ELISA法检测牛奶中头孢氨苄残留

卞素敏1,2，扈洪波2，邢仕歌1，张 悦1，熊齐荣1，钟 强1，金 涌1,*，储晓刚1,*

(1.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100123；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

摘 要：应用头孢氨苄单克隆抗体，建立牛奶中头孢氨苄残留的间接竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法，其牛奶中检测线性范围为1.0～50.0ng/mL，检测限为1.0ng/mL，半数抑制质量浓度为4.1ng/mL，牛奶的加标回收率分别为96.0%、98.2%及93.3%。头孢氨苄抗体与头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛及头孢克肟的交叉反应率分别为160.0%、80.0%、28.4%和3.7%。此外，一种简单、有效的牛奶纯化方法得以建立。对比ELISA和超高效液相色谱-串联质谱实验结果，显示两种方法有很好的数据相关性(R2=0.9988)。

关键词：头孢氨苄；单克隆抗体；间接竞争酶联免疫吸附测定；牛奶；残留检测；超高效液相色谱-串联质谱

Development of ELISA Method for Detection of Cepfalexin Residue in Milk

BIAN Su-min1,2，HU Hong-bo2，XING Shi-ge1，ZHANG Yue1，XIONG Qi-rong1，ZHONG Qiang1，JIN Yong1,*，CHU Xiao-gang1,*

(1. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China；

2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract：Based on cafalexin monoclonal antibody, an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine cefalexin residues in milk was established. The linear detection range of the ELISA method in milk was 1.0 to 50.0 ng/mL, with limit of detection of 1.0 ng/mL, and IC50 value of 4.1 ng/mL. The recovery rates for spiked milk with 50, 100 ng/mL and 200 ng/mL of cafalexin were 96.0%, 98.2% and 93.3%, respectively. Satisfactory cross-reactivity of the antibody with cefradine, cefadroxil, cefaclor and cefixme was also observed (160.0%, 80.0%, 28.4% and 3.7%, respectively). In addition, a simple and effective sample extraction method was established. The ELISA assay was validated by comparing its results with those obtained by using UPLC-MS-MS, with a good correlation (R2) of 0.9988.

Key words：cefalexin；monoclonal antibody；indirect competitive ELISA；milk；residue detection；UPLC-MS-MS

中图分类号：R978.1.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0186-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320039

头孢氨苄(cefalexin，CEX)是一种β-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等，或用于促进动物的生长[1-2]。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如过敏反应、致畸、致突变和致癌，长时间超剂量使用会使细菌的耐药性增强[3-4]。针对该药物在食品中的残留，欧盟及我国农业部均规定，牛奶中的最高残留限量为100ng/mL[5-6]。

目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法[7-8]、色谱法或色谱-质谱联用分析法[3,9-14]、免疫分析法[15-17]等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱等联用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检测。免疫学检测技术具有较高的灵敏性、特异性和简便性等优点，广泛应用于现场监控和大规模样品筛查。

近阶段，有关头孢氨苄抗体的制备及检测方法的研究较多，但这些制备的头孢氨苄抗体和免疫学检测技术在灵敏度、广谱特异性或检测范围上会存在不足。因此，本研究应用高特异性的头孢氨苄单克隆抗体，以期建立适用于牛奶中多种头孢类抗生素残留的高灵敏性的间接竞争酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

头孢氨苄、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、戊二醛 美国Sigma公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 北京中杉金桥公司；头孢氨苄单抗 本实验室制备；TMB显色底物 北京康贝源公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪 美国Thermo公司；UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪、Oasis HLB固相萃取柱、0.2μm针式过滤器 美国Waters公司；Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司；N-EVAPTM112氮吹仪 美国Organomation公司；96微孔板 美国Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 头孢氨苄包被抗原的合成

取头孢氨苄10mg溶于5mL PBS(0.01mol/L、pH7.4)中，加入1%戊二醛溶液搅拌30min，取30mg OVA溶于1mL PBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2h，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3d，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。

1.3.2 间接竞争ELISA标准曲线的建立

参考文献[15]用包被缓冲液将CEX-OVA稀释成1ng/mL，酶标板每孔加100μL，37℃孵育2h。洗涤4次，拍干，随后每孔加入200μL脱脂奶粉(3g/100mL包被液)，37℃封闭1h。洗涤拍干后，每孔加入50μL不同质量浓度头孢氨苄标品(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100ng/mL)及50μL头孢氨苄抗体，37℃反应30min。再加入50μL/孔的羊抗鼠IgG-HRP孵育30min。洗涤4次，加入100μL/孔的TMB底物，显色20min后用浓H2SO4(2mol/L)终止反应，于450nm波长处测定吸光度。

1.3.3 交叉反应率的测定

选择β-内酰胺类抗生素(头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢拉定、头孢克肟、头孢喹肟、头孢噻呋、头孢匹林钠、头孢噻吩钠、头孢呋辛钠及头孢曲松钠)，用间接竞争ELISA测定各竞争物在质量浓度0～102ng/mL时的吸光度，以头孢氨苄50%抑制浓度与竞争物的50%抑制浓度之比的百分数计算交叉反应率。

1.3.4 牛奶的前处理与纯化

牛奶于4℃、9000r/min离心脱脂15min后，去除上层脂肪，取下清液转移到干净的离心管中，1:10(V/V)稀释后取50μL用于ELISA分析。

用于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS)分析的牛奶样品需纯化，纯化大致步骤为：新鲜的纯牛奶(不含头孢氨苄)添加高质量浓度标准液至所需质量浓度；称2g牛奶至50mL离心管中，用15mL乙腈-水(15:2，V/V)提取液进行振荡提取2次(320r/min，20min，室温)；旋转蒸发后用4mL的磷酸盐溶液(0.15mol/L，pH8.0)分2次复溶，洗脱(乙腈-水(8:2，V/V))后收集全部洗脱液进行氮吹，最后由定溶液(乙腈-水(1:9，V/V)＋0.1%甲酸)定容至1mL。

1.3.5 基质效应

对脱脂牛奶分别进行1:10(V/V)稀释，通过间接竞争ELISA同时获得头孢氨苄在10倍稀释牛奶及纯缓冲液两种基质中的标准曲线，比较分析以检测牛奶的基质效应。

1.3.6 准确度和精密度实验

在空白牛奶样品中添加头孢氨苄标准液至终质量浓度为50、100、200ng/mL，经前处理后取下层溶液用PBS稀释液按1:10稀释后，取50μL用于分析。

1.3.7 ELISA与UPLC-MS-MS数据比对

空白牛奶样品中添加3种质量浓度(50、100、200ng/mL)的头孢氨苄标准液，分别用间接竞争ELISA方法和UPLC-MS-MS技术测定回收率，通过Origin软件分析两组数据的相关性，进而判定ELISA方法的准确性和有效性。

2 结果与分析

2.1 间接竞争ELISA标准曲线的建立

以相对吸光度为纵坐标，不同标品质量浓度为横坐标，绘制头孢氨苄的标准抑制曲线。ELISA标曲的灵敏度通常由检测限(10%标品抑制浓度)与半数抑制率(IC50)来表示。

牛奶中头孢氨苄的间接竞争ELISA标准曲线为倒S-剂量依赖型曲线(图1)，检测限低至1.0ng/mL，半数抑制率IC50为4.1ng/mL，线性检测范围在1.0～50.0ng/mL，说明此ELISA曲线能够以远低于最大残留限量100µg/mL的高灵敏性对牛奶中的头孢氨苄进行检测。

图 1 头孢氨苄的间接竞争性ELISA标准曲线

Fig.1 Standard curve for cefalexin in the indirect competitive ELISA

近阶段，Chen Liben等[16]获得了头孢氨苄单克隆抗体，牛奶中ELISA标曲的检测限为1.0ng/mL，半数抑制质量浓度在19.5ng/mL；同时Xie Huiling等[17]制备的头孢类多克隆抗体对头孢氨苄也有较高的灵敏性(检测限为5.0ng/mL)，且可同时检测7种头孢类抗生素。但就检测能力来说，本实验获得的酶免疫技术较前述研究都有更宽、更明显的线性检测范围(1.0～50.0ng/mL)。

2.2 准确性与精密度

对脱脂牛奶进行10倍稀释，ELISA方法测定牛奶中3水平头孢氨苄添加量的回收率为93.3%～98.2%，变异系数为3.3%～7.8%(表1)。这表明，此ELISA方法对于牛奶样品中头孢氨苄残留的检测有很好的适用性和准确度，同时意味着牛奶仅需简单的离心脱脂即可用于ELISA检测。

表 1 ELISA方法对牛奶加标回收率的分析测定(n=6)

Table 1 Analysis of cefalexin-fortified milk samples by the ELISA assay (n=6)

2.3 交叉反应

采用间接竞争ELISA对结构类似的β-内酰胺类抗生素和其他结构化合物进行交叉反应实验。头孢氨苄单克隆抗体与头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛及头孢克肟的交叉反应率分别为160.0%、80.0%、28.4%和3.7%，与其他β-内酰胺类化合物，如头孢噻呋的交叉反应率(＜0.1%)均可忽略不计，与恩诺沙星、磺胺甲嘧啶无交叉反应(表2)。结果表明，本实验所制备的头孢氨苄单克隆抗体广谱性能较强，特异性高。

表 2 间接竞争ELISA中头孢氨苄的交叉反应

Table 2 Cross-reactivity of cefalexin antibody with analog compounds in the ELISA assay

注：—.无交叉反应性。

此头孢氨苄抗体的交叉反应性较文献[16-17]的研究有相似甚至更好的广谱性能。近期，Bremus等[1]获得了包括头孢氨苄在内的5种高特异性的头孢菌素单克隆抗体。与本实验制备的抗体相比，其头孢氨苄单抗的广谱性能相似，但对头孢羟氨苄、头孢拉定及头孢克洛的亲合力则相对较弱(交叉反应率相应为33.1%、29.0%、9.72%)。就此而言，本实验开发的ELISA方法，可以作为一种较为高效的检测手段对牛奶中的头孢类残留含量进行判定。

2.4 基质效应

样品基质里含有的蛋白质和脂肪会影响ELISA实验中抗原-抗体的结合[18-19]及免疫检测的其他方面，进一步降低间接竞争性ELISA的敏感性和可靠性[20]。因此，基质干扰可以通过对样品进行适当稀释或适当的净化进行消除。

标品质量浓度变异系数均小于4.0%。

图 2 牛奶10倍稀释及纯缓冲液(PBS)获得的ELISA基质效应曲线

Fig.2 Matrix effect curves obtained from 10-fold dilution and non-dilution (PBS) of milk

为了检测本实验的基质效应，消除基质干扰，对牛奶进行10倍稀释。由图2可知，10倍稀释后制作的标准曲线与纯PBS溶液的标准曲线几乎完全重叠，这说明不同质量浓度的标品稀释液对标品的最大吸光度、检测限和ELISA检测的敏感性影响可以忽略(IC50变化极微)，即本实验仅存在微弱的基质干扰。同时进一步说明，对于市场上销售的牛奶，无需复杂的脱脂、去蛋白及高温酶失活等系列前处理程序，仅需简单的离心脱脂，即可应用此高敏感性的ELISA方法进行准确的头孢氨苄残留量测定。

2.5 UPLC-MS-MS对ELISA方法的验证

图 3 ELISA与UPLC-MS-MS对牛奶样品的数据相关性分析

Fig.3 Correlation between ELISA and UPLC-MS-MS results for milk spiked with cefalexin

图3显示，牛奶纯化前的ELISA结果与纯化后UPLC-MS-MS数据之间有非常好的相关性(R2=0.9988)，表明本实验建立的ELISA技术对于牛奶中头孢氨苄残留的分析是个非常可靠的方法。

3 结 论

本研究应用已合成的特异性强、广谱性宽及灵敏性高的头孢氨苄单克隆抗体，成功建立了一种简单、快速及高效的头孢氨苄残留检测ELISA方法，其对牛奶的检测限为1.0ng/mL，半数抑制质量浓度为4.1ng/mL。与前人研究相比，本实验获得的ELISA方法有更高的灵敏性、更宽的线性范围和更稳定的检测性能。

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