分散固相萃取-HPLC检测绿茶茶汤中吡虫啉和啶虫脒残留

路海燕,李 斌,陈忠正,高 雄,林晓蓉,魏超田,张媛媛*

(华南农业大学食品学院,广东 广州 510642)

 

要:建立分散固相萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测器分析茶饮料中吡虫啉和啶虫脒残留的方法。样品经乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)萃取,25mg N-丙基乙二胺(PSA)+25mg石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取净化。采用Agilent ZORBAX-XDB C18色谱柱分离,乙腈和水洗脱。在0.05、0.10mg/L和0.50mg/L加标水平上,吡虫啉和啶虫脒的回收率分别为93.3%~102.5%、95.0%~112.7%,相对标准偏差(RSD)分别为2.2%~2.9%、3.0%~5.1%。吡虫啉和啶虫脒的检测限分别为0.004、0.001mg/L,定量限分别为0.010、0.006mg/L。方法精密度较高,重复性较好。

关键词:吡虫啉;啶虫脒;茶饮料;分散固相萃取;高效液相色谱

 

Determination of Imidacloprid and Acetamiprid in Green Tea Infusion by High-Performance Liquid Chromatography with Dispersive Solid Phase Extraction

 

LU Hai-yan,LI Bin,CHEN Zhong-zheng,GAO Xiong,LIN Xiao-rong,WEI Chao-tian,ZHANG Yuan-yuan*

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

 

Abstract:A rapid analytical method based on high-performance liquid chromatography with diode array detection was developed for the simultaneous determination of imidacloprid and acetamiprid in green tea infusion. The target analytes were extracted with ethyl acetate-cyclohexane (5:5, V/V), and the extracts were cleaned up by dispersive solid phase extraction with 25 mg of primary secondary amine (PSA) plus 25 mg of graphitized carbon black (GCB). The recovery rates at three spiked levels of 0.05, 0.1 mg/L and 0.5 mg/L were 93.3% to 102.5% for imidacloprid and 95.0% to 112.7% for acetamiprid, and the relative standard deviations were 2.2% to 2.9% and 3.0% to 5.1%, respectively. The limits of detection (LOD) of imidacloprid and acetamiprid were 0.004 mg/L and 0.001 mg/L, and the limits of quantification (LOQ) were 0.010 mg/L and 0.006 mg/L, respectively.

Key words:imidacloprid;acetamiprid;green tea infusion;dispersive solid phase extraction;high-performance liquid chromatography (HPLC)

中图分类号:O657 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)20-0203-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320043

吡虫啉是一种烟碱类杀虫剂,能有效防治同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目类害虫,同时可杀灭对有机磷农药等传统杀虫剂有抗药性的害虫,具有高效、持效期长、对哺乳动物毒性低等特点[1]。啶虫脒是吡虫啉的一种开环衍生物,除具有吡虫啉良好的杀虫活性外,还有优良的杀卵活性,而且与常规农药无交互抗性[2]。由于这两种杀虫剂的显著优势,近年来被广泛用于茶叶生产中,主要用于防治茶树小绿叶蝉、飞虱、蓟马、黑刺粉虱等害虫[3-5]。然而,吡虫啉和啶虫脒因在水中溶解度高(分别为0.61g/L(20℃)和4.25g/L(25℃))而容易向茶汤迁移进而进入茶饮料中[6-8],造成茶饮料中水溶性农药残留问题凸显。研究证明,吡虫啉和啶虫脒具有细胞毒性[9],且对人体外周血淋巴细胞遗传物质有损伤作用[10-11],此外,吡虫啉还具有一定的神经毒性[12]。因此,建立茶饮料中吡虫啉和啶虫脒的分析方法对于监控茶饮料中农药残留状况,保护消费者健康具有重要意义。

目前,国内外相关标准与法规中均未发布茶饮料中农药残留的分析方法及限量标准,同时对茶饮料中农药残留检测的文献报道也非常有限。仅见农业部农药检定所公布的绿茶饮料中吡虫啉等7种农药残留量检测能力验证报告[13],但该报告中的样品前处理步骤繁琐,且多次大量使用有机溶剂,存在检测成本高、效率低等问题。此外,液相色谱-质谱联用技术是检测茶饮料中吡虫啉和啶虫脒的有效技术,但液相色谱-质谱联用设备昂贵,普及难度较大[14]。因此,本实验拟以绿茶纯茶饮料为基质,采用分散固相萃取前处理技术,建立一种简单快速的绿茶饮料中吡虫啉和啶虫脒高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,为茶饮料中农药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄鸥绿茶由广东省芳村区韦品忠茶行提供。

农药标准品:吡虫啉(imidacloprid,纯度≥98.0%)、啶虫脒(acetamiprid,纯度≥98.1%) 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、硅胶(Si)、弗罗里硅土(Florisil) 天津博纳艾杰尔科技公司;乙腈、甲醇(均为色谱纯) 韩国Honeywell Burdick & Jackson公司;乙酸乙酯、环己烷、二甘醇、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪(配有多波G1315C/D/G1365C/D二极管阵列检测器(DAD)和B.04.01色谱工作站)、ZORBAX-XDB C18液相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm) 美国Agilent公司;HSC-12B循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;SHZ-D(Ⅲ)氮吹仪 天津市横奥科技发展有限公司;5804R台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司;Integral 3超纯水机 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 农药标准液的配制

1000mg/L吡虫啉、啶虫脒单标储备液配制:分别称量吡虫啉、啶虫脒标准品10mg(精确到0.0100g)于各10mL容量瓶,用乙腈溶解定容,-18℃冰箱保存。

1000mg/L混合标准储备液配制:称量吡虫啉和啶虫脒标准品各10mg(精确到0.0100g)于10mL容量瓶,用乙腈溶解定容,-18℃冰箱保存。

1.3.2 样品制备

取吡虫啉和啶虫脒空白有机绿茶干茶,研磨过筛后,取20~30目备用。称取1.00g茶样,按茶-水比1:100(g/mL)沸水浸泡2min,抽滤冷却后即得绿茶纯茶饮料。添加吡虫啉和啶虫脒混合储备液后备用。

1.3.3 样品前处理

提取:取绿茶饮料10.0mL于50mL离心管中,加入10mL乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)和1g氯化钠;涡旋30s,3500r/min离心5min;移取上清液于玻璃瓶中,下层溶液再分别用10mL乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)提取2次。合并提取液后,采用氮气吹至近干得样品残渣。

净化:用2×1mL乙腈溶解上述残渣,并转移至15mL离心管中(管内预先装有25mg PS+25mg GCB+300mg Na2SO4);涡旋30s,10000r/min离心10min。取上清液1mL于5mL玻璃瓶中,加入200μL 10%二甘醇(甲醇作为溶剂)后,涡旋30s,35℃水浴条件下,用氮气吹干。加入0.5mL乙腈溶解后,涡旋30s,过0.22μm有机滤膜,待测。

1.3.4 色谱条件

液相色谱柱为Agilent ZORBAX-XDB C18(250mm×4.6mm,5μm)。流动相A为乙腈;流动相B为水。梯度洗脱程序:0~2min,10%A;2~27min,10%~30%A;27~28min,30%~10%A;后运行4min。流速:1mL/min;柱温40℃;进样量:10μL。检测波长为270nm(吡虫啉)和245nm(啶虫脒)。

2 结果与分析

2.1 线性范围

将吡虫啉和啶虫脒混合标准储备液用乙腈稀释成质量浓度分别为6.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.20、0.10mg/L的标准溶液,每个质量浓度进样3次。以色谱峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标绘制标准曲线。标准曲线表明,在0.10~6.00mg/L范围内,吡虫啉和啶虫脒在液相色谱中的响应值与质量浓度呈正相关,其线性方程分别为:y=62.318x-3.0284,R²=0.9993(啶虫脒);y=48.2301x-1.9321,R²=0.9993(吡虫啉)。

2.2 色谱条件的选择

通过二极管阵列检测器进行波长扫描,确定吡虫啉和啶虫脒最大吸收波长分别为270nm和245nm,并将此作为两种农药的检测波长。

表 1 不同梯度洗脱程序

Table 1 Different gradient elution programs

洗脱程序

时间/min

乙腈/%

水/%

A

2

30

70

12

90

10

13

30

70

 

 

 

 

B

2

20

80

12

90

10

13

20

80

 

 

 

 

C

2

10

90

27

30

70

28

10

90

 

 

吡虫啉和啶虫脒的分离通常采用C18色谱柱。本研究采用Agilent ZORBAX-XDB C18(250mm×4.6mm,5μm)为HPLC分离柱,以乙腈和水为流动相,优化洗脱程序,在提高吡虫啉和啶虫脒分离度的基础上,减少茶叶基质的干扰。结果表明,等度洗脱条件下,两种农药不能完全分离。因此,本研究比较了不同梯度洗脱程序(表1)对吡虫啉和啶虫脒分离效果的影响。结果显示,采用洗脱程序C,吡虫啉和啶虫脒可完全分离,且无杂质干扰目标化合物出峰;同时峰形对称,无拖尾,因此选择该梯度洗脱程序为洗脱条件。

2.3 提取条件优化

基于吡虫啉和啶虫脒极性较强,果蔬和茶叶等食品体系中吡虫啉和啶虫脒残留分析时,常用的提取溶剂有丙酮、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯或一定配比的二元或多元混合溶剂等[15]。丙酮虽毒性低,但共萃物较多;二氯甲烷毒性与乙腈相当,但二氯甲烷沸点低对实验人员和环境污染较大;乙腈及以乙酸乙酯-环己烷等为代表的二元混合溶剂因其共萃物较少、提取率高等优势而成为食品农药残留分析常用的提取溶剂[16-17]。

本实验采用乙腈和乙酸乙酯-环己烷作为提取溶剂。结果表明,两种萃取溶剂的共萃物在色谱条件下的响应值无明显差异。考虑到乙腈毒性较大、成本较高,本研究选择乙酸乙酯-环己烷作为提取剂,并比较不同配比乙酸乙酯-环己烷(9:1、8:2、7:3、6:4、5:5,V/V)的提取效果。结果显示,随着乙酸乙酯比例的降低,杂质响应值下降。当乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)时,杂质对目标农药的干扰最小。因此本研究选择乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)作为萃取溶剂。

表 2 萃取剂体积对吡虫啉和啶虫脒回收率的影响(n=6)

Table 2 Effect of extraction solvent volume on the recovery rates of imidacloprid and acetamiprid (n=6)

萃取剂

体积/mL

平均回收率/%

 

相对标准偏差/%

吡虫啉

啶虫脒

 

吡虫啉

啶虫脒

5

86.5A

89.1A

 

12.9

12.4

10

99.1B

102.2B

 

7.5

3.8

 

注:吡虫啉和啶虫脒的添加质量浓度为0.05mg/L;同列肩标不同字母表示数据差异显著(P<0.05),相同字母表示数据差异不显著(P>0.05)。下同。

 

表 3 萃取次数对吡虫啉和啶虫脒回收率的影响(n=6)

Table 3 Effect of repeated extraction cycles on the recovery rates of imidacloprid and acetamiprid (n=6)

萃取次数

平均回收率/%

 

相对标准偏差/%

吡虫啉

啶虫脒

 

吡虫啉

啶虫脒

2

83.8A

86.0A

 

2.2

4.2

3

99.1B

102.2B

 

7.5

3.8

4

98.7B

104.1B

 

10.7

10.8

 

 

确定萃取溶剂为乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)后,本研究分析了萃取溶剂体积和萃取次数对吡虫啉和啶虫脒回收率的影响,结果如表2、3所示。由表2可以看出,当萃取剂体积为5mL时,回收率均高于85%;随着萃取剂体积增至10mL时,两种农药的回收率均显著增加(P<0.05),故本研究选择萃取剂体积为10mL。由表3可以看出,萃取次数由2次增至3次时,吡虫啉和啶虫脒的回收率显著增加(P<0.05);当萃取4次时,两种农药的回收率无显著变化(P>0.05)。说明萃取3次已使样品中的农药被充分提取。故本研究所用提取条件为10mL乙酸乙酯-环己烷(5:5,V/V)萃取3次。

2.4 净化方法的优化

本研究分析了PSA、GCB、Florisil、硅胶等常用吸附剂对样品溶液的净化效果。结果表明,硅胶吸附剂仅能去除部分干扰杂质;而Florisil可同时降低干扰杂质和目标化合物的响应值,使吡虫啉和啶虫脒的回收率偏低且不稳定。苏婷等[5]报道,GCB可除去茶叶提取液中大部分色素,但对强紫外吸收的干扰去除效果不明显;而PSA分子中含有两个氨基,对有机酸、酚类和一些极性色素具有很强的亲和力和较高的容量,故在植物样品农药残留分析中应用较多[18]。因此,本研究尝试采用PSA+GCB作为吸附剂用于净化提取液。当吸附剂为25mg PSA+25mg GCB时,对干扰吡虫啉和啶虫脒出峰的杂质具有良好的去除效果(图1),且对农药回收率无影响。因此,选择25mg PSA+25mg GCB作为净化吸附剂。

452650.jpg 

A和B测定波长为270nm;C和D测定波长为245nm。

图 1 添加吡虫啉和啶虫脒茶饮料样品和空白茶饮料样品的色谱图

Fig.1 Chromatogram of imidacloprid and acetamiprid in tea infusion

2.5 回收率和精密度

在空白茶饮料样品中添加0.05、0.1、0.5mg/L水平的吡虫啉和啶虫脒,并按1.2.3节进行样品前处理,计算回收率和相对标准偏差。每个质量浓度平行测定6次。结果如表4所示。3种质量浓度下,样品中吡虫啉和啶虫脒的回收率在93.3%~112.7%之间,相对标准偏差(RSD)为2.2%~5.1%,符合农药残留分析对回收率的要求。与农业部农药检定所公布的方法相比(吡虫啉回收率为81.2%~109.8%,RSD为1.76%~6.38%)[13],吡虫啉的回收率更高,且重复性更好。

表 4 回收率和精密度(n=6)

Table 4 Recovery rates and precision (n=6)

质量浓度/

(mg/L)

吡虫啉

 

啶虫脒

回收率/%

相对标准偏差/%

 

回收率/%

相对标准偏差/%

0.05

96.7~102.5

2.2

 

97.7~112.7

5.1

0.10

93.4~99.9

2.7

 

96.8~104.0

2.6

0.50

93.3~100.4

2.9

 

95.0~103.4

3.0

 

 

2.6 检测限和定量限

根据1.2.3节样品前处理方法,以信噪比(RSN)为3时的实际添加质量浓度为检测限(LOD),RSN为10时的添加质量浓度为定量限(LOQ)。得到该方法的吡虫啉LOD为0.004mg/L,LOQ为0.010mg/L;
啶虫脒的LOD为0.001mg/L,LOQ为0.006mg/L。

3 结 论

本研究采用分散固相萃取样品前处理方法,建立了绿茶纯茶饮料中吡虫啉和啶虫脒残留的HPLC检测方法。该方法前处理所用提取溶剂毒性较小,成本低廉;所用吸附剂对茶饮料中基质干扰的净化效果理想;方法回收率高、检测限低、重复性好、稳定可靠。该方法也可为其他茶饮料中吡虫啉和啶虫脒的残留量分析提供参考。

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收稿日期:2012-09-26

基金项目:国家农业部现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23);华南农业大学校长科学基金项目

作者简介:路海燕(1987—),女,硕士研究生,研究方向为农药残留检测。E-mail:luhaiyan_20062008@126.com

*通信作者:张媛媛(1983—),女,讲师,博士,研究方向为食品安全与质量控制、茶饮料加工。E-mail:zhangyy@scau.edu.cn