不同巴氏杀菌条件对三华李果汁主要抗氧化成分的影响

段翰英，王 超*，戴雄杰，许浩腾，虞 兵

(暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632)

摘 要：在不同巴氏杀菌温度、时间处理三华李果汁，以总多酚、花青素、VC含量及抗氧化能力(DPPH自由基清除能力)为指标，研究巴氏杀菌条件对三华李果汁主要抗氧化成分的影响。研究设计12组巴氏杀菌处理条件(82℃、5s，82℃、15s，82℃、30s，82℃、60s，88℃、5s，88℃、15s，88℃、30s，88℃、60s，93℃、5s，93℃、15s，93℃、30s，93℃、60s)。结果表明：不同温度和杀菌时间只对VC含量和DPPH自由基清除能力有显著影响，而对总多酚和花青素的含量无显著性影响。88℃、15s可最大程度地保留VC含量(4.24mg/L)，而在93℃、60s时DPPH自由基清除率达到最高(94.6%)。

关键词：三华李果汁；巴氏杀菌；总多酚；花青素；VC；抗氧化能力

Effect of Pasteurization on Major Antioxidant Compounds of Sanhua Plum Juice

DUAN Han-ying，WANG Chao*，DAI Xiong-jie，XU Hao-teng，YU Bing

(Department of Food Science and Technology, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Abstract：Sanhua plum juice was treated under different pasteurization time/temperature conditions (82 ℃ for 5 s, 82 ℃ for 15 s,
82 ℃ for 30 s, 82 ℃ for 60 s, 88 ℃ for 5 s, 88 ℃ for 15 s, 88 ℃ for 30 s, 88 ℃ for 60 s, 93 ℃ for 5 s, 93 ℃ for 15 s, 93 ℃ for 30 s, and 93 ℃ for 60 s). The contents of antioxidant compounds including total phenolic compounds, anthocyanin, vitamin C and antioxidant capacity (DPPH radical scavenging capacity) were investigated under different pasteurization conditions. Results indicated that different temperatures and treatment times could affect vitamin C content and DPPH radical scavenging capacity significantly, while having no effect on total phenolic compounds or anthocyanin. The treatments at 88 ℃ for 15 s and 93 ℃ for 60 s were the optimal conditions for preserving total vitamin C content (4.24 mg/L) and DPPH radical scavenging capacity (94.6%), respectively.

Key words：Sanhua plum juice；pasteurization；total phenolic compounds；anthocyanin；total vitamin C；total antioxidant capacity

中图分类号：TS255.44 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0069-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321015

三华李(Prunus salicina Lindl. cv. “sanhua”)为蔷薇科李属植物，因最早栽种于广东韶关翁源县三华乡而得名，是广东十大优稀水果之一[1]。现代研究表明三华李具有较高的营养价值[2]和较强的抗氧化能力[3-4]。果蔬中所含的多酚类、生物类黄酮等抗氧化物质可以通过阻断自由基侵袭或激活体内抗氧化酶，从而有效减少与衰老相关的疾病包括癌症、冠心病及其他老年疾病，并延缓皮肤的氧化损伤[5-7]。

广东省是中国最大的三华李生产地。近年来栽培面积和产量呈逐年上升的趋势，随着种植面积和产量的增加，供大于求的现状越来越严重。三华李的季节性很强，旺季收获后不及时加工处理很容易腐败变质。目前三华李的加工产品比较单一，主要是果脯蜜饯和果酒类[8-9]。如何通过深加工延长果品产业链、提高其附加值，是三华李产业急需解决的问题。

三华李味甜多汁，肉厚核小，是优良的制汁原料。但目前对三华李果汁的研究很少，而且主要集中在加工工艺方面[2,8]，对果汁在加工过程中品质及抗氧化成分的变化未见报道，这影响了三华李产业的进一步发展。本研究对三华李果汁经不同巴氏杀菌后总多酚、花青素、VC等抗氧化成分的变化以及DPPH自由基清除能力进行研究，旨在为开发富含抗氧化物质的三华李果汁制品提供基本工艺参数及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟的三华李(品种：鸡麻李)采摘于广东省翁源县三华镇。

果胶酶(酶活力500U/mg) 广州市齐云生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Folin-Ciocalteu试剂 美国Sigma公司；VC标准品(纯度≥98%) 北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准品(纯度≥98%) 上海同田生物科技有限公司；二硫苏糖醇(DL-DTT)(分析纯) 广州捷倍斯生物有限公司；甲酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钾、醋酸钠等试剂均为分析纯；乙腈为色谱纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪(配有SIL-20A自动进样器、光电二极管阵列(PDA)检测器、LC-20AT输液泵、CTO-10AS VP柱温箱、CLASS-VP工作站) 日本岛津公司；Symmetry C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm) 美国Waters公司；PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司；RE-52AAA旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；722s可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-9600紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器公司；WF-A4000榨汁机 广州旭众食品机械有限公司；Master-M手持式糖度计 日本Atago公司；C21-SK2108电磁炉 广东美的生活电器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 三华李果汁加工工艺流程

三华李→筛选→清洗→切半、去核→热烫→冷却→榨汁→酶解→灭酶→纱布粗滤→离心→巴氏杀菌→灌装→冷却→冷冻

热烫条件：李子、水质量比1:2，100℃热汤2min；酶解条件：加酶量 1.5×106U/kg，50℃反应3.25h；灭酶条件：100℃灭酶1min；离心条件：4000r/min离心5min；冷却条件：冰水混合物冷却15min；冷冻：－4℃。

1.3.2 巴氏杀菌条件

巴氏杀菌条件参考Nehmatallah等[10]的研究报道。新鲜三华李果汁平均分成24份，每份100mL，分别装入表面积为300cm2的不锈钢容器中。每2个样品进行同样的杀菌处理。巴氏杀菌时间、温度分别为：82℃、5s，82℃、15s，82℃、30s，82℃、60s，88℃、5s，88℃、15s，88℃、30s，88℃、60s，93℃、5s，93℃、15s，93℃、30s，93℃、60s。果汁样品采用电磁炉(设置功率为：2100W)在60～90s内加热到杀菌温度±1℃后，停止加热。在加热过程中，对果汁不停搅拌，使之受热均匀。果汁保持杀菌温度±1℃一定时间后，再迅速热灌装到已杀菌的玻璃瓶中，趁热密封，用冰水浴快速降温至常温，并保存于－4℃的冰箱中冷冻保藏。

1.3.3 VC含量的测定

参照文献[11]，采用HPLC结合PDA方法测定VC含量。

1.3.3.1 溶液配制

标准储备液：准确称取10mg VC的标准品，置于10mL容量瓶中，用0.1% DL-DTT的水溶液溶解并定容，配成1g/L的标准储备液。

标准工作液：利用移液枪准确量取50、100、200、400、800、1600μL的标准储备液于10mL的容量瓶中，用0.1% DL-DTT的水溶液定容，分别配成5、10、20、40、80、160mg/L的6个标准工作液。样品过0.45μm滤膜过滤，待进样测定。

1.3.3.2 VC的提取

果汁常温解冻后加入0.1% DL-DTT，6000r/min离心10min，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节果汁pH值为5.0～5.2后静置，使样品溶液反应2h。反应后，样品过0.45μm滤膜过滤，待进样测定。果汁中VC含量用mg/L表示。每个样品做两个重复。

1.3.3.3 VC的分析条件

色谱条件：色谱柱为Waters Symmetry C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：pH 2.5的2g/100mL磷酸二氢钾缓冲液(含0.1% DL-DTT)；流速：0.5mL/min；进样量：20μL；自动进样器温度：4℃；柱温：40℃；扫描波长范围：200～700nm；检测波长：243nm。

1.3.4 总多酚含量的测定

三华李果汁总多酚含量的测定采用福林酚法[12]，并以没食子酸为标准品。

1.3.4.1 溶液配制

标准储备液：准确称取25mg没食子酸的标准品，置于10mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配成2.5g/L的标准储备液。

标准工作液：利用移液枪准确量取50、100、200、400、800、1600μL的标准储备液于10mL的容量瓶中，用超纯水定容，分别配成12.5、25、50、100、200、400mg/L的6个标准工作液。分别取60μL标准溶液与4.74mL水混合，再加入300μL Folin-Ciocalteu试剂，混合后室温恒温静置8min，然后加入900μL 20g/100mL的碳酸钠溶液，混合并室温下放置2h，在765nm波长处用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3.4.2 总多酚测定

取100μL常温解冻后的三华李果汁在6000r/min离心10min后，取50μL上清液稀释11倍。准确量取60μL稀释液与4.74mL水混合，再加入300μL Folin-Ciocalteu试剂，混合后室温恒温静置8min，然后加入900μL的20g/100mL的碳酸钠溶液，混合并室温下放置2h，在765nm波长处用紫外-可见分光光度计测定吸光度。总多酚含量以没食子酸当量表示(mg GAE/L)。

1.3.5 总花青素的测定

采用pH值-示差分光光度法[13-14]。

具体操作如下：取适量离心后的样品上清液，用pH 1.0、0.025mol/L氯化钾缓冲液适度稀释，直至其吸光度在最大吸收波长处(510nm)达到紫外-可见分光光度计的线性范围内(低于1.0)。用最终体积除以初始体积得到稀释因子(DF)。用氯化钾缓冲液(0.025mol/L，pH1.0)和醋酸钠缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)按DF分别稀释样品，室温下平衡15min后，在510nm和700nm波长处分别测量稀释样品的吸光度。用蒸馏水为空白。按式(1)计算样品中的花青素含量。以矢车菊-3-葡萄糖苷为标准参照。

(1)

式中：ρ为果汁中花青素的质量浓度/(mg/L)；A为稀释液的吸光度，A=(A510nm－A700nm)pH1.0－(A510nm－A700nm)pH4.5；ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔分子吸光系数(26900L/mol)；MW为矢车菊-3-葡萄糖苷的分子质量(449.2g/mol)；DF为稀释因子。

1.3.6 花青素单体的测定

利用HPLC结合PDA方法测定花青素单体。

1.3.6.1 花青素的提取

取1mL常温解冻后的三华李果汁在6000r/min的条件下离心10min，离心后保存上清液，再加入100μL甲酸，充分混匀后，过0.45μm滤膜过滤，待进样测定。

1.3.6.2 花青素的分析条件

色谱条件：色谱柱为Waters Symmetry C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：A：5%甲酸-水溶液(V/V)，B：5%甲酸-乙腈溶液(V/V)；梯度洗脱条件：0min(0% B)→30min(40% B)→32min(100% B)→38min(0% B)；流速：1mL/min；进样量：25μL；自动进样器温度：4℃；柱温：40℃；扫描波长范围：200～700nm；检测波长：520nm。

1.3.7 DPPH自由基清除率测定

参考文献[15-16]方法测定巴氏杀菌后三华李果汁的抗氧化活性。具体操作如下：取离心后的样品上清液200μL，加入3.9mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，充分混匀后，室温下避光反应30min，以乙醇为空白，于517nm波长处测定其吸光度A样品。以超纯水代替样品重复上述步骤得到A对照，按式(2)计算清除率[17-18]。

(2)

1.3.8 果汁pH值测定

采用pH计测定果汁pH值。

1.3.9 果汁糖度测定

采用手持式糖度计测定果汁糖度。

1.4 统计分析

数据采用Minitab 15.0统计软件进行方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 三华李原汁特性分析

经测定，三华李原汁糖度为10.4°Brix，pH值为3.1。

2.2 不同巴氏杀菌条件对果汁VC含量的影响

经PDA全波长扫描发现VC在pH2.5的2g/100mL磷酸二氢钾缓冲液中的最大吸收波长为254nm。在1.3.3.3节所述色谱分析条件下，得到VC标液质量浓度(x)与峰面积(y)的良好回归曲线y=10219x＋10470(R2=0.9998)。

图 1 VC标液(A)与三华李果汁(B)的HPLC-PDA色谱图

Fig.1 HPLC-PDA chromatograms of vitamin C (A) in standard solution and Sanhua plum juice (B)

图1A中VC标准品色谱图中的保留时间为5.781min。图1B中三华李果汁色谱图中的峰X保留时间为5.730min，并且峰X具有与标准品相同的UV-VIS特征性光谱图。综合分析可推断峰X为VC。根据测定结果三华李果汁中VC含量如表1所示。经无重复双因素方差分析(表2)，显示不同加热温度和加热时间对VC含量都有显著性差异，P值分别为0.001和0.046。加热温度对其影响显著于加热时间。在5、15、30、60s处理中，88℃均是最佳处理温度，其中15s处理后果汁中VC含量最大(4.24mg/L)，93℃则对VC破坏最大。

表 1 不同巴氏杀菌条件处理后三华李果汁中VC含量

Table 1 Vitamin C contents of Sanhua plum juice after different pasteurization treatments

mg/L

表 2 不同巴氏杀菌处理后VC含量的方差分析

Table 2 Analysis of variance for vitamin C content after pasteurization treatment

2.3 不同巴氏杀菌条件对三华李果汁总多酚含量的影响

在765nm波长处，没食子酸的质量浓度(x)与吸光度(y)具有良好的线性关系，回归曲线方程为y=0.0010x＋0.0170(R2=0.9996)。不同巴氏杀菌处理后三华李果汁中总多酚含量如表3所示。经无重复双因素方差分析，结果见表4，可见不同巴氏杀菌处理对总多酚没有显著性影响(P＞0.05)。Dewanto[19]、Gahler[20]等报道热处理对总多酚的含量没有显著影响，这与研究结果吻合。

表 3 不同巴氏杀菌处理对三华李果汁总多酚含量的影响

Table 3 Total phenolic contents of Sanhua plum juice after different pasteurization treatments

mg GAE/L

表 4 不同巴氏杀菌处理后总多酚含量的方差分析

Table 4 Analysis of variance for total phenolic content after pasteurization treatment

2.4 不同巴氏杀菌条件对果汁总花青素含量的影响

不同巴氏杀菌处理后三华李果汁中总花青素的含量如表5所示。经无重复双因素方差分析(表6)，不同的巴氏杀菌处理对总花青素含量都没有显著性差异(P＞0.05)。花青素的稳定性受热、pH值、光、H2O2等因素影响，且不同来源的花青素受上述因素的影响具有差异性[21]。本研究表明，三华李果汁的总花青素经82～93℃范围内短时间处理基本稳定。

表 5 不同巴氏杀菌处理对三华李果汁中总花青素含量的影响

Table 5 Total anthocyanin contents of Sanhua plum juice after different pasteurization treatments

mg/L

表 6 不同巴氏杀菌处理后总花青素含量的方差分析

Table 6 Analysis of variance for total anthocyanin content after pasteurization treatment

2.5 不同巴氏杀菌条件对果汁中花青素单体的影响

花青素类物质在紫外-可见光下通常有2个特征吸收峰，分别在260～270nm和520～530nm波长处[22]。利用HPLC-PDA对三华李果汁中的花青素进行分析，得到两种花青素单体：单体1和单体2(峰1和峰2)(图2)。峰1和峰2的UV-VIS特征性光谱如图3所示。不同巴氏杀菌处理后三华李果汁中花青素单体的含量(以峰面积表示)如表7、8所示。结果经方差分析(表9、10)，不同的巴氏杀菌处理对花青素单体含量没有显著性影响(P＞0.05)。

图 2 三华李果汁中花青素的HPLC-PDA色谱图

Fig.2 HPLC-PDA chromatogram of anthocyanins in Sanhua plum juice

图 3 三华李果汁中峰1(A)、2(B)紫外-可见光谱图

Fig.3 UV-VIS spectra of peak 1 (A) and peak 2 (B)

表 7 不同巴氏杀菌处理对三华李果汁中花青素单体1含量的影响

Table 7 Anthocyanin 1 contents of Sanhua plum juice (expressed as peak area) after different pasteurization treatments

注：含量以峰面积表示。表8同。

表 8 不同巴氏杀菌处理对三华李果汁中花青素单体2含量的影响

Table 8 Anthocyanin 2 contents of Sanhua plum juice (expressed as peak area) after different pasteurization treatments

表 9 不同巴氏杀菌处理后花青素单体1的方差分析

Table 9 Analysis of variance for anthocyanin 1 content after pasteurization treatment

表 10 不同巴氏杀菌处理后花青素单体2的方差分析

Table 10 Analysis of variance for anthocyanin 2 content after pasteurization treatment

2.6 不同巴氏杀菌条件对果汁抗氧化能力的影响

不同巴氏杀菌条件处理后的果汁DPPH自由基清除能力如表11所示。经无重复双因素方差分析(表12)，随着巴氏杀菌时间增长和温度升高，自由基清除率显著升高(P＜0.05)，在93℃、60s处达到最大值。热处理使水果提取物的抗氧化能力提高在其他文献[19,23-25]中也有报道。这可能是因为热处理可破坏植物中内源性多酚氧化酶，提高了抗氧化物质的浓度，从而使得总抗氧化能力提高[19]。

表 11 不同巴氏杀菌处理对三华李果汁DPPH自由基清除能力的影响

Table 11 DPPH radical scavenging capacity of Sanhua plum juice after different pasteurization treatments

%

表 12 不同巴氏杀菌处理后DPPH自由基清除能力的方差分析

Table 12 Analysis of variance for DPPH radical scavenging capacity after pasteurization treatments

3 结 论

不同的巴氏杀菌处理对三华李果汁中的总多酚、花青素、花青素单体均无显著性影响。但是随着加热温度的升高和加热时间的延长，果汁中的VC含量呈现先增大后降低的趋势。而DPPH自由基清除率则随着温度的升高和处理时间的延长，呈现增长趋势，其作用机制还尚不清晰，需进一步研究。在设计的12组巴氏杀菌处理下，88℃、15s可最大化的保留VC的含量，而在93℃、60s DPPH自由基清除率达到最高。

参考文献：

[1] 肖仔君, 钟瑞敏, 许晓春, 等. 三华李果渣食用色素提取及其稳定性研究[J]. 食品与机械, 2010, 26(2): 27-32.

[2] 李升锋, 刘学铭, 叶尚, 等. 三华李原汁的生产工艺及其营养成分分析[J]. 中国果菜, 2005(2): 38.

[3] 张亮亮, 李敏, 林鹏, 等. 李子果肉单宁结构及其抗氧化能力的研究[J]. 林产化学与工业, 2008, 28(4): 1-6.

[4] 董桂红, 刘延吉. 三华李花色苷对D-半乳糖致衰小鼠皮肤组织的抗氧化作用[J]. 食品工业, 2011(11): 94-96.

[5] RAO A V, AGARWAL S. Role of antioxidant lycopene in cancer and heart disease[J]. J Am Coll Nutr, 2000, 19(5): 563-569.

[6] SNODDERLY D M. Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins[J]. Am J Clin Nutr, 1995, 62(Supp1 1): 1448-1461.

[7] VALKO M, LEIBFRITZ D, MONCOL J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2007, 39(1): 44-84.

[8] 吴继军, 陈卫东, 张友胜, 等. 三华李酒生产工艺研究[J]. 酿酒, 2006, 33(2): 74-75.

[9] 邝婉湄, 李婷, 何建妹, 等. 三华李凉果中复合甜味剂配方的研究[J]. 农产品加工, 2011(1): 45-47.

[10] NEHMATALLAH N J. Capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography determination of polyglutamyl folates in citrus products[D]. Gainesville: University of Florida, 2003.

[11] GARZON G A, RIEDL K M, SCHWARTZ S J. Determination of anthocyanins, total phenolic content, and antioxidant activity in Andes berry (Rubus glaucus Benth)[J]. J Food Sci, 2009, 74(3): 1288-1299.

[12] SELLAPPAN S, AKOH C C, KREWER G. Phenolic compounds and antioxidant capacity of georgia-grown blueberries and blackberries[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50: 2432-2438.

[13] NICOUE E E, SAVARD S, BELKACEMI K. Anthocyanins in wild blueberries of quebec: extraction and identification[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55: 5626-5635.

[14] WROLSTAD R E, ACREE T E, DECKER E A, et al. Current protocols in food analytical chemistry[M]. New York: JohnWiley & Sons, Inc, 2001.

[15] 王锐, 周云, 何嵋. 用清除DPPH法测定玫瑰茄色素的抗氧化活性[J]. 广东化工, 2011, 38(2): 166-167.

[16] 陈玉霞, 刘建华, 林峰, 等. DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J]. 实验室研究与探索, 2011, 30(6): 11-14.

[17] HUANG Wuyang, ZHANG Hongcheng, LIU Wenxu, et al. Survey of antioxidant capacity and phenolic composition of blueberry, blackberry, and strawberry in Nanjing[J]. J Zhejiang Univ Sci B (Biomed& Biotechnol), 2012, 13(2): 94-102.

[18] 白红进, 周忠波, 杜红梅, 等. 黑果枸杞叶片甲醇提取物清除自由基活性究[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(2): 326-327.

[19] DEWANTO V, WU Xianzhong, ADOM K K, et al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50: 3010-3014.

[20] GAHLER S, OTTO K, BÖHM V. Alterations of vitamin C, total phenolics, and antioxidant capacity as affected by processing tomatoes to different products[J]. J Agric Food Chem, 2003, 51: 7962-7968.

[21] KHANAL R C, HOWARD L R, PRIOR R L. Effect of heating on the stability of grape and blueberry pomace procyanidins and total anthocyanins[J]. Food Res Int, 2010, 43: 1464-1469.

[22] DAMODARAN S, PARKIN K, FENNEMA O R. Food chemistry[M]. 4th ed. Boca Raton: CRC Press Inc, 2011: 681-687.

[23] XU Guiha, YE Xingqian, CHEN Jianchu, et al. Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extract[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55: 330-335.

[24] PAARI A, NAIDU H K, KANMANI P, et al. Evaluation of irradiation and heat treatment on antioxidant properties of fruit peel extracts and its potential application during preservation of goat fish parupenaeus indicus[J]. Food Bioprocess Technol, 2012, 5: 1860-1870.

[25] LIN C C, HUNG P F, HO S C. Heat treatment enhances the NO-suppressing and peroxynitrite intercepting activities of kumquats (Fortunells margarita swingle) peel[J]. Food Chem, 2008, 109: 95-103.