双水相萃取-流动注射化学发光法测定果蔬中残留α-萘乙酸

高向阳1,2，王 珊2，陈 双1，朱盈蕊3

(1.郑州科技学院食品科学与工程学院，河南 郑州 450064；

2.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；3.郑州市质量技术监督检验测试中心，河南 郑州 450006)

摘 要：建立一种快速测定果蔬中残留α-萘乙酸的新方法。α-萘乙酸经乙醇-(NH4)2SO4溶液双水相体系萃取，利用其对Luminol-H2O2-Cr3+化学发光体系的抑制作用进行测定。结果表明：方法的线性范围为1.0×10-9～1.0×10-4mol/L，r=0.9976，对1.0×10-8mol/L α-萘乙酸进行11次平行测定的相对标准偏差为3.2%，按3倍标准偏差计算的方法检出限为3.98ng/g，平均加标回收率为88.9%～92.1%。该法线性范围宽、灵敏度高、易实现自动化，用于测定果蔬中残留的α-萘乙酸，结果令人满意。

关键词：双水相萃取；流动注射化学发光；果蔬；α-萘乙酸

Determination of α-Naphthaleneacetic Acid in Vegetables and Fruits by Flow Injection Chemiluminescence

with Aqueous Two-Phase Extraction

GAO Xiang-yang1,2，WANG Shan2，CHEN Shuang1，ZHU Ying-rui3

(1. School of Food Science and Engineering, University for Science and Technology Zhengzhou, Zhengzhou 450064, China；

2. College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；

3. Zhengzhou Supervision and Testing Center for Quality and Technology, Zhengzhou 450006, China)

Abstract：A flow injection chemiluminescence method was established for the fast determination of α-naphthaleneacetic acid (NAA) in vegetables and fruits based on its suppressive effect on the reaction between Luminol and hydrogen peroxide. NAA residue was extracted with ethanol/ammonium sulfate. The linear range of this method was 1.0 × 10-9 to 1.0 × 10-4 mol/L, with correlation coefficient of 0.9976, the detection limit was 3.98 ng/g, the relative standard deviation (RSD) was 3.2% for 11 parallel determinations, and the recovery rate was 88.99% to 92.1%. This method had the advantages of wide linear range, high sensitivity and ease of automatic operation and was applied with satisfactory results in the determination of NAA in vegetables and fruits.

Key words：aqueous two-phase extraction；flow injection-chemiluminescence；vegetables and fruits；α-naphthaleneacetic acid

中图分类号：O657.39 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0213-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320045

α-萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid，NAA)是广谱型植物生长调节剂，在促进细胞分裂、调节植物生长发育、诱导形成不定根、防止落花落果、增加坐果等方面有重要的调控作用[1-2]，已广泛应用于农业生产。因α-萘乙酸有一定的毒性，可通过食道引起中毒，对肝、肾造成一定的损害，所以也是一种环境污染物。因室温条件下NAA的溶解度较小，常制成钾或钠盐水溶液使用[3]。测定NAA的方法有高效液相色谱法[4-5]、气相色谱法[6]、荧光光谱法[7-8]、分光光度法[9]、磷光光谱法[10]等。这些方法，有的需要大型精密贵重仪器，操作复杂，成本较高；有的灵敏度较低，无法满足工作需要。SN 0346—95《出口蔬菜中α-萘乙酸残留量检验方法》中规定了出口蔬菜中α-萘乙酸残留量的气相色谱检测方法，检测限为0.02mg/kg，回收率为89.5%～103.2%。双水相萃取因其分相时间短、条件温和、操作简便等优点，已在生物工程、食品工业等领域得到应用[11-13]。目前，采用双水相萃取-流动注射化学发光法测定NAA尚未见文献报道。

流动注射化学发光法具有线性范围宽、灵敏度高、设备简单、易实现自动化等优点[14-17]，在食品科学、免疫分析、药物检验等领域得到迅速发展。本实验基于NAA对Luminol-H2O2-Cr3+化学发光体系的抑制作用，旨在建立测定NAA的流动注射化学发光分析法，以期检测效果优于高效液相色谱法[18]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西红柿、苹果、猕猴桃等样品购于郑州市丹尼斯超市。

2.0×10-2mol/L Luminol储备液：准确称取Luminol 0.8850g，用0.10mol/L NaOH溶液钠溶解并定容于250mL棕色容量瓶中，混匀，避光保存14d后备用。

1.0×10-2mol/L三氯化铬标准储备液：称取0.2665g干燥至恒质量的三氯化铬，用重蒸水溶解并定容于100mL容量瓶中，备用。

2.0×10-3mol/L α-萘乙酸标准储备液：准确称取85℃条件下干燥至恒质量的α-萘乙酸0.0372g于小烧杯中，用0.10mol/L NaOH溶液溶解，移于100mL容量瓶中定容，备用。

2.0×10-1mol/L H2O2溶液(内含1.0×10-4mol/L EDTA溶液)：移取30g/100g的过H2O2 5.10mL，用水定容于250mL棕色容量瓶中，摇匀，用时再逐级稀释。

所用试剂均为分析纯，水为二次去离子石英亚沸重蒸水。玻璃器皿均用(1:4，V/V)硝酸溶液浸泡6h以上，用重蒸水洗净后使用。

1.2 仪器与设备

IFFM-D型流动注射生物发光分析仪、IFFS-A型多功能化学发光检测器 西安瑞迈电子科技有限公司；SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器 江苏省宜兴市勤华石英玻璃仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；FA2004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；榨汁搅拌机 广东美的生活电器制造有限公司；TDL-5-A型低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

配制1.00×10-9～1.00×10-4mol/L α-萘乙酸系列标准溶液各50.00mL，同时配制空白溶液，在优化实验条件下，按表1设定的工作参数测定各溶液。以α-萘乙酸浓度的负对数为横坐标，相对化学发光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

表 1 化学发光仪工作参数的设定

Table 1 Working parameters for the chemiluminescence instrument

1.3.2 样品的处理与测定

样品匀浆后准确称取2g左右(确到0.0001g)于25mL比色管中，分别加入硫酸铵6g、水10.00mL、无水乙醇8.00mL，用水稀释至刻度，摇匀振荡10min，静置30min，使两相完全分离后，取乙醇相在5000r/min条件下离心5min，取上清液5.00mL于小烧杯中，蒸发掉乙醇，加水溶解并定量转移至25mL容量瓶中定容，同时配制空白溶液[19]。在与标准曲线完全相同的条件下测定，由标准曲线或回归方程求出NAA的浓度(c，mol/L)，按下式计算样品中NAA的质量分数(ω，μg/g)：

式中：ω为样品中NAA的质量分数/(μg/g)；m为称取的样品质量/g；186.21为NAA的摩尔质量/(g/mol)；c为NAA的浓度/(mol/L)。

2 结果与分析

2.1 化学发光仪工作参数设定

在光电倍增管负高压为400V、仪器增益为1的条件下对仪器工作参数进行优化。结果表明：按表1工作参数运行，仪器的发光信号稳定，测定结果重现性较好。

2.2 反应介质的选择

Luminol浓度5.0×10-4mol/L、H2O2浓度6.0×10-2mol/L、NAA浓度1.0×10-5mol/L、Cr3+浓度1.0×10-4mol/L时，分别以相同浓度的NaOH、Na2CO3、NaHCO3为反应介质，按表1工作参数测定Luminol-H2O2-Cr3+-NAA体系的化学发光强度，结果表明，介质为NaOH时测定结果较好。相同条件下，考察NaOH在1.0×10-4～5.0×10-3mol/L范围内对发光体系的影响，结果见图1。

图 1 NaOH浓度对相对化学发光强度的影响

Fig.1 Effect of sodium hydroxide concentration on the

relative chemiluminescence intensity

由图1可知，NaOH浓度为5.0×10-4mol/L时相对化学发光强度最大，因此，选择5.0×10-4mol/L NaOH为反应介质。

2.3 Luminol浓度的选择

NaOH浓度5.0×10-4mol/L、H2O2浓度6.0×10-2mol/L、NAA浓度l.0×10-5mol/L、Cr3+浓度1.0×10-4mol/L时，考察Luminol在3.0×10-4～7.0×10-4mol/L范围内对相对化学发光强度的影响，结果见图2。

图 2 Luminol浓度对相对化学发光强度的影响

Fig.2 Effect of luminol concentration on the relative chemiluminescence intensity

由图2可知，Luminol浓度为4.0×10-4mol/L时相对化学发光强度最大，实验选择Luminol浓度为4.0×10-4mol/L。

2.4 H2O2浓度的选择

NaOH浓度5.0×10-4mol/L、Luminol浓度4.0×10-4mol/L、NAA浓度1.0×10-5mol/L、Cr3+浓度1.0×10-4mol/L时，考察H2O2在4.0×10-3～1.0×10-2mol/L范围内对相对化学发光强度的影响，结果见图3。

图 3 H2O2浓度对相对化学发光强度的影响

Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on the

relative chemiluminescence intensity

由图3可知，H2O2浓度为5.0×10-3mol/L时相对化学发光强度最大。故选择H2O2浓度为5.0×10-3mol/L。

2.5 Cr3+浓度的选择

NaOH浓度5.0×10-4mol/L、Luminol浓度4.0×10-4mol/L、H2O2浓度5.0×10-3mol/L、NAA浓度1.0×10-5mol/L时，考察Cr3+在3.0×10-5～9.0×10-5mol/L范围内对相对化学发光强度的影响，结果见图4。

由图4可知，Cr3+浓度为5.0×10-5mol/L时相对化学发光强度最大。实验选择Cr3+浓度为5.0×10-5mol/L。

图 4 Cr3+浓度对相对化学发光强度的影响

Fig.4 Effect of Cr (Ⅲ) concentration on the relative

chemiluminescence intensity

2.6 样品萃取条件的确定

取1.00×10-4mol/L NAA溶液1.00mL代替样品，置于25mL比色管中，分别加硫酸铵6.00g、水10.00mL、无水乙醇8.00mL，按1.3.2节操作，然后向两相分离后的硫酸铵溶液中再次加无水乙醇8.00mL，按1.3.2节再次进行测定；同时向猕猴桃样品两相分离后的硫酸铵溶液中再次加入无水乙醇8.00mL，按1.3.2节操作。结果表明：两次萃取实验的测定信号与NAA空白溶液的测定信号无显著差异。说明按1.3.2节条件萃取，即能满足测定方法的需要。

2.7 干扰实验

在选定的最佳实验条件下，考察NAA中共存组分的干扰情况，结果表明：对于1.0×10-7mol/L的NAA溶液，测定的相对误差不大于±5%时，200倍量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl−；2000倍量的酒石酸、苯甲酸、柠檬酸、水杨酸、抗坏血酸均不干扰测定。

2.8 标准曲线及相关系数

按1.3.1节方法绘制标准曲线，可知NAA在1.0×10-9～
1.0×10-4mol/L范围内有良好的线性关系，线性方程为y=−1335x＋15964，R2=0.9953，r=0.9976。

2.9 方法检出限和精密度

在优化实验条件下对1.0×10-8mol/L NAA标准溶液进行11次平行测定，相对标准偏差(RSD)为3.2%。按3倍标准偏差计算的方法检出限为3.98ng/g。

2.10 测定结果及回收率

在优化实验条件下，样品经处理后进行5次平行测定，检验无可疑值后，取测定平均值报告，同时进行加标回收实验，结果见表2。

由表2可知，西红柿、苹果样品中未检出NAA，说明样品中NAA含量低于此法检出限。猕猴桃样品中NAA 5次平行测定的RSD为3.2%，测定平均值为0.0257µg/g，低于日本肯定列表制度规定的NAA的最高残留限量0.1µg/g。平均加标回收率为88.9%～92.1%。

表 2 样品测定结果及回收率

Table 2 Content and recovery of NAA in spiked fruit samples

注：—.未检出。

3 结 论

将双水相萃取前处理技术与流动注射化学发光分析技术相结合，测定果蔬中残留α-萘乙酸。样品预处理简便快速，成本低廉。方法的灵敏度、检出限较为理想。对样品进行加标回收实验，结果令人满意，为果蔬中残留α-萘乙酸的测定提供了一种较为灵敏、可靠的分析方法。

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