脉冲强光对啤酒酵母细胞损伤及通透性的影响

张佰清，王 嵘

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

摘 要：通过脉冲强光处理啤酒酵母菌悬液，研究菌体细胞损伤及通透性的变化。结果表明：当光流量为1790.37mJ/cm2时，丙二醛含量达到8.01nmol/mL，超氧化物歧化酶的相对酶活力降低为53.02%，碱性磷酸酶的活力为1.17U/L。此外，菌体及菌液中Na+、K+的含量发生变化，透射电镜观察到菌体细胞出现变形和破裂。因此，脉冲强光作用后，啤酒酵母菌体细胞结构被破坏且内溶物流出，造成细胞通透性、离子通道发生变化，甚至造成菌体细胞死亡。

关键词：脉冲强光；啤酒酵母；细胞损伤；通透性

Damage of Saccharomyces cerevisiae Cell and Permeability Induced by Pulsed Light Irradiation

ZHANG Bai-qing，WANG Rong

(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract：The study was designed to explore damage of Saccharomyces cerevisiae cell and the change of permeability after pulsed light treatment as a non-thermal physical sterilization technology on yeast suspension. When the light flux was 1790.37 mJ/cm2, the leakage of MDA was 8.01 nmol/mL and the SOD activity was reduced to 53.02%. The AKP activity was 1.17 U/L. In addition, the contents of Na+ and K+ were changed. The transmission electron microscopy (TEM) showed the deformation and rupture of Saccharomyces cerevisiae cells. From these results, we draw the conclusion that Saccharomyces cerevisiae cells were damaged, which led to leakage of cell contents and changes of ion channels or even cell death.

Key words：pulsed light；Saccharomyces cerevisiae；cell damage；cell permeability

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0111-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321023

脉冲强光杀菌技术是近几年开发的新型冷杀菌技术，它是采用强烈白光闪照的方法进行灭菌[1]。氙气灯产生的脉冲强光，其中有至少70%的电磁能来自波长为170～2600nm的光线，这类似于太阳光在400～500nm时发射的最大电磁能[2]。DNA吸收紫外光产生的光化学效应是脉冲强光杀灭微生物的主要原因[3]。目前国外关于脉冲强光致死微生物的效果及机理研究较多，Rowan等[4]研究了脉冲强光不同紫外线含量条件下，革兰氏阴性菌对脉冲强光照射处理的敏感性较革兰氏阳性菌更强。Takeshita等[5]研究得到脉冲强光可以作为一种有效灭火酵母菌的杀菌方法，与紫外线杀菌相比，脉冲强光具有杀菌用时短、致死率高的特点。Krishnamurthy等[6]研究了脉冲紫外光失活金黄色葡萄球菌的效果。Takeshita等[7]研究得到脉冲强光中起到主要杀菌作用的是紫外光部分。

酸性食品中细菌受到抑制，酵母菌和霉菌能够正常生长，果汁的pH值在2.4～4.2之间，糖含量高，因而在果汁中生长的微生物主要是酵母菌，其次是霉菌和极少数的细菌[8]。以啤酒酵母菌作为实验菌，研究脉冲强光处理后菌悬液中的丙二醛(MDA)的生成量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、碱性磷酸酶的活性、细胞内外离子含量的变化，通过透射电子显微镜观察酵母菌的细胞结构，为研究脉冲强光致死酵母菌的机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

啤酒酵母菌株由沈阳农业大学土地与环境学院微生物实验室提供。

麦芽汁固体斜面培养基[9](进口澳麦芽) 济南双麦啤酒物资有限公司；葡萄糖酵母(YPD)培养基。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、邻苯三酚、盐酸、冰醋酸、硝酸等；钾、钠标准溶液(质量浓度均为1000µg/mL) 国家钢铁材料测试中心；丙二醛测定试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒(酶标仪法) 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

脉中强光装置 沈阳农业大学食品学院自行设计[10]；TG16-WS型台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；Y92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Model 680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；AAnalyst400型原子吸收光谱仪 新加坡Perkin Elmer公司；JEM-1200EX型透射电镜 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

将啤酒酵母接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养18h后，以10%的接种量转接于YPD液体培养基中培养至对数生长期，将菌液离心得菌体沉淀，洗涤2～3次，重新悬浮在无菌生理盐水中，于涡旋振荡器上将酵母细胞打散，使菌悬液的浓度达到106～107CFU/mL，冷藏备用。

1.3.2 脉冲强光处理方案设计

在干热灭菌后的培养皿中加入6mL菌悬液，取下培养皿盖后放入杀菌处理室内，保证培养皿在氙灯的正下方，以光流量为参数：0(CK)、16.58、74.60、265.24、828.87、1790.37mJ/cm2。以未经脉冲强光作用的菌悬液为对照组，每次处理重复3次，研究脉冲强光对啤酒酵母菌细胞的损伤。

1.3.3 细胞膜脂质过氧化降解产物MDA含量的测定

菌液经脉冲强光处理后，在冰浴条件下进行超声波细胞破碎，再于4℃条件下10000r/min离心15min，取上清液用于MDA含量的测定，以未经脉冲强光处理的菌液为对照。具体方法参考MDA含量测定试剂盒说明书，经过公式计算得到MDA含量[11]。

1.3.4 SOD活性的测定

取经脉冲强光作用后的菌悬液及对照组菌悬液，经超声波破壁处理后于高速离心机中离心20min，得到粗酶液。SOD活性的测定采用改良的邻苯三酚自氧化法[12]，结果用相对酶活力表示，按照下式[13]计算。

1.3.5 脉冲强光对细胞壁损伤的测定

将酵母菌菌液按1.3.2节处理作用后，4℃、1000r/min离心15min，取上清液，用碱性磷酸酶试剂盒(酶标仪法)分别测定不同处理条件下的酶活性，间接表示脉冲强光对细胞壁的损伤程度，具体方法按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 离子含量的测定

参考GB/T 5009.91—2003《食品中钾、钠离子含量的测定》进行样品处理和标准曲线绘制，见表1，经脉冲强光作用后分别收集菌体及菌液样品于250mL高型消化瓶中，加入混合酸消化液于通风厨中加热消化，用同样方法做试剂空白作为对照。待烧杯中的液体接近2mL时，取下冷却，定容后可用于钾、钠和钙离子的测定[14]。

表 1 标准曲线方程及仪器最佳工作参数

Table 1 Standard curve equations and optimal instrumental parameters

1.3.7 菌体形态的透射电镜观察

采用透射电镜负染色法处理样品，同上述方法制备菌悬液，按1.3.2节对菌悬液进行脉冲强光照射，然后将菌悬液滴在附有福尔莫瓦膜的200目金属载网上，调整菌悬液的浓度，充分浸润15min后，把金属载网取出后晾干，用4%磷钨酸染色2～3min后自然干燥[15]，用JEM-1200EX型透射电子显微镜观察啤酒酵母菌体形态，并进行拍照。

2 结果与分析

2.1 脉冲强光作用对细胞脂质过氧化产物MDA含量的影响

图 1 脉冲强光作用对啤酒酵母细胞脂质过氧化产物MDA含量的影响

Fig.1 Change of MDA content in S. cerevisiae after pulsed-light irradiation

菌体细胞在代谢的过程中可以通过酶系统及非酶系统产生氧自由基，它能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并且把活性氧转化成非自由基性的脂类分解产物，这些分解产物中有一些物质(如MDA)能引起细胞代谢障碍，甚至死亡。通过测定MDA含量可以间接地反映出细胞受到损伤的程度。由图1可知，随着处理强度不断增大，MDA含量缓慢增加，当光流量达到265.24mJ/cm2，MDA含量显著增大，随后增加量开始趋于平缓。MDA含量最大为8.01nmol/mL，与对照组相比增加了98.42%。结果表明，脉冲强光使啤酒酵母菌体细胞受损，可能促进菌体脂质过氧化。

2.2 脉冲强光作用对细胞内超氧化物歧化酶活性的影响

图 2 脉冲强光作用对啤酒酵母细胞内超氧化物酶活性的影响

Fig.2 Change of SOD activity in S. cerevisiae after pulsed-light irradiation

抗氧化防御系统是体内重要的活性氧清除系统，主要包括抗氧化酶及小分子抗氧化剂[16]，如SOD，它是一种重要的氧自由基清除剂，其活性或含量可随环境的变化发生明显变化。SOD是一类广泛存在与生物体内的金属酶[17]。因此，SOD相对酶活性的变化可以间接反映啤酒酵母细胞受到损伤的状况。由图2可知，随着处理强度的增大，SOD相对酶活力有所降低，当光流量达到1790.37mJ/cm2时，其相对酶活力降低为53.02%，说明脉冲强光对抗氧化酶具有一定的钝化作用。

2.3 脉冲强光作用对酵母菌细胞壁中AKP活性的影响

图 3 脉冲强光作用对啤酒酵母细胞壁中AKP活性的影响

Fig.3 Change of AKP activity in S. cerevisiae after pulsed-light irradiation

酵母细胞壁一般分为3层，内层为葡聚糖层，中间含有丰富的蛋白质，外层为甘露寡糖层，层和层之间可部分镶嵌[18]。酵母菌细胞壁是一层坚韧的结构，若干扰微生物细胞壁的正常合成可以引起菌体抗渗透压能力的下降，导致菌体变形、破裂甚至是死亡。AKP是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下在胞外不能检测到其活性，当脉冲强光作用于酵母细胞结构时，细胞壁或者细胞膜遭到破坏，其通透性增加，AKP泄漏到细胞外，通过检测AKP酶活性的变化可以反映细胞壁的透性变化[19]。由图3可知，随着光流量不断加大，培养液中AKP的渗出量开始缓慢增加，当光流量达到265.24mJ/cm2时，AKP活力达到0.87U/L，当光流量增大时，AKP活力达到最大值1.17U/L，且远高于对照组，说明脉冲强光对啤酒酵母菌细胞壁具有一定的破坏作用。

2.4 脉冲强光对酵母菌细胞膜离子孔道的影响

表 2 脉冲强光处理对啤酒酵母细胞内外离子含量的影响(

x

±s，n=3)

Table 2 Metal ion contents of S. cerevisiae after pulsed-light irradiation (

x

±s，n=3)

µg/g

由表2可知，当光流量低于74.60mJ/cm2时菌体及菌液中Na+含量变化缓慢，当光流量继续增加时，菌体中Na+含量最高达到339.18µg/g，菌液中Na+含量最低达到160.53µg/g；菌体中K+含量随着光流量的增加缓慢释放，光流量达到1790.37mJ/cm2时，K+含量降低了49.8%，同时随着光流量的增大，菌液中K+含量也不断增加，最高可达到34.26µg/g。由此可说明脉冲强光处理能够破坏细胞膜的Na+及K+通道，致使菌体细胞内的Na+含量增加，K+发生外渗，细胞内外的渗透压和酸碱平衡受到相应的破坏。

2.5 透射电镜负染色

A

B

C

D

E

F

A. 未经脉冲强光处理(0mJ/cm2)；B～F. 光流量分别为16.58、74.60、265.24、828.87、1790.37mJ/cm2。

图 4 脉冲强光作用后啤酒酵母菌细胞的透射电镜负染色照片

Fig.4 TEM micrographs of S. cerevisiae after pulsed-light irradiation

脉冲强光杀菌是可见光、红外光和紫外光的协同效应，它们可对菌体细胞中的DNA、细胞膜、蛋白质和其他大分子产生不可逆的破坏作用，从而杀灭微生物[20]。由图4可知，随着光流量不断增大，啤酒酵母菌体受到损伤的程度不断增强，图4A中未经脉冲强光处理的啤酒酵母细胞形态完好，呈椭圆型且结构完整，细胞壁与细胞膜结合紧密。图4B为光流量16.58mJ/cm2时，细胞结构略有受损，形态较完整。图4C～F中，随着光流量的增大，菌体开始变形，细胞壁与细胞膜出现分离，细胞结构遭到严重破坏，菌体出现模糊甚至缺失。因此，脉冲强光作用破坏了细胞的结构，使细胞原生质流失最终导致菌体死亡。

3 结 论

经过脉冲强光处理的菌悬液，当光流量为1790.37mJ/cm2时，MDA达到最大生成量为8.01nmol/mL，远高于对照组，说明脉冲强光使啤酒酵母菌体细胞受损，很可能促进菌体脂质过氧化作用。随着光流量的增大，SOD相对活性逐渐降低，当光流量为1790.37mJ/cm2时，相对酶活力降低到53.02%，表明抗氧化酶受到抑制，导致细胞内氧化应激反应强度降低，同时检测到菌悬液中的AKP活性不断增大，培养液中AKP的活力达到最大值1.17U/L，说明脉冲强光对啤酒酵母菌细胞壁具有一定的破坏作用。脉冲强光作用使菌体内外Na+与K+失衡，破坏细胞膜的Na+及K+通道，导致菌体细胞内的Na+含量增加，K+发生外渗。由透射电镜负染色照片可知，经脉冲强光作用后的啤酒酵母，随着处理强度的增强，菌体形态出现明显变化，说明啤酒酵母细胞受到损伤，细胞膜及细胞壁已经受到严重破坏。因此，细胞的损伤及通透性的变化是造成酵母菌细胞死亡的主要原因。

参考文献：

[1] 周万龙, 任赛玉, 黄建军, 等. 自动控制脉冲强光杀菌装置的研制[J]. 食品与机械, 1997(4): 12-13.

[2] 张璇, 鲜瑶. 脉冲强光杀菌技术及其在果蔬上的应用[J]. 农产品质量与安全, 2011(3): 44-47.

[3] 南楠, 袁勇军, 戚向阳, 等. 脉冲强光技术及其在食品杀菌中的应用[J]. 食品工业科技, 2010, 31(12): 405-408.

[4] ROWAN N J, MACGREGOR S J, ANDERSON J G, et al. Pulsed-light inactivation of food-related microorganisms[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(3): 1312-1315.

[5] TAKESHITA T, SHIBATO J, SAMESHIMA T, et al. Damage of yeast cells induced by pulsed light irradiation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 85(2): 151-158.

[6] KRISHNAMURTHY K, DEMIRCI A, IRUDAYARA J. Inactivation of Staphylococcus aureus by pulsed UV light sterilization[J]. Journal of Food Protection, 2004, 67(5): 1027-1030.

[7] TAKESHITA K, YAMANAKA H, SAMESHIMA T, et al. Sterilization effect of pulsed light on various microorganisms[J]. Journal of Antibacterial and Antifungal Antifungal Agents, 2001, 30(5): 277-284.

[8] 樊明涛, 赵春燕, 雷晓凌. 食品微生物学[M]. 郑州: 郑州大学出版社, 2011: 304-317.

[9] 郝林. 食品微生物学实验技术[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001: 145.

[10] 马凤鸣, 张佰清, 徐江宁, 等. 脉冲强光杀菌装置设计的初步研究[J]. 食品与机械, 2005, 21(6): 66-67.

[11] 陈钧辉, 李俊, 张冬梅, 等. 生物化学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2008: 51-53.

[12] 董海胜, 陈斌. 利用修改的Marklund方法测定SOD活性[J]. 保鲜与加工, 2009, 9(1): 27-29.

[13] 胡斌, 曾庆梅. 超高压对枯草芽孢杆菌中三种抗氧化酶活性的影响[D]. 合肥: 合肥工业大学, 2007.

[14] 覃毅磊. 火焰原子吸收光谱法测定食品中钠、钾的含量[J]. 东莞理工学院学报, 2005, 12(1): 96-97.

[15] 凌诒萍, 俞彰. 细胞超微结构与电镜技术: 分子细胞生物学基础[M]. 2版. 上海: 复旦大学出版社, 2004.

[16] PORTé C, SOLé M, ALBAIGéS J. et al. Responses of mixed-function oxygenase and antioxidase enzyme system of Mytillus sp. to organic pollution[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, 1991, 100(1/2): 183-186.

[17] 张中林, 孙宏伟, 郑剑玲, 等. 邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶(SOD)活性[J]. 辽宁中医药大学学报, 2009, 11(5): 185-186.

[18] 赵芳芳, 张日俊. 酵母细胞壁生理功能及其应用[J]. 中国饲料, 2003(17): 17-18.

[19] 刘蔚, 周涛. ε-聚赖氨酸抑菌机理研究[J]. 食品科学, 2009, 30(9): 15-20.

[20] 袁勇军, 唐敏, 陈伟, 等. 脉冲强光对连续流动状态下黄酒杀菌效果及品质的影响[J]. 中国酿造, 2011(1): 71-73.