TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法测定食品中金黄色葡萄球菌的比较研究

凌秀梅1，陈礼玲1，张 敏1，吴远根2，叶 梅1，万渝平1,*

(1.成都市产品质量监督检验院，四川 成都 610041；2.上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

摘 要：使用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板计数法对速冻食品、生鲜乳、肉制品、冷食菜和调味品5类共150组样品进行金黄色葡萄球菌加标实验，结果表明两种方法检测结果符合率高达94.67%，并且检测结果P值均大于0.05，无显著性差异。同时使用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板计数法对冷食菜、调味品、糕点、方便食品、生鲜乳、速冻食品和生肉7类共300组自然样品进行检测验证，结果显示两种方法的金黄色葡萄球菌检出率分别为33.33%和31.33%，对阳性结果进行统计学分析发现两种方法无显著性差异。

关键词：TEMPO/STA法；Baird-Parker平板计数法；金黄色葡萄球菌；食品

Reliability Comparison of TEMPO/STA Method with Baird-Parker Method for the Determination of Staphylococcus aureus in Foods

LING Xiu-mei1，CHEN Li-ling1，ZHANG Min1，WU Yuan-gen2，YE Mei1，WAN Yu-ping1,*

(1. Chengdu Product Quality Supervision and Inspection Institute, Chengdu 610041, China；

2. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Abstract：In this study, TEMPO/STA method and Baird-Parker method in the Chinese national standard GB 4789.10—2010 were used to count Staphylococcus aureus in 150 samples from five kinds of foods including quick-frozen foods, raw milk, meat products, cold fish products and condiments. The results showed that there were good coincidence rate as high as 94.67% and the P value was larger than 0.05, suggesting that no significant difference between the two methods. The positive rates of Staphylococcus aureus with TEMPO/STA method and Baird-Parker method were 33.33% and 31.33%, respectively in 300 natural samples assigned to 7 groups including cold dish, condiment, pastry, convenient foods, raw milk, frozen foods and raw meat. Statistical analysis showed no significant difference between the two methods.

Key words：TEMPO/STA method；Baird-Parker method；Staphylococcus aureus；food

中图分类号：TS207.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0246-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320052

金黄色葡萄球菌在自然界普遍存在，是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一，其产生的肠毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破坏，并具有致病性[1]。据报道，每100g食物中含18μg肠毒素时即可引起金黄色葡萄球菌食物中毒[2-4]。我国每年由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件数量较多，95%的金黄色葡萄球菌携带SEA-SEE基因，因而对金黄色葡萄球菌的检测有着非常重要的意义[5-7]。我国食品安全国家标准GB 4789.10—2010《食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验》[8]对金黄色葡萄球菌的检测主要采用传统的分离方法，如Baird-Parker法，该法主要依赖前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和血浆凝固酶实验等步骤。传统检测方法操作繁琐，耗时较长，灵敏度相对较低，且易发生漏检。随着食品中致病菌检测技术的不断发展，金黄色葡萄球菌的检测技术也得到了很大提高，除了传统培养方法，免疫学、生物化学和分子生物学等先进技术正逐步应用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测[9-10]。以抗体为基础的金黄色葡萄球菌检测方法大致有5～6种，如酶联免疫吸附法、反向被动胶乳凝集法、放射免疫测量法、反向血凝实验、显微玻片凝胶双扩散法等[11]。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术在金黄色葡萄球菌检测中也发挥着重要的作用，经过多年的发展，利用多重PCR和实时荧光PCR技术已成为检测金黄色葡萄球菌的发展趋势[12-13]。随着研究的深入，许多快速检测方法已经商品化[14-15]，如法国梅里埃公司生产的RPF试剂盒和API检测系统等，美国3M公司生产的金黄色葡萄球菌快速检测试纸片及利用免疫技术制造的一些快速检测试剂盒。

TEMPO/STA法是使用TEMPO全自动微生物定量检测仪对食品进行金黄色葡萄球菌计数的一种快速检测方法。对TEMPO/STA法的工作原理及应用情况已有相关文献[16-19]报道，不过关于TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法相比较的文献却很少。为了确定TEMPO/STA 法的有效性，本研究同时使用现行国家标准方法中的Baird-Parker平板计数法和TEMPO/STA法对食品中金黄色葡萄球菌进行检测和计数，比较这两种方法的检测结果，旨在探求一种适应微生物实验室要求的快速检测方法，为今后食品中金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC6538、大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC8099、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC11778 北京陆桥技术有限责任公司；甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)来自本实验室菌种室。

营养肉汤(NB)、脑心浸出液肉汤(BHI)、Baird-Parker琼脂基础、亚碲酸盐卵黄增菌液 北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

HVE-50高压蒸汽灭菌锅 日本Hirayama公司；MIR-253生化培养箱(36℃±0.5℃) 日本Sanyo公司；MIX2拍击式均质器 法国AES公司；MS3 digital漩涡混合器 德国IKA公司；AR5120天平(精确度0.01g) 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；TEMPO®自动微生物定量检测仪(配有TEMPO®充填器、TEMPO®读数器)、TEMPO®金黄色葡萄球菌计数卡、TEMPO®金黄色葡萄球菌培养基瓶、TEMPO®无菌过滤袋 法国梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 样品类型和制备

1.3.1.1 样品类型

本研究选取150组食品样品进行加标比较实验，如表1所示。同时选取300组食品样品进行验证实验，如表2所示。所有样品均为企业自送样。

表 1 加标实验样品的类别和数量

Table 1 Amounts of different groups of spiked samples

表 2 验证实验样品的类别和数量

Table 2 Amounts of different groups of samples used for validation experiments

1.3.1.2 人工染菌样品制备

从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538标准菌株的斜面上，用接种环挑取一环菌落到盛有100mL营养肉汤中，于37℃温度下过夜培养(14～18h)，得到初始细菌培养液。将初始培养液用磷酸盐缓冲液稀释成合适浓度的工作液，初始培养液及工作液的菌浓度均采用Baird-Parker平板计数法测定，每个稀释度重复测定2次。称取25g 固体样品或25mL液体样品，加入225mL的稀释溶液，均质，再加入1mL工作液，混匀后检测。

1.3.1.3 自然样品制备

自然样品的制备方法按照GB 4789.10—2010中的第2法Baird-Parker平板计数法进行：无菌操作取25g(或25mL)样品于无菌过滤袋中，加入225mL磷酸盐缓冲液，拍击均质，制成1:10(对于液体样品是体积比，对于固体样品则是质量比)的样品匀液，然后依次制成10倍递增稀释的样品匀液，同时用于Baird-Parker平板计数法和TEMPO/STA法的测定，每个稀释度重复测定2次。

1.3.2 选择性鉴定实验

将标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌ATCC8099、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、甲型副伤寒沙门氏菌和表皮葡萄球菌隔夜培养的肉汤培养物以磷酸盐缓冲液10倍系列稀释，选择合适菌液浓度分别涂布Baird-Parker平板，36℃培养48h，观察各菌株的生长情况，同时取1mL菌液用TEMPO/STA 法测定，比较两种方法的特异性。

1.3.3 加标比较实验

将选取的5类食品共150组样品按照1.3.1.2节方法制备样品，然后采用Baird-Parker平板计数法与TEMPO/STA法测定样品中的金黄色葡萄球菌。考察两种方法对人工染菌样品的检测结果之间是否存在显著性差异。

1.3.4 验证实验

将选取的7类食品共300组样品按照1.3.1.3节方法制备样品，然后采用Baird-Parker平板计数法与TEMPO/STA法测定样品中的金黄色葡萄球菌。考察两种方法对自然样品的检测结果之间是否存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 选择性鉴定实验

5株标准菌株的选择性鉴定实验结果见表3，金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基中生长良好，特征菌落明显，表皮葡萄球菌在此培养基中虽有生长，但没有特征性菌落，其余实验菌株在此培养基中均不生长。利用TEMPO仪器测得所含金黄色葡萄球菌数为6.5×102CFU/mL，测得其他实验菌株的结果均为小于10CFU/mL，说明两种方法对金黄色葡萄球菌的检测特异性较强。

表 3 两种方法选择性鉴定实验结果

Table 3 Comparison of the results obtained in selective identification by the two methods

2.2 TEMPO/STA 法与Baird-Parker平板计数法的加标比较实验

2.2.1 TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法检测结果的符合性分析

表 4 TEMPO/STA法与Baird-Parker法检测不同类型食品的符合率

Table 4 Coincidence between the results obtained by the methods for the detection of different categories of food samples

注：a.“符合”系指︱lg STA −lg GB︱＜1，表明两者计数值在同一数量级之内；b.“不符合”系指︱lg STA−lg GB︱＞1，表明两者计数值超出同一数量级[20]。

如表4所示，在对150组不同种类食品的人工染菌检测实验中，TEMPO/STA法和Baird-Parker平板计数法在检测结果上有较高的符合性。肉制品、冷食菜和调味品的符合率最高，为96.67%，其次为速冻食品，符合率为93.33%，生鲜乳的符合率最低，为90%。分析原因，可能是由于速冻食品及生鲜乳中存在着大量背景菌落的干扰，以至于这两类产品的符合率相对较低。总体符合率对比如图1所示，TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法检测结果一致的样品数量为142组，占样品总数的94.67%，同时有8组样品检测结果的对数值之差大于1，即不符合率为5.33%，其原因为原料含有强抑制剂(如香料、高盐分产品)或样品色泽较深影响读数器的荧光判断；同时，深色产品稀释度选择不合适或样品本身存在大量背景菌落的干扰也是导致两种方法检测结果不符合的原因。

图 1 Baird-Parker平板计数法与TEMPO/STA法检测食品中

金黄色葡萄球菌结果的符合率对比图

Fig.1 Comparison between the results obtained for the detection of Staphylococcus aureus by the two methods

2.2.2 TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法检测结果的统计分析

表 5 TEMPO/STA法与Baird-Parker法检测食品中金黄色葡萄球菌的统计分析

Table 5 Statistical analysis of the two methods for the detection of Staphylococcus aureus in foods

由表5可知，速冻食品、生鲜乳、肉制品、冷食菜和调味品配对t检验的P值分别为0.436、0.510、0.606、0.510和0.675，总体样本P值为0.883，均大于0.05，说明两种方法的检测结果不存在显著性差异。

2.2.3 TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法检测结果的相关性分析

图 2 两种方法检验不同类型食品样品结果的相关性

Fig.2 Correlation between the two methods

由图2可知，这两种方法测定150组人工染菌样品所得金黄色葡萄球菌数的相关系数为0.9039，说明这两种方法具有很高的相关性和一致性。

2.3 TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法的验证实验

表 6 两种方法对金黄色葡萄球菌检出率结果的比较

Table 6 Comparison of the positive rates from the two methods

如表6所示，冷食菜、调味品、糕点和方便食品这4类样品共82组样品中，两种方法检测结果均为金黄色葡萄球菌阴性。而90组生鲜乳中，TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法的金黄色葡萄球菌检出率分别为53.33%和50.00%，78组速冻食品的金黄色葡萄球菌检出率分别为41.03%和38.46%，50组生肉其检出率分别为40.00%和38.00%。对于两种方法检测结果均为阳性的样本进行配对t检验分析，如表7所示，生鲜乳、速冻食品及生肉配对t检验的P值分别是0.153、0.808和0.647，总体样本P值为0.341，均大于0.05，说明两种方法检测自然样品时不存在显著性差异。

表 7 TEMPO/STA法与Baird-Parker法检测结果的统计分析

Table 7 Statistical analysis of the two methods

2.4 两种检测方法各项指标的比较

将TEMPO/STA法与Baird-Parker平板计数法的各项指标进行比较，结果见表8，Baird-Parker平板计数法检测时间为78h，操作繁琐，工作量较大。而TEMPO/STA法则将检测时间缩短至24h，并且其操作简便，工作量较小，因此TEMPO/STA法在检测样品的金黄色葡萄球菌时具有较大的优势。

表 8 两种检测方法的各项指标比较

Table 8 Comparison between the two methods in terms of various figures of merit

3 结 论

3.1 通过选择性鉴定实验，结果表明两种方法对金黄色葡萄球菌的选择性良好。采用TEMPO/STA与Baird-Parker平板计数法检测150组人工染菌样品，结果符合率较高，为94.67%，两种方法的相关系数为0.9039，具有很高的相关性和一致性，且两种方法对300组自然样品的检测结果无统计学差异。

3.2 从两种方法检测金黄色葡萄球菌的各项指标比较来看，Baird-Parker平板计数法需在接种后48h观察平板，并挑取可疑菌落转种到BHI肉汤中，再经18～24h培养后做血浆凝固酶实验进行验证，最终计数，前后约需78h，检测时间长、操作步骤繁琐、工作量大。TEMPO/STA法检测时间大大缩短，仅需24h。该法作为一种全新的自动微生物定量检测法，具有全面自动化的特点，加样充填、读数、报告均由仪器完成，流程标准化，并且每张TEMPO/STA测试卡都有独立的条码，保证检测结果的唯一性和可追溯性。在检测量较大的情况下，TEMPO/STA法使用TEMPO®充填器进行样品的递增稀释，节省大量人力、物力，同时避免了样品的二次污染，检测结果由TEMPO®读数器判读，减少检测结果的人为误差。尤其是在实验过程中不需要新鲜兔血浆便可得到确定的结果，这在食品应急检测方面更显其使用方便的优越性，也值得在基层实验室的日常检测中推广应用。

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