2 HPLC chromatograms of phloridzin extracted from apple buds from 10 different varieties

由图2可以看出,10种不同品种的苹果芽中多酚的种类和含量有很大区别,富士、乔纳金、粉红女士和秦冠在36min有吸收峰,其他品种只有很小的吸收峰;粉红女士在27min没有吸收峰,其他品种却有较大的吸收峰,国光、嘎啦、澳洲青苹、红玉、红星在15min有吸收峰,其他品种则只有很小的吸收峰,但是所有品种在29min附近都有一个最高峰,对照根皮苷标品确定这个吸收峰就是根皮苷的吸收峰。

表 3 10个品种苹果芽中根皮苷含量

Table 3 Phloridzin content in apple buds from 10 different varieties

苹果品种

富士

国光

乔纳金

粉红女士

秦阳

秦冠

嘎啦

澳洲青苹

红玉

红星

根皮苷含量/(mg/g)

14.999

15.976

16.079

15.620

12.569

14.310

14.836

15.250

16.344

17.284

 

 

由表3可以看出,10种苹果芽中根皮苷含量的关系为红星>红玉>乔纳金>国光>粉红女士>澳洲青苹>富士>嘎啦>秦冠>秦阳,红星芽中根皮苷的含量最高,达到17.284mg/g,秦阳芽中根皮苷的含量最低,为12.569mg/g。

3 结 论

建立了苹果芽中根皮苷的高效液相色谱检测方法,采用的流动相为甲醇和体积分数1%的乙酸溶液,进行梯度洗脱,该方法线性范围:6.25~100.0μg/mL,决定系数R2=0.9999,检测限为0.0313μg/mL,定量限为0.0939μg/mL,回收率98.11%。说明该方法准确可靠、重复性好,可用于苹果芽中根皮苷的检测。

利用该方法对富士、国光、乔纳金、粉红女士、秦阳、秦冠、嘎啦、澳洲青苹、红玉、红星10种品种的苹果芽进行根皮苷的定性定量检测,结果表明根皮苷含量最高的是红星,含量达到17.284mg/g,可以选择此品种进行苹果的育种优化,提高苹果的品质,根皮苷含量最低的是秦阳,为12.569mg/g,但也远远高于所报道的苹果中根皮苷的含量,因此,苹果芽可作为提取根皮苷的原料,从品质较差的苹果芽中提取根皮苷作为高效、无毒、安全的抗氧化性物质,在开发食品抗氧化剂的研制及应用方面具有较好的应用前景。

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收稿日期:2012-09-20

基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-08-01-03);陕西省科技攻关项目(2010K01-04-1)

作者简介:冉军舰(1981—),男,博士研究生,研究方向为苹果多酚。E-mail:ranjunjian@126.com

*通信作者:樊明涛(1963—),男,教授,博士后,研究方向为食品生物技术与食品安全。E-mail:fanmt@nwsuaf.edu.cn