16S rRNA的分子生物学方法分析牛奶中的细菌菌群

李引强1,2，朱宝利2，吴 俊2，王秋涯3，高可心4，律 娜2,*，张庆波1

(1.河北联合大学基础医学院，河北 唐山 063000；2.中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101；

3.清华大学附属中学，北京 100084；4.中国人民大学附属中学，北京 100080)

摘 要：选择4个不同生产厂家的市售牛奶作为研究对象，提取牛奶中细菌的基因组DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)-克隆-测序的方法获得牛奶中菌群的16S rRNA-V3区序列信息，运用生物信息学分析牛奶中细菌种类、菌群多样性和菌群结构；荧光定量PCR法测定样品中的细菌总数。结果表明：各品牌牛奶中均含有大量细菌的16S rRNA-V3区DNA序列；牛奶样品中测序共得到472条16S rRNA-V3区序列，其中有452条序列可以明确鉴定到属，包括3个革兰氏阳性菌属和14个革兰氏阴性菌属；20条序列可以鉴定到纲的水平。各品牌牛奶中细菌总数均处于相对较高水平；4个厂家牛奶间菌群分布不同，菌群多样性存在差异。

关键词：市售牛奶；16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)；菌群分布；细菌总数

Molecular Biological Analysis of Bacterial Community in Milk Based on 16S rRNA Gene

LI Yin-qiang1,2，ZHU Bao-li2，WU Jun2，WANG Qiu-ya3，GAO Ke-xin4，Lü Na2,*，ZHANG Qing-bo1

(1. College of Basic Medical Sciences, Hebei United University, Tangshan 063000, China；

2. Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China；

3. The High School Attached to Tsinghua University, Beijing 100084, China；

4. The High School Afiliated to Renmin University of China, Beijing 100080, China)

Abstract：The number of bacteria in milk has gained growing attention as the new national dairy standard is implemented. However, few people are concerned about its bacterial species and flora. Bacterial communities in milk samples from 4 manufactures were analyzed. Bacterial genome DNA was extracted from milk and molecular segments of the V3 region of the 16S rRNA gene was obtained by PCR, cloning and sequencing. Bacterial species, diversity and flora were analyzed by bioinformatics. Bacterial counts of samples were measured by florescent real-time quantitative PCR. The results showed that molecular segments of the V3 region in the 16S rRNA existed in large quantities in milk. Among 472 clones of the V3 region in the 16S rRNA obtained from sequencing, 452 could be clearly classified to genera, including 3 Gram-positive (G+) and 14 Gram-negative (G-) species, and 20 others could be classified to the class level. These results indicated that the bacterial counts were all at a high level in different milk. Samples from 4 manufactures differed in their bacterial communities, and the diversity of bacterial flora was obviously different.

Key words：commercial milk；16S rRNA；bacterial flora；bacterial count

中图分类号：Q93.331 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0255-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320054

微生物污染是引起牛奶质量问题的重要方面，因此生奶中的细菌成为消费者关注的焦点。牛奶中的细菌可能来自奶牛的患病乳房、挤奶、储存及加工过程。但即使是规范的挤奶操作，也难免有微生物的污染，它们可能来自乳头管[1]或者牛的肠道[2-3]。所以牛奶中含有一定量的细菌是不可避免的。调查结果表明，一般鲜奶中的细菌数是102～103个/mL；在极其严格的无菌操作条件下，用机器挤出的奶其总菌数一般为104个/mL；在4℃冷藏条件下可以将鲜奶中微生物的数量控制在104～105个/mL[4]。我国乳品新国标中规定合格的生奶应该出自健康奶牛、细菌总数少于2×106个/mL，这个规定远低于乳业发达国家最高105个/mL细菌总数的要求，但是没有对牛奶中具体的细菌种类进行规定。而世界乳业发达国家对于原料奶(即生奶)的质量要求还包括腐败菌数量低、没有病原菌或病原菌数量极低等。我国的标准可能会导致乳品生产企业及监管单位在控制生奶质量的时候只注重细菌的数量而忽视腐败菌甚至病原菌的检测力度。

生奶中致病细菌以及腐败细菌的分布还可以反映奶牛的健康状况、生奶的卫生情况及储存时间等。如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等细菌是导致奶牛患上乳腺炎的主要病原菌[5-6]，所以患有乳房炎(包括隐性型或临床型)的奶牛生产的牛奶中这些病原菌检出比率远高于健康奶牛产的牛奶。史春光等[7]调查了5个有代表性的奶户在挤出至交奶这段时间里细菌的变化情况，发现随着挤奶环境卫生和储存温度的不同，牛奶里的细菌总量有较大的变化。同时，牛奶中的菌群数量、结构是会随着储存温度及时间的变化而产生一系列变化。陈燕飞[8]的研究表明在30℃恒温箱条件下，牛奶的发酵主要分为4个时期，每个时期的主要细菌分别是乳链球菌(第1期)、乳杆菌(第2期)、酵母菌(第3期)和腐败细菌(第4期)。而长时间的低温储存(4℃)，会使一些耐冷细菌逐渐成为优势细菌[9-10]。

目前，对于环境中微生物菌群的研究主要分为培养和非培养的方法。培养法是利用不同的选择性培养基结合生化反应鉴定细菌的种类。该方法具有一定的针对性，但是费时耗力，且只能获得可培养微生物的信息，对于那些不可培养的细菌则无能为力[11-13]。非培养的方法主要是通过分子生物学技术，直接从环境中提取细菌基因组DNA，再用分子生物学的方法进行分析研究，如聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)、核酸杂交(hybridization)、高通量测序(high-throughput sequencing)等。目前分析细菌的16S rRNA序列已经成为细菌菌种鉴定的“金标准”。16S rRNA全长为1.5～1.6kb，包括9个“高度可变区”，其中V3区(nucleotides 433～497)的位点456～479在细菌间的比对中获得最多的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，能够鉴定110多种细菌[14]。研究者已经利用16S rRNA-V3区结合PCR-DGGE、测序等技术对环境中的细菌进行鉴定及菌群分析研究[9,15]，其中包括对牛奶中细菌的鉴定和菌群分析[11]，并发现牛奶中存在多种细菌，具有较高的菌群多样性。

本研究从市售的常温牛奶和巴氏消毒牛奶中提取细菌基因组DNA，利用通用引物扩增牛奶中细菌的16S rRNA-V3区，荧光实时定量PCR测定样品中细菌总数；通过克隆、测序，获得16S rRNA-V3区的序列信息，再进行序列比对、鉴定菌种。分析不同品牌牛奶中的细菌数量、菌群分布，以期推测出生奶的奶源环境、储存时间及奶牛的健康情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品收集：从超市购买4个品牌的5种牛奶，包括高温灭菌奶(常温保质期30d)和巴氏消毒牛奶(2～6℃保质期7d)，分别标记为A、B、C、D、E。样品A、B、C为高温灭菌奶，D、E为巴氏灭菌奶，C和D是同一品牌的常温奶和巴氏奶，每种牛奶收集了同1批次的3个样品。所有的样品均在2012年5～7月进行取样。

DNA Stool 提取试剂盒 德国Qiagen公司；Premix Tap Version 2.0、pMD®18-T Vector 日本Takara公司；Cycle-Pure试剂盒 美国Omega公司；Trans DH5α感受态细胞 北京全式金生物技术有限公司；SYBR®FAST qPCR试剂盒 美国Kapa公司。

1.2 仪器与设备

Nanodrop ND 1000分光光度计 美国Thermo公司；GeneAmp PCR System 2720热循环仪、7300实时定量PCR仪 美国ABI公司；Allgre X-22R 离心机 美国Beckman公司；PowerPac Basic电泳仪 美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统 美国Alpha Innotech公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

取100mL的牛奶样品用Collado等[16]的方法提取牛奶中的细菌DNA 7150×g离心20min，弃掉上层溶液，收集沉淀，用5mL TE(1×)重新悬浮沉淀；7150×g离心5min，弃掉上层溶液，沉淀用DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。提取的DNA溶解在50µL的TE(1×)中，用分光光度计测定DNA质量浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA片段大小。样品于－20℃冰箱中保存备用。

1.3.2 16S rRNA PCR

用通用引物338F-CCTACGGGAGGCAGCAG，534R-ATTACCGCGGCTGCTGG扩增16S rRNA-V3区[17]。引物由上海生物生工(北京合成部)有限公司合成。PCR反应体系为：Premix Tap Version 2.0 10µL，上、下游引物各10µmol/L，模板20ng，补水(PURELAB Ultra-ELGA纯化水，高压灭菌备用)到20µL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，100V、40min，紫外光下观察电泳条带。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，测定质量浓度。纯化产物用于随后的克隆实验。

1.3.3 序列信息分析

测序获得的序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast进行16S ribosomal rRNA sequences(bacteria)的比对，当MAX indent≥98%时，记录该序列对应的细菌属名和一致的始末位点。用BioEdit软件对所得的序列根据一致位点提取16S rRNA-V3区的扩增序列，用Clustal X(1.83)进行序列比对。RDP-classifier在线软件http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp对所有序列进行菌属鉴定，对每个样品的菌属进行归类。用“1－ΣH2”(H是每种菌属序列数占样本所有菌属序列总数的百分比)评估每个牛奶样品中的DNA菌群多样性[18]。PAUP versions 4.0软件构建Neighbor-Joining系统发育树。

1.3.4 16S rRNA 基因的实时荧光PCR定量细菌总数

提取的牛奶中细菌DNA用于模板定量细菌总数，DNA克隆获得的pMD®18-16S rRNA重组质粒用于标准品的制备。10倍梯度稀释的质粒用于实时定量PCR中标准曲线的生成。反应体系为：SYBR®Green Master Mix(2×)10µL，上、下游引物各4µmol/L，模板20ng，补水到20µL。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性3s，60℃延伸40s，共40个循环。数据结果用7300 System SDS Software进行分析。每孔3个重复。

2 结果分析

2.1 DNA提取与PCR扩增

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 样品A、B、C、D、E的16S rRNA的PCR产物；N.阴性对照。

图 1 样品16S rRNA-V3区PCR扩增部分结果

Fig.1 PCR amplification of the V3 region of the 16S rRNA

由图1可知，实验成功提取了5种牛奶的15个样品的细菌基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳的结果显示，DNA呈现弥散状，没有明显的主带。用16S rRNA-V3区的通用引物对全部样品进行PCR扩增，均得到约为190bp的扩增片段，阴性对照无扩增条带。在15个PCR扩增产物中随机选择了5个(每个品牌选择一个样本)进行T-A克隆。每个样品得到了至少1000个克隆，随机选取100个克隆进行测序(表1)。

2.2 牛奶中的细菌总数

利用检测细菌的16S rRNA基因数量来反映牛奶中细菌总数。结果显示，所有牛奶样品中均含有大量的16S rRNA基因片段。考虑到不同种类细菌中16S rRNA基因的拷贝数在2～15个[19]，实验对绝对定量获得的数据进行最小化和最大化处理(各样品中的细菌16S rRNA基因按照最小拷贝数和最大拷贝数计算)，所得结果和国家标准进行比较(图2)。按照每个细菌含有最少16S rRNA基因拷贝数计算获得最大细菌总数，各品牌牛奶样品中最大细菌总数均低于国家标准。

图 2 各样品中细菌总数和国家标准、国外标准的比较

Fig.2 Comparison of bacterial counts in samples detected by the developed method, the Chinese domestic standard and the international standard

2.3 菌种鉴定及菌群结构分析

实验对5个牛奶样品的500个克隆进行了测序，成功获得了472条16S rRNA-V3区的序列，其中有131种不同的序列。样品A和B分别得到93条和92条序列，其中A中有21种不同的序列，样品B中有27种不同序列。C、D、E分别得到95、96、95条序列，不同的序列数目为41、51、30(表1)。菌属鉴定的结果表明，472条序列中的452条序列可以鉴定到5个纲的17个属：芽孢杆菌纲(bacilli)占12%、黄杆菌纲(Flavobacteria)占3%、β-变形菌纲(beta-Proteobacteria)占2%、放线菌纲(Actinobacteria)占1%和γ-变形菌纲(gamma-Proteobacteria)占82%(表1)。另外的20条序列只能鉴定到纲的水平，分别为黄杆菌纲(5%)、β-变形菌纲(5%)和γ-变形菌纲(90%)。

可以明确鉴定到属的序列中，有58条序列鉴定为3种革兰氏阳性菌，分属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)和链球菌属(Streptococcus)，占总序列的12%。其中Corynebacterium只在样品E中检测到1个克隆；所有的10个Anoxybacillus克隆都是在D样品中检测得到，且与A.kestanbolensis有99%以上的相似性。在样品C和E中都检测到Streptococcus，分别占其所测序列的1%和49%。C样品中的Streptococcus序列鉴定为嗜热链球菌属(S.thermophilus)；E样品中的46个Streptococcus克隆全部与无乳链球菌(S.agalactiae)有100%的相似性(表1)。

表 1 不同样品中的菌属分布

Table 1 The genera number and distribution of different samples

革兰氏阴性菌的序列占所有序列总数的83%，分属于14个属：假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Srratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、嗜冷菌属(Psychrobacter)、希瓦尔氏菌属(Shewanella)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、詹森菌属(Janthinobacteriu)、无色杆菌属(Achromobacter)、微小菌属(Microvirgula)、戴米提亚菌属(Demetria)。其中Pseudomonas最多，占全部序列的46%，其次为Acinetobacter，占23%，而且这两种细菌都以较高比例存在于在所有样品中。Pseudomonas和Acinetobacter在各个样品中检测到的比例分别为：A(71%，16%)、B(75%，13%)、C(30%，43%)、D(40%，17%)、E(16%，25%)(表1，图3)。Serratia在样品A(8%)和B(5%)中检测到；Aeromonas存在于样品B(1%)、C(1%)、D(12%)和E(1%)中；Flavobacterium在样品C(8%)和D(3%)中发现。C样品中有3%的序列为Enhydrobacter，比对结果显示，与气囊栖水菌(E.aerosaccus)有不小于99%的序列相似性。样品C克隆中有2%为Shewanella，序列比对结果证实其为腐败希瓦尔氏菌(S.putrefaciens)。样品C和D中检测到Psychrobacter，分别占比例为3%和1%。Chryseobacterium分布在样品C和E中。Janthinobacterium在C和D中分别占1%和4%(表1)。

图 3 各样品中Pseudomonas和Acinetobacter分别占总细菌数的百分比

Fig.3 Percentages of Pseudomonas and Acinetobacter relative to

total bacterial counts

2.4 优势菌群的系统发育树分析

各牛奶样本中不但检测到的菌属不同，即使是同一菌属，其序列(菌株)也存在差异。由图4a可知，样品A、B的序列集中在上端的分支上，中间的分支中大部分序列出自样本C、D，而样品E的序列集中在下端的分支上。说明同一品牌牛奶中的细菌可能具有更近的亲缘关系。图4b与图4a情况相似，表明同一品牌牛奶中的序列相似性更高。

图 4 Pseudomonas(a)和Acinetobacter(b)的系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree analyses of total Pseudomonas (a) and

total Acinetobacter (b)

2.5 市售牛奶中细菌的多样性

本实验发现各个样品中能够明确鉴定的属为：A～D依次为5、5、11、8、8个，各个样品中有一定差异。为了更好了解牛奶样本中的细菌多样性，利用各样品中所有的序列进行了多样性分析。5个样品A、B、C、D、E的“1－ΣH2”值分别为0.61、0.65、0.93、0.94、0.74，平均值为0.78。可以看出，A和B的菌群多样性明显低于C和D。

3 讨论与结论

3.1 基于16S rRNA-V3区克隆测序鉴定细菌菌群

用分子生物学技术直接从环境中提取细菌DNA并对其进行分析，再结合PCR扩增等方法研究环境中菌群多样性及结构是近年来国内外比较常见的研究方法。如林海龙等[20]对中药废水污泥中的菌群结构的分析。几乎所有这些研究都基于基本的培养法获得生牛奶(即原料奶)中细菌的单克隆，再通过大量培养后提取细菌的基因组DNA进行PCR鉴定。然而市售牛奶，尤其是高温灭菌的市售牛奶，细菌DNA在牛奶中已经成游离状态，对DNA提取的要求比较高。所以如何从市售牛奶中提取到可以用于PCR扩增的DNA成为整个研究成功的关键。本研究通过增加牛奶的使用量，利用提取粪便中细菌DNA的试剂盒成功的从市售牛奶中提取到细菌DNA，并对这些DNA进行细菌16S rRNA-V3区的PCR扩增，成功获得了目的产物。通过T-A克隆和测序分析，得到了不同品牌的5种市售牛奶中菌群的16S rRNA-V3序列信息，并对其进行比对、鉴定。所得结果表明，用该方法可以提取到市售牛奶中的细菌DNA，所提基因组DNA可以用来进行下游的实验研究。

3.2 各品牌牛奶中的细菌总数均处于相对较高水平

实验结果表明各个品牌牛奶中细菌总数均低于国家标准，然而相比较于乳业发达国家的105个/mL细菌数量，各牛奶样品中细菌总数均处于相对较高水平。这与我国部分奶源依赖散户养殖，饲料质量和卫生状况都不佳造成细菌总数不易控制，长时间储存导致的细菌繁殖，以及规模化养殖管理不善不无关系[21]。因此，监督部门应加强管理，促使国内奶制品产业环境进一步得到改善。

3.3 不同品牌牛奶中的菌群结构不同

Tatsuro等[22]用通用引物扩增16S rRNA-V3区的结果显示Lactobacillus和Staphylococcus是牛奶中的主要菌群，Lafarge等[12]也得到的相同的结果；与此不同，Delbes等[11]的结果则表明牛奶中的优势菌群是Clostridium和Lactobacillus；本实验在市售牛奶中检测到的优势菌群是Acinetobacter和Pseudomonas，这与部分研究者的检测结果一致[9-10]。即使同为优势菌群，本实验发现它们在5个样品中所占比例也不尽相同。进化树的聚类分析显示同一属的细菌中，来自同一样本的细菌序列具有更高的相似性，其亲缘关系更近，各个样本中的非优势菌的种类也不同。Vacheyrou等[23]的研究表明大量的微生物菌群转移是从牛棚到挤奶室，然后到牛奶中，而且牛奶中存在的大部分细菌都能在乳头表面发现。因此本实验推测不同品牌牛奶中菌群结构的差异是由于奶源不同所造成的，而奶源环境中的菌群结构存在较大差异。

3.4 牛奶中的致病菌

乳腺炎是世界奶牛养殖业中发病率最高、造成经济损失的主要疾病之一。其病因多为细菌感染。Riffon等[24]根据感染特点提出环境感染和接触感染的观点。环境感染的主要病原菌为大肠杆菌(E. coli)，其次有停乳链球菌(S.dysgalactiae)、乳房链球菌(S.uberis)和副乳房链球菌(S.parauberis)等；接触感染的主要病原菌是金黄色葡萄球菌(S.auresu)和无乳链球菌(S.agalactiae)。本实验在样品E中不仅检测到，且检测到近一半的序列(49%)为S.agalactiae，说明该品牌的该批次生奶可能受到了严重污染。所以本实验怀疑E样品奶源已有患有乳腺炎的奶牛，尽管这些奶牛可能没有表现乳腺炎的病症。

3.5 牛奶中的耐冷细菌

耐冷细菌是牛奶的主要腐败菌，它们被定义为能在7℃生长的细菌[25]。许多研究已经报道，在牛奶冷藏过程中耐冷细菌会大量繁殖，从而影响牛奶质量。在农场和加工厂，制冷技术在保证牛奶品质的同时，也为耐冷细菌的生长提供了选择条件[26]。所以随着生奶低温保存的时间延长，耐冷细菌的数目就会随之增多。Raats等[9]利用基于16S rRNA克隆测序的DGGE对生牛奶在制冷条件下细菌菌群的变化进行研究。结果表明，在农场到乳制品加工厂的冷藏过程中，Gammaproteobacteria 是主要的细菌类群，尤其是耐冷细菌Pseudomonas占总数的46%～63%。Rasolofo等[10]的结果则显示，随着牛奶冷藏时间的延长，Gammaproteobacteria和Bacilli 成为两大主要的细菌类群，分别占总细菌株的40.3%和40%。本实验结果显示，C、D样品中Pseudomonas占全部序列的30%和40%，这与文献报道的结果基本一致。多样性分析表明样品A和样品B在5个样品中多样性低(分别为0.61和0.65)，聚类分析发现其不同的序列数少且集中在一起。Pseudomonas的序列数分别占A和B样品总体的71%和75%，其中相同的序列数分别为54和56。因此本实验推测生奶在加工为市售牛奶前，样品A和B比样品C、D、E低温贮存的时间更长，使得耐冷细菌Pseudomonas大量繁殖，结果降低了牛奶中细菌的菌群多样性。

参考文献：

[1] GILL J J, SABOUR P M, GONG J H, et al. Characterization of bacterial populations recovered from the teat canals of lactating dairy and beef cattle by 16S rRNA gene sequence analysis[J]. Fems Microbiology Ecology, 2006, 56(3): 471-481.

[2] BUSCONI M, REGGI S, FOGHER C. Evaluation of biodiversity of lactic acid bacteria microbiota in the calf intestinal tracts[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2008, 94(2): 145-155.

[3] KAGKLI D M, VANCANNEYT M, VANDAMME P, et al. Contamination of milk by enterococci and coliforms from bovine faeces[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(5): 1393-1405.

[4] HEESCHEN W H. Bacteriological quality of raw milk: legal reguirements and payments systems[C]//Symposium on Bacteriological Quality of Raw Milk, Wolfpassing, Austria, Mar 13-15 1996. Bruxelles (Belgium): International Dairy Federation, 1996: 1-18.

[5] 曹立亭, 胡松华. 奶牛乳房炎主要致病菌在牛奶中的分布[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(34): 19541-19542.

[6] 张善瑞, 王长法, 高运东, 等. 应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌[J]. 家畜生态学报, 2007, 28(4): 78-80.

[7] 史春光, 董平, 王环宇, 等. 生鲜牛乳细菌增长情况及因素分析[J]. 中国乳品工业, 2000, 28(1): 32-35.

[8] 陈燕飞. 牛奶中细菌生态演变及其保鲜与加工[J]. 加工工艺, 2006, 6(4): 18-20.

[9] RAATS D, OFFEK M, MINZ D, et al. Molecular analysis of bacterial communities in raw cow milk and the impact of refrigeration on its structure and dynamics[J]. Food Microbiology, 2011, 28(3): 465-471.

[10] RASOLOFO EA, ST-GELAIS D, LAPOINTE G, et al. Molecular analysis of bacterial population structure and dynamics during cold storage of untreated and treated milk[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 138(1/2): 108-118.

[11] DELBES C, MANDJEE L, MONTEL M C. Monitoring bacterial communities in raw milk and cheese by culture-dependent and independent 16S rRNA gene-based analyses[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(6): 1882-1891.

[12] LAFARGE V, OGIER J C, GIRARD V, et al. Raw cow milk bacterial population shifts attributable to refrigeration[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(9): 5644-5650.

[13] MUNSCH-ALATOSSAVA P, ALATOSSAVA T. Phenotypic characterization of raw milk-associated psychrotrophic bacteria[J]. Microbiological Research, 2006, 161(4): 334-346.

[14] CHAKRAVORTY S, HELB D, BURDAY M, et al. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(2): 330-339.

[15] KUANG Y, TANI K, SYNNOTT A J, et al. Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCR-DGGE method[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 45(1): 76-81.

[16] COLLADO M C, DELGADO S, MALDONADO A, et al. Assessment of the bacterial diversity of breast milk of healthy women by quantitative real-time PCR[J]. Letters in Applied Microbiology, 2009, 48(5): 523-528.

[17] MUYZER G, de WAAL E C, UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695-700.

[18] DANIEL L, HARTL A, ANDREW G C. Principles of population genetics[M]. 4th ed. Sunder land: Sinauer, 2007.

[19] ANNA Y P, WILLIAM E O, CARLOS W N, et al. Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(12): 3886-3897.

[20] 林海龙, 李伟光, 闫险峰, 等. 中药废水污泥群落结构解析中PCR-DGGE 引物的选择与评价[J]. 环境科学, 2011, 32(5): 1505-1510.

[21] 范江平, 毛华明, 主明珠, 等. 饲养和挤奶方式对原料奶中细菌总数的影响[J]. 中国乳品工业, 2004, 32(2): 21-23.

[22] TATSURO H, MIHO K, MASARU N. Molecular-based analysis of changes in indigenous milk microflora during the grazing period[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74(3): 484-487.

[23] VACHEYROU M, NORMAND A C, GUYOT P, et al. Cultivable microbial communities in raw cow milk and potential transfers from stables of sixteen French farms[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(3): 253-262.

[24] RIFFON R, SAYASITH K, KHALIL H, et al. Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(7): 2584-2589.

[25] COUSIN M A. Presence and activity of psychrotrophic microorganisms in milk and dairy-products[J]. Journal of Food Protection, 1982, 45(2): 172-207.

[26] CHAMPAGNE C P, LAING R R, ROY D, et al. Psychrotrophs in dairy-products: their effects and their control[J]. Food Science and Nutrition, 1994, 34(1): 1-30.