黄芪超微粉HPLC指纹图谱的建立

李 健，韩 林，马玉芳，胡新奇，黄一帆*

(福建农林大学 中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室，福建 福州 350002)

摘 要：目的：建立黄芪超微粉高效液相色谱(HPLC)的指纹图谱，为其质量控制和科学评价提供依据。方法：采用Inertsil ODS-SP(4.6mm×250mm，5µm)色谱柱，甲醇-乙腈(1:1，V/V)为流动相A，超纯水为流动相B，进行梯度洗脱，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长260nm。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A进行相似度分析，并进行聚类分析。结果：建立了黄芪超微粉的指纹图谱，确定12个共有峰。聚类分析表明10批样品存在明显的南北地域差异。结论：此方法简便、准确、重复性好，可用于黄芪超微粉质量控制与评价。

关键词：黄芪超微粉；高效液相色谱法；指纹图谱；相似度

HPLC Fingerprint Analysis of Ultra-Micro Powder of Astragali Radix

LI Jian，HAN Lin，MA Yu-fang，HU Xin-qi，HUANG Yi-fan*

(University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcare in

Fujian Province, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Abstract：Objective: To establish an high performance liquid chromatography fingerprint for quality control and evaluation of ultra-micro powder of Astragali Radix. Methods: Chromatographic separation was achieved on an Inertsil ODS-SP column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) with mobile phase A (methanol-acetonitrile, 1:1) and mobile phase B (ultra-pure water) at a flow rate of 0.8 mL/min. In addition, the detection wavelength and column temperature were set at 260 nm and 25 ℃, respectively. Results: Twelve peaks common to the established fingerprints were identified. Cluster analysis suggested apparent geographic differences between the samples from the north and the south. Conclusion: The proposed method is simple, accurate, repeatable and suitable for the quality control and evaluation of Astragali Radix ultra-micro powder.

Key words：ultra-micro powder of Astragali Radix；high performance liquid chromatography (HPLC)； chromatographic fingerprint；similarity

中图分类号：R931.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0199-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320042

黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.)的干燥根[1]，收载于卫生部公布的“可用于保健食品的物品名单”中[2]，具有降血糖、调节免疫、清除自由基、抗癌等保健作用[3-7]。植物材料超微粉碎后，可使有效成分溶出增加，生物利用度提高[8-9]，因此黄芪超微粉在保健品开发领域有着广阔的应用前景；但与此同时，由于细胞发生破壁，传统的外观及显微鉴别方法已不适用[10-11]，而中国药典2010年版以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮作为黄芪化学质量控制的指标[1]，也不能全面反映不同产地黄芪的化学质量差异。指纹图谱技术作为一种针对多组分复杂样品的有效质控方法，可全面反映产品的化学成分及其相对比例，有效表征产品质量[12-15]。目前关于黄芪超微粉指纹图谱的研究尚未见报道。本研究采用高效液相色谱法，建立黄芪超微粉指纹图谱，以期为黄芪超微粉的质量控制提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛蕊异黄酮葡萄糖苷(calycosin glucoside，批号：111920-2012203)及芒柄花素(formononetin，批号：111703-200501) 中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

10批次黄芪的来源S1～S10分别来源于广东省广州市、河北省保定市、辽宁省大连市、甘肃省平凉县、海南省海口市、山西省大同市、浙江省宁波市、宁夏自治区同心县、陕西省西安市、福建省福州市。所有样品均由福建农林大学中西兽医结合与动物保健实验室鉴定并留样。每批样品各取200g，超微粉碎后过300目筛，激光粒度仪测定粒径[16]，中位粒径D50的平均值为5.944μm。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪(配有LC-20AT输液泵、SPD-M20A紫外检测器、LC-solution色谱工作站) 日本岛津公司；SQW-6BL型超微粉碎机 山东三清不锈钢设备有限公司；Rise-2002型激光粒度仪 济南润之科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取芒柄花素5.39mg置于10mL容量瓶中，用80%乙醇超声溶解，并定容至刻度线，摇匀即得芒柄花素对照品溶液。

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品3.82mg置于10mL容量瓶中。用80%乙醇超声溶解，并定容至刻度线，摇匀即得毛蕊异黄酮苷对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密称取各批次黄芪超微粉0.50g，置于具塞锥形瓶中，加80%乙醇50mL，超声提取40min，过滤，滤液水浴蒸干，残渣用80%乙醇溶解并定容至10mL容量瓶中，摇匀，过0.45µm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6mm×250mm，5µm)；流动相：甲醇-乙腈(1:1，V/V)作为流动相A，水为流动相B；梯度洗脱程序见表1；检测波长260nm，流速0.8mL/min，柱温25℃。

表 1 黄芪超微粉HPLC梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution mode for Astragali Radix ultra-micro powder

1.4 数据处理

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版进行相似度分析，使用SPSS 19.0软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 参照物峰的选择

芒柄花素是黄芪的主要有效成分之一，由于该色谱峰峰面积较大且比较稳定，因此，选取芒柄花素色谱峰作为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.1.2 精密度实验

精密称取S1号黄芪超微粉0.50g，按照1.3.2节方法制备供试品溶液，按照1.3.3节色谱条件，重复进样6次，进样量20µL，考察仪器的精密度。结果表明，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，仪器的精密度良好。

2.1.3 稳定性实验

精密称取S1号黄芪超微粉0.50g，按照1.3.2节方法制备供试品溶液，按照1.3.3节色谱条件，分别在0、2、4、6、12、24h进样20µL测定，考察供试品溶液的稳定性。以芒柄花素的色谱峰为参照峰，计算其余标记峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，供试品溶液在24h内稳定，

2.1.4 重复性实验

精密称取S1号黄芪超微粉0.50g，共6份，分别按照1.3.2节方法制备供试品溶液，按照1.3.3节色谱条件分别进样20µL检测，以芒柄花素的色谱峰为参照峰，计算其余标记峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD，考察实验方法的重复性。结果表明主要共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，符合色谱指纹图谱研究的要求。

2.2 黄芪指纹图谱的建立

2.2.1 指纹图谱的采集

精密称取各批号黄芪超微粉0.50g，分别按照1.3.2节方法制备供试品溶液，按照1.3.3节色谱条件分别进样20µL检测，记录各批次黄芪超微粉HPLC-UV指纹图谱相对保留时间及相对峰面积，见表2、3及图1。

表 2 黄芪超微粉HPLC指纹图谱相对保留时间

Table 2 Relative retention time of main peaks in the HPLC fingerprint of Astragali Radix ultra-micro powder

注：—.无数据。表3同。

表 3 黄芪超微粉HPLC 指纹图谱相对峰面积

Table 3 Relative peak area in the HPLC fingerprint of

Astragali Radix ultra-micro powder

图 1 10批次黄芪超微粉指纹图谱

Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of Astragali Radix ultra-micro powder

2.2.2 共有指纹峰的确定

根据10批样品测定结果，各批样品指纹图谱的色谱峰均在60min内，综合10批样品的色谱图，有12个色谱峰，其中7号峰为毛蕊异黄酮苷色谱峰，12号峰为芒柄花素色谱峰。各批样品的12个共有峰总面积占总峰面积的90%以上，因此确定这12个峰为共有指纹峰，见图2。

图 2 黄芪超微粉对照指纹图谱

Fig.2 HPLC contrast fingerprint of Astragali Radix ultramicro powder

2.2.3 对照指纹图谱的建立及相似度的测定

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件自动匹配10批次黄芪微粉HPLC色谱图相关参数，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设时间窗宽度为0.2min，测得样品与对照指纹图谱之间的相似度，如表4所示。

表 4 10批次黄芪超微粉指纹图谱相似度结果

Table 4 Similarity evaluation of ten batches of Astragali Radix

ultra-micro powder

2.3 指纹图谱聚类分析

采用SPSS软件对10批样品的HPLC-UV指纹图谱进行聚类分析，结果见图3。

图 3 10批次黄芪超微粉指纹图谱聚类分析

Fig.3 Cluster analysis of ten batches of Astragali Radix ultra-micro powder from different geographic origins based on HPLC-UV fingerprints

由图3可知，北方几省的样品被聚为一类；浙江的样品也归为这一大类，可能是该样品源于北方某道地产区。南方几省的样品聚为一类，且相似度相对较低，说明其质量逊于北方的道地产区；河北的样品也归为这一大类，提示这几个样品在药品供应链中可能存在某种上下游关系。

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化

指纹图谱色谱条件的选择，要满足基线平稳，包含的信息量最大，能充分反映样品组分全貌的要求[17-18]。为了优化色谱条件，本实验对色谱柱、检测波长、柱温、流动相及洗脱梯度等进行考察。关于色谱柱，比较Inertsil ODS-SP(4.6mm×250mm，5µm)和Phenomenex C18(4.6mm×250mm，5μm)，前者峰形好，出峰数量多，分离度高，故选用Inertsil ODS-SP 色谱柱。关于检测波长，使用UV检测器对200～400nm进行全波段扫描，260～280nm处有最大吸收波长，兼顾出峰数量多，信号响应值大，基线平稳情况，选用260nm 作为本实验的检测波长。关于柱温，比较了25、30、35℃对色谱分离效果的影响，25℃时分离效果最佳，故选用25℃为本实验柱温。关于流动相及洗脱梯度，分别采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液以及甲醇-乙腈(1:1，V/V)-水等不同体系作为流动相，以不同梯度进行洗脱，结果表明甲醇-乙腈(1:1，V/V)作为流动相A，水为流动相B进行梯度洗脱所得色谱图峰形好、基线平稳、分离度好，因此选用该体系作为本实验的流动相。由指纹图谱分析可知，10 批黄芪超微粉的特征吸收基本一致，表明上述色谱条件对于控制黄芪超微粉的质量是基本适用的。

3.2 聚类分析

对指纹图谱的结果进行聚类分析，既可以验证相似度评价软件的分析结果，又能在一定程度上反映不同样品在种属或产地方面的相关性[19-20]。本实验聚类分析与相似度分析结果一致，能看出较为明显的地域差异。

4 结 论

本实验收集全国不同地区的10批次黄芪，建立了黄芪超微粉的HPLC指纹图谱，标定了12个共有峰，聚类分析与相似度分析结果一致。此方法简便、准确、重复性好，可作为黄芪超微粉质量控制与评价的有效方法。

参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 283.

[2] 中华人民共和国卫生部. 关于进一步规范保健食品原料管理的通知[S]. 卫法监发[2002]51号.

[3] 王春怡, 陈艳芬, 李卫民, 等. 黄芪葛根汤对糖尿病及胰岛素抵抗小鼠血糖的影响[J]. 时珍国医国药, 2011, 22(l1): 2731-2732.

[4] 谢兴亮, 盛艳梅, 韩丽, 等. 不同来源黄芪多糖提取物对淋巴细胞增殖的影响及其化学组成分析[J]. 时珍国医国药, 2011, 22(l1): 2705-2707.

[5] KUMAR K S, KUMARESAN R. A DFT study on the structural, electronic properties and radical scavenging mechanisms of calycosin, glycitein, pratensein and prunetin[J]. Computational and Theoretical Chemistry, 2012, 985(1): 14-22.

[6] ZHANG Dongqing, WANG Deqing, YU Yong. Effects and mechanisms of total flavonoids of astragali radix and calycosin on inhibiting human erythroleukemia cell line K562[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2011, 36(24): 3502-3505.

[7] XU Youhua, FENG Liang, WANG Shanshan, et al. Phytoestrogen calycosin-7-O-beta-D-glucopyranoside ameliorates advanced glycation end products-induced HUVEC damage[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2011, 112(10): 2953-2965.

[8] 明少兰. 微粉化对中药疗效影响的研究进展[J]. 医药导报, 2012, 31(4): 457-461.

[9] 张荣, 徐怀德, 姚勇哲, 等. 黄芪超微粉碎物理特性及其制备工艺优化[J]. 食品科学, 2012, 33(18): 34-38.

[10] 邵怡, 张水寒, 蔡光先, 等. 番泻叶超微粉体HPLC指纹图谱的研究[J]. 中成药, 2012, 34(3): 397-400.

[11] 唐玉莲, 梁逸曾, 张华秀, 等. 决明子药材、超微粉体和破壁粉粒指纹图谱研究[J]. 中成药, 2011, 34(12): 1861-1866.

[12] CHEN Chu, ZHANG Hao, XIAO Wei, et al. High-performance liquid chromatographic fingerprint analysis for different origins of sea buckthorn berries[J]. Journal of Chromatography, 2007, 1154(1/2): 250-259.

[13] LIU Aihua, LIN Yanhua, YANG Min, et al. Development of the fingerprints for the quality of the roots of Salvia miltiorrhiza and its related preparations by HPLC-DAD and LC-MSn[J]. Journal of Chromatography, 2007, 846(1/2): 32-41.

[14] 肖维强, 张超洪, 黄炳雄, 等. 化橘红HPLC指纹图谱的建立[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 318-321.

[15] 卢凤来, 刘金磊, 黄永林, 等. 不同生长时期罗汉果高效液相指纹图谱研究[J]. 食品科学, 2010, 31(18): 283-287.

[16] 蔡光先. 中药粉体工程学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2008: 170.

[17] 周立艳, 梁生旺, 王淑美, 等. 牡丹皮高效液相色谱“药效指纹图谱”研究[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(6): 1337-1339.

[18] 査芳芳, 高学玲, 邹敏亮, 等. 黄山贡菊高效液相色谱指纹图谱的建立[J]. 食品科学, 2011, 32(20): 146-150.

[19] 李游, 梁宗锁, 周自云, 等. 基于HPLC指纹图谱和定量分析法评价酸枣仁质量[J]. 食品科学, 2010, 31(4): 143-149.

[20] 成浩, 王丽鸳, 周健, 等. 基于化学指纹图谱的绿茶原料品种判别分析[J]. 中国农业科学, 2008, 41(8): 2413-2418.