四川泡菜中中度嗜盐菌的分离与鉴定

张 琦1,2,田 伟1,2,李 芳2,刘 森1,2,贾 春1,林洪斌1,向文良1,2,车振明1,*

(1.西华大学生物工程学院 四川省食品生物技术重点实验室,四川 成都 610039;

2.西华大学古法发酵(酿造)生物技术研究所,四川 成都 610039)

 

要:从四川泡菜盐卤中分离获得54株中度嗜盐菌,所有分离菌株皆为革兰氏阳性菌,其中ZQ1和ZQ4最适NaCl生长质量浓度为7g/100mL,ZQ26最适NaCl生长质量浓度为12g/100mL。其余51株菌的NaCl生长质量浓度范围为0~20g/100mL,最适生长质量浓度6g/100mL,不产生吲哚,酪素水解、明胶液化、淀粉水解和马尿酸水解为阴性,过氧化氢酶和脂酶为阴性。16S rRNA序列分析表明:54株菌分别属于细菌域的VirgibacillusStaphylococcus
Oceanobacillus属。菌株ZQ1、ZQ4与Virgibacillus halodenitrificans的16S rRNA基因序列相似性为99%;菌株ZQ26与Staphylococcus cohnii的相似性为99%,其余菌株与Oceanobacillus oncorhynchi在16S rRNA水平上相似性为98%~99%。作为优势菌的O. oncorhynchi在16S~23S rRNA ISR水平的分析进一步表明:51株O. oncorhynchi被分成5个亚类,这5个亚类的代表菌株ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52的全细胞脂肪酸的种类和含量皆存在差异。这一结果暗示盐卤中的O. oncorhynchi菌在种内水平上已经发生了分化。

关键词:四川泡菜;中度嗜盐菌;16S rRNA;16S~23S rRNA ISR;全细胞脂肪酸

 

Isolation and Identification of Moderately Halophilic Bacteria from Sichuan Pickle Brine

 

ZHANG Qi1,2,TIAN Wei1,2,LI Fang2,LIU Sen1,2,JIA Chun1,LIN Hong-bin1,XIANG Wen-liang1,2,CHE Zhen-ming1,*

(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China;2. Institute of Ancient Brewing Technology, Xihua University, Chengdu 610039, China)

 

Abstract:A total of 54 moderately halophilic bacteria were isolated from the Sichuan pickle brine and were analyzed for phenotype, physiology, 16S rRNA sequence and 16S—23S ribosomal RNA intergenic spacer regions (ISR). The results showed that all the isolates were gram positive strains. The optimum concentration of NaCl for ZQ1 and ZQ4 of which
16S rRNA sequence shared 99% similarity to Virgibacillus halodenitrificans, was 7 g/100 mL while the concentration for ZQ26, sharing 99% similarity of 16S rRNA with Staphylococcus cohnii was 12 g/100 mL. The other strains grew well within an NaCl concentration range of 0 to 20 g/100 mL and the optimum growth was observed at 6 g/100 mL. These strains were capable of hydrolyzing gelatin, casein and starch with the exception of benzoyl glycocoll. The 16S rRNA sequence analysis showed that the other 51 strains had 98% to 99% similarity with Oceanobacillus oncorhynchi. The 51 dominant strains of
O. oncorhynch were further divided into 5 subclass ZQ30, ZQ35, ZQ36, ZQ42 and ZQ52 based on their 16S—23S rRNA ISR and cellular fatty acid composition. This study will provide a scientific basis for investigating the biological process of fermentation and the formation of unique flavor in Sichuan pickles.

Key words:Sichuan pickles;moderately halophilic bacteria;16S rRNA;16S—23S rRNA ISR;cellular fatty acid

中图分类号:TS261.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0264-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321053

中度嗜盐菌是一类最适生长盐质量浓度在5~20g/100mL的极端微生物,广泛存在于各种高盐环境中。随着各种盐生环境的深入研究,包括盐湖、海洋、盐土等自然环境,盐场、盐池等人工环境,还有盐腌制食品等,大量中度嗜盐菌越来越受重视,与其相关的研究也日益广泛[1]。特别是在长期盐胁迫下,中度嗜盐菌进化所形成的独特的生理功能、遗传特性以及在生物、医药和工业生产中潜在的用途等都引起了人们极大的关注[2]。

四川泡菜历史悠久,以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性,深受消费者喜爱[3]。近年来,四川泡菜产业发展迅速,产品远销国外。随着生物技术在食品工业的应用,传统生产工艺逐渐向现代化生产发展[4]。在工业生产中,泡菜发酵主要是利用高盐质量浓度的渗透作用及乳酸菌的生长代谢,盐质量浓度可达13g/100mL。泡菜盐卤作为一种特殊的盐生环境,分布了多种嗜盐微生物,这些嗜盐微生物以多种分子机制适应其所处环境,并发挥着重要的作用。分离与鉴定这些嗜盐微生物为四川泡菜中微生物类群分析提供数据,为泡菜行业发展提供理论基础。

因此,本研究以四川新繁地区家庭泡菜老坛卤为研究对象分离嗜盐细菌,通过菌落形态特征、16S rRNA系统发育、16S~23S rRNA ISR区间分析以及全细胞脂肪酸分析对所分离的菌株进行分类学研究。

1 材料与方法

1.1 样品采集

无菌操作条件下,取四川新繁地区某家庭泡菜老坛卤装袋,密封,于4℃保存。

1.2 菌株的分离与生化鉴定

菌种分离和富集培养参见Romano[5]及钱存柔[6]等关于嗜盐菌及细菌的分离、培养方法。无菌操作条件下,将泡菜盐卤活化后采用梯度稀释法稀释成10-1、10-2、10-3,取泡菜盐卤原液和不同稀释度的稀释液各100μL分别均匀涂布于含10g/100mL NaCl的LB固体培养基上,37℃培养48h后LB平板分离、纯化后于4℃保存。将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中进行富集培养,37℃、180r/min摇床培养16h,采用甘油冷冻保藏法(25%甘油)于-20℃保藏。分离菌株的生化鉴定参见Tomlinson[7]和Juez[8]等的鉴定方法。

1.3 16S rRNA序列及系统发育分析

菌株DNA的提取、16S rRNA PCR扩增及序列分析参见Shigematsu等[9]的方法。以细菌16S rRNA PCR扩增通用引物Eu27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和原核微生物特异性引物1490R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物进行16S rRNA PCR扩增。PCR扩增条件:首先,95℃预热5min;然后95℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;最后,72℃延伸10min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测后,采用pGEM-T Ligation Kit试剂盒(TIANGEN VT202-1),
经pGEM-T载体克隆入E.coli DH5α,挑选阳性克隆子,提取重组质粒,送成都博瑞克生物技术有限公司测序。16S rRNA序列结果经校对后与GenBank中数据做相似性分析,并采用Clustal X多重比对,然后用Mega 4.0软件Neighbor-Joining法进行1000次步长计算,构建系统发育树。

1.4 16S~23S rRNA ISR区间PCR片段特性分析

16S~23S rRNA ISR区间特性分析参见向文良等[10]方法,引物分别采用 G1(5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’)和L1(5’-CAAGGCATCCACCGT-3’)。其中,G1高度保守,紧邻16S~23S rRNA ISR的上游30~40bp区域;L1为23S rRNA的一个保守区域,位于16S~23S rRNA ISR下游20bp区域。PCR扩增条件:首先,94℃预热5min;然后,94℃变性1min,55℃退火2min,72℃延伸3min,35个循环;最后,72℃延伸10min。ISR-PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析其特性。

1.5 全细胞脂肪酸分析

全细胞脂肪酸分析参考Xiang Wenliang等[11]方法,将新培养的菌体经冷冻干燥后,研成粉末。取100mg菌粉置于25mL磨口玻璃试管中,并加入5mL 1.0mol/L NaOH甲醇溶液,加塞旋紧,于85℃保温30min。取出冷却至室温,加入6mol/L HCl调节pH值至1,再加入5mL 12% BF3甲醇-乙醚(3:1,V/V)溶液,于80℃水浴20min。取出冷却至室温,加入10mL饱和NaCl,用5mL氯仿-正己烷(1:4,V/V)混合试剂提取2次,提取液合并,加无水1g Na2SO4脱水。真空干燥,己烷定容至0.2mL,10000r/min离心10min。

GC-MS条件:HP-5MS毛细管柱;温度程序:柱温50℃保持1min,然后以2℃/min速率升至230℃,保持22min;载气He流速1.2mL/min,检测器250℃,分流比20:1,进样1µL。

MS条件:电子轰击电离70eV,离子源230℃,接口温度280℃,选取全程扫描,质量扫描范围40~600,溶剂延迟2.0min。

2 结果与分析

2.1 菌落形态与生化特征

将采集的泡菜盐卤经梯度稀释后涂布于10g/100mL NaCl LB平板培养基上培养发现:30h后菌落开始出现,48h后几乎不再有新的菌落出现,其中90%的菌落为乳白色或白色,少数菌落为浅黄色。经分离纯化后得54株菌,菌落扁平,圆形,表面光滑,湿润,呈半固体膏状,边缘整齐,直径在1~4mm左右,如图1所示,对分离菌株进一步生化鉴定表明:所有菌株皆为革兰氏阳性菌,其中ZQ1和ZQ4最适NaCl生长质量浓度为7g/100mL,ZQ26最适NaCl生长质量浓度为12g/100mL。其余51株菌的NaCl生长质量浓度均为0~20g/100mL,最适生长质量浓度6g/100mL,不产生吲哚,酪素水解、明胶液化、淀粉水解和马尿酸水解为阴性,过氧化氢酶和酯酶为阴性。

zq-t1.tif 

图 1 泡菜盐卤中分离纯化后的嗜盐菌菌落形态

Fig.1 Colony morphology of the bacterial isolates from Sichuan pickle brine

2.2 基于16S rRNA基因的系统发育分析

所有分离菌株的完整16S rRNA基因经BLAST分析及多重比对后,选取代表菌株ZQ1、ZQ4、ZQ26、ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52构建系统发育树,见图2。Stackebrandt等[12]认为当16S rRNA的序列同源性≥97%时可以认为是一个属,序列同源性≥98%时则可以认为是一个种。从泡菜盐卤中共分离得到54株菌,分别属于VirgibacillusStaphylococcusOceanobacillus属。菌株ZQ1、ZQ4与V. halodenitrificans
的16S rRNA基因序列相似性为99%,因此ZQ1、ZQ4与V. halodenitrificans应属同种;菌株ZQ26与S. cohnii在16S rRNA基因水平上有99%的相似性,因此在分类水平上ZQ26与S. cohnii应属同种;其余菌株与O. oncorhynchi聚集成簇,在16S rRNA水平上相似性为98%~99%,初步鉴定为O. oncorhynchi。结果表明,从四川泡菜盐卤中分离所得54株中度嗜盐菌中,51株初步鉴定为O. oncorhynchi,因此,
O. oncorhynchi是其中的优势嗜盐菌,将做进一步研究。

458662.jpg 

图 2 基于16S rRNA基因序列构建的代表菌株的系统发育进化树

Fig.2 Phylogenetic tree based on the complete 16S rRNA gene sequences of the representative isolates by the neighbor-joining method

2.3 16S~23S rRNA区间PCR片段分析

为了解盐卤中O. oncorhynchi的进一步的分类地位,选取16S~23S rRNA ISR区间作为分类指针,对ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52代表菌株的16S~23S rRNA ISR基因做PCR扩增,其PCR片断的PAGE电泳图及聚类分析见图3。由图3A可知,所有菌株的ISR-PCR片断的长度主要分布在300~2000bp之间,并且5株代表菌株的ISR-PCR片断指纹图谱都各不同,表明它们分属于不同的亚种。这些结果进一步从分子水平上证实了ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42、ZQ52在16S~23S rRNA ISR水平上发生了进化上的差异,在UPGMA聚类图(图3B)也清楚表明了这一点。

458679.jpg 

458694.jpg 

M. MarkerⅠ和MarkerⅦ的等体积混合液。

图 3 盐卤中O. oncorhynchi代表菌株的16S~23S rRNA ISR-PCR片段的聚丙烯酰胺电泳图(A)及ISR-PCR指纹图谱的NTSYS聚类分析(B)

Fig.3 PAGE of 16S—23S rRNA ISR-PCR amplified DNA fragments from the representative isolates from the brine (A) and their dendrogram (B)

2.4 全细胞脂肪酸分析

为了进一步得到分离菌株的分类信息,提取
O. oncorhynchi代表菌株的脂肪酸甲酯化后GC-MS分析,结果见表1。表中代表菌株在脂肪酸种类和含量上均有差异:菌株ZQ30的硬脂酸(39.24%)、14-甲基十六烷酸(17.83%)含量相对较高;菌株ZQ35含19.05%的12-甲基十三烷酸、16.74%的棕榈酸、11.81%的14-甲基十六烷酸、11.57%的十五碳酸;菌株ZQ36的2-己基环丙烷辛酸(27.24%)含量最高;菌株ZQ42的12-甲基十三烷酸(19.50%)、棕榈酸(17.76%)、14-甲基十六烷酸(12.90%)、十五碳酸(5.97%)含量相对较高;菌株ZQ52的主要脂肪酸是10-甲基十二烷酸(19.98%)、14-甲基十六烷酸(13.78%)、棕榈酸(13.66%)、十五碳酸(11.86%)。可以看出,5株代表菌在脂肪酸种类和含量上都有差异,这与5株代表菌的16S~23S rRNA ISR分析结果一致。

表 1 分离菌株代表菌株的全细胞脂肪酸组成分析

Table 1 Cellular fatty acid composition of the representative isolates

%

脂肪酸

ZQ30

ZQ35

ZQ36

ZQ42

ZQ52

14-甲基十六烷酸

17.83

11.81

0.66

12.90

13.78

硬脂酸

39.24

3.62

1.74

3.78

9.72

棕榈酸

3.50

16.74

10.93

17.76

13.66

十四酸

0.46

5.19

11.16

3.35

3.77

十五碳酸

7.97

11.57

5.40

5.97

11.86

12-甲基十三烷酸

19.05

19.50

15-甲基十六烷酸

8.64

十九酸

4.94

1.63

3.18

二十酸

8.64

2.15

油酸

0.78

8.63

5.40

4.57

5.16

15-甲基十七烷酸

7.46

十三酸

0.56

0.68

十二酸

0.87

5.83

2.62

(Z)-十六烯酸

7.17

5.96

8.17

3.21

十七酸

7.39

2.98

7.68

10.74

2-己基-环丙烷辛酸

5.93

27.24

7.55

1.60

3-羟基十六烷酸

2.03

7.13

2-十六烯酸

1.32

10-十九烯酸

10.94

17-甲基硬脂酸

4.14

16-甲基十七酸

1.10

10-甲基十一烷酸

1.24

10-甲基十二烷酸

19.98

顺-7-十六烯酸

0.47

0.40

反-9-十八烯酸

0.98

总饱和脂肪酸含量

99.24

78.27

48.66

79.33

89.03

总不饱和脂肪酸含量

0.78

21.73

51.33

20.69

10.95

总脂肪酸含量

100

100

100

100

100

 

注:-. 未检出。

 

3 讨 论

嗜盐菌是盐生生态系统重要的组成之一,在盐生环境中扮演着关键的作用。泡菜盐卤作为一种特殊的盐生环境,分布多种嗜盐菌,这些嗜盐菌发挥着至关重要的作用。随着现代科学技术的发展,对微生物菌种鉴定已经提升到了一个新的高度,特别是由于分子生物学在该分支学科中的应用,使得在微生物菌群多样性的研究中克服了传统培养的缺点,使分析方法取得很大进步,将二者结合起来用分子技术指导分离培养是研究微生物生态的最佳方法[13]。采用梯度稀释法在LB培养基上从四川泡菜盐卤中分离得到54株嗜盐菌,经初步分类属于VirgibacillusStaphylococcusOceanobacillus属不同的类群,其结果初步揭示了泡菜盐卤中可培养的嗜盐菌类别。16S rRNA序列分析是对生物的16S rRNA进行特异扩增后,对其核苷酸序列进行测定,然后利用数据库进行序列比较,进行分子鉴定和系统学研究,是研究环境微生物菌群变化比较有效的方法之一[14]。本研究所得54株中度嗜盐菌中经16S rRNA序列分析后表明,有51株菌的16S rRNA序列与O. oncorhynchi的16S rRNA序列相似性达到98%~99%,初步认为O. oncorhynchi是四川泡菜盐卤中的优势中度嗜盐菌。

16S~23S rRNA间区近年来在细菌系统发育学, 特别是相近种和菌株的区分和鉴定方面倍受关注。16S~23S rRNA基因的16S rRNA端和23S rRNA端高度保守,而16S~23S rRNA基因间隔区(ISR)序列的进化速度是16S rRNA基因的10倍,在不同细菌中拷贝数、碱基排列、序列长度及所含tRNA基因种类和数目有所差异。当分离株的16S rRNA序列高度相似性时,16S~23S rRNA区间序列多态性分析可以为这些菌株的进一步分类提供分子证据[15]。因此,Song Yuli等[16]认为起源相近的菌株,在进化过程中ISR发生的突变在一定程度上响应了环境的独特性,可以作为菌株的分类信息。利用16S~23S rRNA ISR区分和鉴定亲缘关系相近的种和菌株的研究越来越多。Jensen等[17]建立了一套用来扩增原核生物16S~23S rRNA基因间区的PCR扩增体系。因此,本研究应用16S~23S rRNA ISR对四川泡菜盐卤中分离的中度嗜盐菌的优势菌O. oncorhynchi做了进一步分析,其结果表明:在进化过程中,O. oncorhynchi种内的菌株ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52在泡菜盐卤独特环境因子长期的压力下已经在分子水平上出现了分化。

利用GC-MS分析微生物细胞的脂肪酸分布,是从细胞组分水平上鉴定微生物的重要内容,开辟了一个微生物分类和鉴定的新途径。不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异,它和微生物的遗传变异、生理生化特性等有极为密切的关系[18]。脂肪酸成分不受质粒损失或增加的影响,结果更为客观、可靠,与分子生物学等研究方法有机结合,提供更加全面、准确的微生物多样性变化信息[19]。在本研究中,O. oncorhynchi种内的菌株ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52菌株在脂肪酸种类和含量上均有差异,这进一步证实了泡菜盐卤中的
O. oncorhynchi在种内已经在分子水平发生了分化这一事实。

四川泡菜历史悠久,近年来发展迅速。泡菜盐卤作为一种特殊的盐生环境,其间分布的嗜盐微生物为四川泡菜的特色风味贡献如何还不是很清楚。本研究利用表型分析、全细胞脂肪酸分析、16S rRNA系统发育和16S~23S rRNA ISR区间分析等微生物多项分类技术对四川泡菜盐卤中的中度嗜盐菌进行了全面解析,其结果为进一步解析这些菌株在四川泡菜发酵过程中的生物学过程和四川泡菜风味的形成机理提供基础。

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收稿日期:2012-10-13

基金项目:成都市普通科技创新项目(11GGYB443NC-289);成都市重点科技成果转化项目(11ZHZD037JH-253)

作者简介:张琦(1988—),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物。E-mail:zhangqi0707@hotmail.com

*通信作者:车振明(1960—),男,教授,学士,研究方向为食品微生物。E-mail:chezhenming@163.com