高效逆流色谱分离化橘红中黄酮类化合物及组分结构鉴定

尹 鹭1，曹学丽1,*，徐 静1，成 超1，王 尉2，乐胜峰2，周晓晶2

(1.北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；

2.北京市理化分析测试中心，北京 100089)

摘 要：应用高效逆流色谱法分离纯化了化橘红中两种黄酮类化合物。以乙酸乙酯-正丁醇-水(1:4:5，V/V)为两相溶剂系统，从1g粗提物中可1次分离得到纯度大于98%的柚皮苷单体83.3mg。以二氯甲烷-甲醇-水(10:7:4，V/V)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1，V/V)为溶剂系统，可从1g粗提物的酸解物中经2次分离得到纯度大于98%的柚皮素单体27.5mg。两种物质的分离时间均在60min内，该法简便、快速、制备量大，可用于化橘红中黄酮类化合物的快速分离制备。

关键词：高效逆流色谱；化橘红；柚皮苷；柚皮素

Preparative Separation of Flavonoids from Exocarpium Citri grandis by High Performance Countercurrent Chromatography

YIN Lu 1，CAO Xue-li1,*，XU Jing1，CHENG Chao1，WANG Wei2，YUE Sheng-feng2，ZHOU Xiao-jing2

(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,

School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；

2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

Abstract：Two flavonoids were isolated and purified from the extract of Exocarpium Citri grandis by high performance countercurrent chromatography (HPCCC). A two-phase solvent systems composed of ethyl acetate-1-butanol-water (1:4:5, V/V) was used to separate naringin directly from the crude extract of Exocarpium Citri grandis. The method allowed the separation of 83.3 mg of individual naringin with purity of over 98% from 1 g of crude extract. A solvent system composed of dichloromethane, methanol and water (10:7:4, V/V), or hexane, ethyl acetate, methanol and water (1:1:1:1, V/V) was used in two steps to separate naringenin from the acid hydrolyzed product of crude extract. The method allowed the separation of 27.5 mg of individual naringenin with purity of over 98% from 1 g of acid hydrolyzed product. Separation of the two compounds was achieved within 60 min. The HPCCC method is a relatively simple and fast method with a high-loading capacity suitable for the isolation and purification of flavonoids from Exocarpium Citri grandis.

Key words：high-performance counter-current chromatography (HPCCC)；Exocarpium Citri grandis；naringin；naringenin

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0268-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320056

化橘红(Exocarpium Citri grandis，ECG)是芸香科植物化州柚(Citrus grandis ‘Tomentosa’)或柚(Citrus grandis (L.) Osbeck)的未成熟或近成熟的干燥外层果皮[1]，研究表明其具有抗炎、祛痰、抗氧化等作用[2-6]。黄酮类成分是化橘红的主要有效成分之一[7]，其中含有柚皮苷(naringin)及少量野漆树苷(rhoifolin)[8]、枳属苷(poncirin)及新橙皮苷(neohesperidin)，其中柚皮苷占化橘红中总黄酮含量的70%以上[9]。而柚皮苷经酸解处理后去除苷和糖，可得到其苷元柚皮素，柚皮素具有抗菌、抗氧化、抗炎等作用[10]，这两种黄酮类化合物的化学结构如图1所示。化橘红作为一种功能性原料可用于健胃消食，日常食用有防病保健、提高免疫力、抗氧化等作用。

目前对化橘红中黄酮类成分有一定程度的研究，也有对柚皮苷的提取分离研究的相关报道[11-14]，主要是溶剂提取结合常规柱层析，所得产品需反复重结晶，样品损失较大，得率低。应用逆流色谱技术分离纯化柚皮苷也有所报道。黄肇锋[15]对化橘红正丁醇粗提物采用逆流色谱分离，以正己烷-正丁醇-甲醇-0.5%乙酸为溶剂体系，在200min内得到纯度为97.1%的柚皮苷单体。而对化橘红中柚皮素的逆流色谱分离研究则尚未见报道。刘迪[10]应用逆流色谱技术对桃叶中的柚皮素进行分离纯化，选用氯仿-甲醇-水为溶剂体系，在150min内得到纯度在95%以上的柚皮素单体。

逆流色谱是一种连续高效的快速液-液分配色谱分离技术[16-18]，由于其无需任何固体分离介质，物质之间依据分配系数的不同而实现分离，因此它具有制备量大、分离效率高、回收率高等优势，广泛应用于天然产物中活性物质的分离制备。近年来出现的高效逆流色谱(high-performance counter-current chromatography，HPCCC)，由于其分离速度快、效率高备受人们的青睐。它可以实现在制备量成倍放大的过程中，在不延长分离时间的情况下，获得同样的放大分离效果，这正是高效逆流色谱的优势所在。本实验应用高效逆流色谱对化橘红中黄酮类物质的分离制备方法进行了研究。

图 1 柚皮苷(A)和柚皮素(B)的化学结构

Fig.1 Chemical structures of naringin (A) and naringenin (B)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中药化橘红购自北京白塔寺药店；柚皮苷和柚皮素对照品 南京泽朗植提技术有限公司。

乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、正己烷(分析纯) 北京化工厂；纯水由Millipore-Q纯水机自制；甲醇(色谱纯) 美国Fisher Scientific公司；冰乙酸(色谱纯) 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

DE Spectrum HPCCC高效逆流色谱仪(配有22.5mL分析柱和133.5mL半制备柱两种分离柱) 英国Dynamical Extraction公司；与色谱仪相配的Smartline低压梯度泵及UV2500可变波长检测器 德国Knauer公司；KQ-400DB型超声波清洗器(超声频率50kHz) 昆山市超声仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；ALPHA 2-4 LSC型冷冻干燥机 德国Christ公司；1100高效液相色谱仪(配有四元梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器等) 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 化橘红黄酮粗提物制备

化橘红样品经粉碎过40目筛，分别用70%、95%乙醇各提取1次，料液比为1:15(g/mL)，每次40min，合并滤液，减压浓缩至浸膏后真空干燥，得褐色化橘红黄酮粗提物粉末，放置于冰箱中备用。

1.3.2 化橘红黄酮酸解物制备

将化橘红黄酮粗提物按1:100(g/mL)的料液比加入2%硫酸，加热回流提取4h，冷却后加入40g/100mL氢氧化钠溶液调pH值至中性，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩后蒸干，即为化橘红黄酮酸解物，保存于冰箱中备用。

1.3.3 高效逆流色谱分离

采用高效逆流色谱分析柱，首先配制不同体积比的溶剂体系，将其充分混合后，静置分层，上相为固定相，下相为流动相，进行条件优化，选出最佳溶剂体系。分析型操作条件：转速1600r/min，检测波长280nm，流速1.0mL/min，进样量20mg，分离温度30℃。然后采用高效逆流色谱半制备柱，在优化条件下进行制备分离，流速6.0mL/min，进样量120mg，其他条件与分析型操作相同。

1.3.4 HPLC色谱柱分析条件

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃；流动相：甲醇-2%乙酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；检测波长：280nm。

2 结果与分析

2.1 化橘红黄酮粗提物和酸解物的HPLC分析

图 2 化橘红粗提物(A)和酸解物(B)的HPLC色谱图

Fig.2 HPLC chromatogram of crude extract (A) and acid hydrolyzed extract (B)

采用1.3.4节的HPLC条件对化橘红黄酮粗提物和酸解物进行分析。经与柚皮苷及柚皮素的对照品比对可知，在化橘红黄酮粗提物中，如图2A所示，柚皮苷含量较高，而柚皮素含量较低，几乎测不到。在经过酸解处理去除糖苷后的化橘红酸解物中，如图2B所示，柚皮素的含量有较明显的提高。

2.2 化橘红黄酮粗提物中柚皮苷的HPCCC分离

先用HPCCC分析柱，实验乙酸乙酯-正丁醇-水(1:4:5，V/V)溶剂体系的分离效果，结果如图3A所示，其中Ⅰ号峰为柚皮苷。然后采用该溶剂体系，根据半制备柱与分析柱之间的放大倍数(约6倍)，以进样量120mg，流速6.0mL/min，其他操作条件不变，对柚皮苷进行制备，结果见图3B。从1g化橘红黄酮粗提物中经8次制备可得到83.3mg柚皮苷单体。HPLC分析表明，其纯度可达99.7%，图4给出了分离所得柚皮苷的HPLC分析谱图及其紫外光谱图。

A.分析型

B.半制备型

I为柚皮苷，下同。

图 3 化橘红粗提物的HPCCC色谱分离图

Fig.3 HPCCC chromatogram of the crude extract from Exocarpium Citri grandis (A. analytical column; B. preparative column)

图 4 分离所得柚皮苷的HPLC色谱图(A)及紫外光谱图(B)

Fig.4 HPLC chromatogram (A) and UV spectra (B) of purified naringin

2.3 化橘红黄酮酸解物中柚皮素的分离

A.二氯甲烷-甲醇-水(10:7:4，V/V)溶剂体系；B.正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1，V/V)溶剂体系。Ⅱ为柚皮素。

图 5 化橘红酸解物的HPCCC色谱分离谱图

Fig.5 HPCCC chromatogram of acid hydrolyzed product of crude extract from Exocarpium Citri grandis

柚皮素是柚皮苷的苷元，因此对化橘红黄酮粗提物进行酸水解，可以破坏柚皮苷的糖苷键，酸解液经萃取后即可得到含有苷元柚皮素的粗提物，再利用逆流色谱分离，即可得到柚皮素单体。先用HPCCC分析柱，实验二氯甲烷-甲醇-水(10:7:4，V/V)溶剂体系的分离效果，结果如图5A1所示，其中Ⅱ号峰主要含有柚皮素。然后以此溶剂体系，根据半制备柱与分析柱之间的放大倍数(约6倍)，以进样量120mg，流速6.0mL/min，其他操作条件不变，对Ⅱ号峰进行制备。结果见图5A2，在不延长分离时间的情况下，制备量放大6倍，取得了同样的分离效果。经HPLC分析显示，柚皮素中还含有少量杂质，因此又对Ⅱ号峰进行二次纯化。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1，V/V)为溶剂体系对柚皮素进行纯化，结果见图5B，其中Ⅱ号峰为柚皮素。以此条件可从1g化橘红黄酮酸解物中经8次制备得到27.5mg柚皮素单体。HPLC分析表明，其纯度可达99.8%，图6给出了分离所得柚皮素的HPLC分析谱图及其紫外光谱图。

图 6 分离所得柚皮素的HPLC分析谱图(A)和紫外光谱图(B)

Fig.6 HPLC chromatogram (A) and UV spectra (B) of purified naringenin

2.4 化合物结构鉴定

组分Ⅰ：ESI-MS(m/z)：581.2[M+Na]+；1H-NMR(600MHz，DMSO)：δ：12.05(1H, s, 5-OH)，9.64(1H, 4’-OH)，7.32(2H, d, J=8.4Hz, H-2’, 6’)，6.79(2H, d, J=8.4Hz, H-3’, 5’)，6.11(1H, d, J=2.1Hz, H-6)，6.08(1H, d, J=2.1Hz, H-8)，5.52(1H, dd, J=2.9Hz, J=12.5Hz, H-2)，5.31(1H, d, J=5.1Hz, H-1”)，5.13(1H, d, J=5.7Hz, H-1)，3.19(1H, dd, J=2.9Hz, J=17.4Hz, H-3)，2.74(1H, dd, J=2.9Hz, J=17.4Hz, H-3)，1.13(3H, d, J=6.2Hz, rhamnosyl-CH)；13C-NMR(150Hz，DMSO)：δ：Naringenin：42.4(C-3)，79.6(C-2)，97.7(C-8)，97.8(C-6)，103.7(C-10)，115.6(C-3’, 5’)，128.9(C-2’, 6’)，129.0(C-1’)，158.3(C-4’)，163.3(C-9)，165.2(C-5)，165.3(C-7)，197.7(C-4)；Glucose：60.8(C-6”)，72.2(C-4’)，77.3(C-5”)，77.5(C-3'')，79.2(C-2”)，100.8(C-1”)；Rhamnose：18.4(C-6’’’)，70.0(C-5’’’)，70.8(C-3’’’)，70.9(C-2’’’)，72.2(C-4’’’)，101.7(C-1’’’)。其1H-NMR数据和13C-NMR数据与文献[19]一致，确定组分Ⅰ为柚皮苷(naringin)。

组分Ⅱ：ESI-MS(m/z)：273.1[M+Na]+；1H-NMR(600MHz，DMSO)：δ：7.32(2H, d, J=8Hz, H-2’, 6’)，6.79(2H, d, J=8Hz, H-3’, 5’)，5.89(2H, s, H-6, H-8)，5.44(1H, dd, J=2.6Hz, J=12.9Hz, H-2)，3.34(1H, dd, J=12.4Hz, J=16.7Hz, H-3 trans)，2.69(1H, dd, J=3.0Hz, J=17.2Hz, H-3cis)；13C-NMR(150Hz，DMSO)：δ：196.8(C=O, C-4)，167.1(C-7)，163.9(C-5)，163.3(C-9)，158.1(C-4’)，129.3(C-1’)，128.7(C-2’, 6’)，115.6(C-3’, 5’)，102.2(C-10)，96.2(C-6)，95.4(C-8)，78.8(C-2)，42.4(C-3)。其1H-NMR数据和13C-NMR数据与文献[20]一致，确定组分Ⅱ为柚皮素(naringenin)。

3 讨论与结论

本研究应用高效逆流色谱法从化橘红提取物中分离制备了两种黄酮类成分，分别为柚皮苷及其苷元柚皮素。对1g化橘红黄酮提取物进行了分离，在60min内可得到纯度在99%以上的柚皮苷83.3mg；对1g黄酮粗提物的酸解物进行分离，在40min内得到了纯度在99%以上的柚皮素单体27.5mg。本实验研究表明，高效逆流色谱法可通过分析柱快速筛选溶剂体系，并根据柱体积的相差倍数，在半制备柱与分析柱之间进行线性放大。Qiao Qingliang等[20]同样利用高速逆流色谱的分析柱筛选溶剂体系，并在制备柱中线性放大，从生姜中制备得到姜酚和6-姜烯酚单体。由此可见，在上样量和流速与柱体积等倍数放大时，可在不延长分离时间的情况下，制备量成倍放大，分离效果相同，这正是高效逆流色谱的优势所在。

本实验所建立的高效逆流色谱法分离化橘红中的柚皮苷及柚皮素，可用于化橘红相关产品质量控制用标准品的制备，也可用于化橘红的深层次研究开发。化橘红作为一种来源广泛、易于获取的天然产物，在食品领域中将会有更大的应用前景。

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