高压均质和热处理对豆乳蛋白质溶解性的影响

姜 梅，董明盛，芮 昕，李 伟，陈晓红

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

摘 要：探讨高压均质及热处理对豆乳蛋白质溶解性能的影响及其机理。结果表明：随着均质压力(0～140MPa)增加，生豆乳蛋白质溶解度显著增加(P＜0.05)，颗粒粒度和表观黏度显著下降(P＜0.05)；均质后加热可进一步增强豆乳这些特性。透射电镜结果揭示均质与加热联合处理能够增加豆乳颗粒分散度和均匀性、降低豆乳颗粒粒径。内部荧光分析结果表明均质和加热改变了大豆蛋白分子的构象，增加色氨基酸微环境的极性，增强了蛋白质分子水合作用。SDS-PAGE表明，均质和加热能够分解蛋白质，诱导可溶蛋白产生聚集物生成，提高了豆乳蛋白质溶解度。

关键词：高压均质；加热；大豆蛋白质；溶解度；豆乳；机理

Effects of High Pressure Homogenization and Heat Treatment on Protein Solubility in Soymilk

JIANG Mei，DONG Ming-sheng，RUI Xin，LI Wei，CHEN Xiao-hong

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：The effect of high pressure homogenization and heat treatment on protein solubility in soymilk and the mechanism involved were studied. High pressure homogenization increased the protein solubility in raw soymilk and reduced the viscosity and particle size. This effect was enhanced when used in conjunction with heat treatment. TEM observation demonstrated that a combination of thermal treatment with high-pressure homogenization increased the dispersion and uniformity of soymilk particles and decreased the particle size, improving hydration properties of soymilk and thereby increasing the solubility of the soy proteins. Internal fluorescence analysis showed that homogenization and heating changed the conformation of proteins in soymilk, improved the polarity of the microenvironment around tryptophan residues and enhanced hydration of protein molecules. SDS-PAGE results showed that both treatments could induced and degrade protein aggregates and simultaneously improve the solubility of soymilk proteins.

Key words：high pressure homogenization；heating；soy protein；solubility；soymilk；mechanism

中图分类号：TS214.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0125-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321026

豆乳是我国传统的植物蛋白饮料，深受消费者喜爱。豆乳中不仅含蛋白质，还含有脂类、碳水化合物、纤维等物质。热加工即保证豆乳食品的安全性和提高货架期，又增加豆乳消化性和豆香味及减少豆腥味[1]；但豆乳在加工和贮藏过程中极易产生油水分层、沉淀和风味不稳定等质量问题[2-3]。高压均质比传统的均质乳化更精致[4]，可以降低乳液的粒径和提高乳液分散性[5-6]及修饰蛋白结构等性质[7-9]，是一项极具潜力发展的技术，已广泛应用在食品、医药和化妆品领域[10-12]。蛋白质溶解性是蛋白质水化作用的重要体现，蛋白质的乳化性、凝胶性和成膜性等加工特性与溶解度有关[13]。蛋白质溶解性研究主要集中在大豆分离蛋白的方面[14-16]；可是豆乳的体系复杂，豆乳中蛋白质是天然蛋白构象，与加工后的纯大豆蛋白构象和存在状态不同。很少有人研究豆乳中大豆蛋白质的溶解度。本实验研究高压均质及热处理对豆乳中蛋白质的溶解性影响及其机理，为相关科学研究及工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆 市售。

十二烷基硫酸钠(SDS) 北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)、甘氨酸(Gly) 厦门宝宣宁生物科技有限公司；甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED) 南京生兴生物技术有限公司；过硫酸铵(AP) 上海凌峰化学试剂有限公司；以上试剂均为生物级纯度，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造；DJM50L胶体磨、GYB 60-6s均质机 上海华东高压均质机厂；NS1001L高压均质机 意大利Niro Soavi公司； Malvern-2000粒径测量仪 英国Malvern Instruments Corporate公司；Allegra 64R离心机 美国Backman Kurt公司；H-7650透射电子显微镜、F-4600荧光分析仪 日本Hitachi公司；SE 600 Ruby SDS-PAGE电泳仪 美国GE公司。

1.3 方法

1.3.1 豆乳的制备

在室温下，豆乳用2～3倍的水浸泡过夜，过滤去掉多余的水分；将湿豆加水(m(干豆):m(水)=10:1)经高速组织捣碎机、胶体磨制成豆水混合物，再经80目尼龙滤布过滤制成生豆乳(0MPa)。生豆乳蛋白质和脂肪含量分别为3.58%和1.62%。将生豆乳分为3份：1份放置4℃冰箱备用，另1份用于高压均质处理，第3份经95℃加热5min后，立即放入冰水混合物中冷却，置于4℃冰箱备用。

1.3.2 高压处理

先用普通均质机20MPa预处理豆乳，再进行高压均质处理。样品处理进口温度20℃、循环两次，处理压力分别为20、40、60、80、100、120、140MPa。部分样品立即放入冰水混合物中冷却，放置4℃冰箱备用；另一部分经95℃加热5min后，立即放入冰水混合物中冷却，置于4℃冰箱备用。

1.3.3 豆乳蛋白质溶解度测定

按照文献[15,17]方法，并作修改。豆乳在4℃、4000r/min条件下离心15min。用凯氏定氮法测定上清液(可溶部分)的蛋白含量。上清液的蛋白含量与样品蛋白含量的比值即为溶解度。每个取样测定3次。

1.3.4 豆乳粒径测定

室温下，样品用去离子水稀释50倍，分散相折射率为1.471，分散剂折射率为1.330，然后在激光纳米测定仪上进行粒度的测定，每个取样测定4次。

1.3.5 豆乳表观黏度测定

在20℃测定样品的流变特性。样品放置在直径50mm的铜圆盘上，圆盘狭缝1mm，剪切速率在0.1～160s-1进行扫描，得到表观黏度与剪切速率及剪切应力与剪切速率的关系图。每个取样测定3次。

1.3.6 透射电镜观察

将样品用戊二醛固定(终体积分数2%～3%)，固定2h以上，0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；然后用2%四氧化锇固定2～3h，0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；接着用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min；100%乙醇脱水3次，每次30min；然后用环氧丙烷置换3次，每次30min，再浸渍10h以上；随后将样品放入盛有包埋剂板中，把包埋剂置于40、60℃条件下聚合各48h；之后超薄切片，样品表面积小于0.2mm、厚度50～90mm；最后用醋酸铀、柠檬酸铅各漂染5～15min。

1.3.7 荧光光谱分析

取样品3mL，置于F-4600型荧光扫描仪中进行扫描。扫描波长范围为305～450nm，激发波长为290nm，扫描速度为30nm/min，狭缝大小为2.5nm，温度为20℃。每个取样测定3次。

1.3.8 SDS-PAGE电泳

采用16cm×16cm的电泳板进行恒压电泳，4%浓缩胶和12.5%分离胶，考马斯亮蓝R-250染色。还原性电泳样品缓冲液中含有10mmol/L β-巯基乙醇，其他成分与非还原SDS-PAGE电泳缓冲液相同。

还原性电泳样品经稀释后于沸水中煮沸5min，非还原性样品经稀释后于60℃水浴锅中水浴30min，冷却至室温后在16000r/min离心10min。

采用1.5mol/L Tris pH8.8、30%丙烯酰胺凝胶贮液、10%SDS、10%AP以及TEMED配制12.5%分离胶；用0.5mol/L Tris pH8.8、30%丙烯酰胺凝胶贮液、10% SDS、10% AP以及TEMED配制4%浓缩胶。

上样后将电泳板放入电泳槽中，开始恒压电泳。初始设置电流为20mA，待样品跑至分离胶时调电流至40～50mA。待条带跑至板的最底部时，将胶小心剥离，放置在染色液中染色1h，然后置入乙酸脱色液中脱色11～12h，需注意及时更换脱色液。待电泳胶的底色脱为透明时，进行扫描。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS 16.0软件进行方差分析和Posthoc Tukey HSD检验(P＜0.05)，采用Origin 8.0 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 豆乳蛋白质溶解度测定结果

相同柱形图的字母不同表示差异显著(P＜0.05)。下同。

图 1 均质和加热对豆乳蛋白质溶解度的影响

Fig.1 Effect of homogenization pressure on protein solubility of raw and heated soymilk

豆乳蛋白质溶解性能对其加工用途和商品价值有很重要的意义。由图1可知，豆乳蛋白质溶解度随着均质压力的增加而显著增加(P＜0.05)；当均质压力从0MPa升高到140MPa时，生豆乳溶解度由51.4%增加至84.2%，提高了63.8%。

随着均质压力增加，豆乳蛋白质变性程度增加[18]，这是由于天然大豆蛋白受到高压均质的高速剪切空穴和湍流等作用[19]，大豆蛋白的紧密结构逐渐展开，使得球状蛋白质内部的极性基团和疏水基团暴露出来，蛋白质分子(颗粒)的表面电荷分布加强，围绕着新暴露的极性基团的结合水也增多，蛋白质的水化作用增强。溶解性是蛋白质水化作用的重要体现，蛋白质的水化作用增强，则其溶解度增大。李汴生等[17]用静态高压处理大豆分离蛋白发现高压可以使蛋白质溶解度提高，但其蛋白质溶解度比本研究低很多。这是因为高压均质和静态高压的机理不同，二者都能使蛋白变性、空间结构展开，蛋白质的水化作用增强；但静态高压只能改变大分子蛋白空间结构，而高压均质的高速剪切、空穴和涡旋作用可以使共价键断裂，分解蛋白质，增强蛋白水和作用；而且豆乳中蛋白的结构与经加工过部分变性大豆分离蛋白不同，结构紧密，从而均质的作用加强。

加热可以分解蛋白质，产生可溶性小分子聚物，增加蛋白质的溶解度[19]；但加热时间长或温度高，小分子可溶蛋白聚集成大分子蛋白，从而降低了蛋白溶解度[19-21]。适当控制热加工条件，控制大分子蛋白聚集物产生，避免蛋白溶解度的下降[21-22]。由图1可知，加热后，未均质豆乳加热溶解度增加了6.4%。Nik等[23]在95℃、 5min处理豆乳(蛋白体积分数3.98%～4.9%)，加热后，豆乳蛋白质含量都增加了。均质压力升高，熟豆乳蛋白质溶解度增加，140MPa熟豆乳溶解度达到了91.1%。均质并没有完全展开蛋白空间结构，均质后加热蛋白质空间结构进一步展开，增加亲水基暴露，进一步提高了可溶蛋白的含量。

2.2 表观黏度

图 2 均质和加热对豆乳表观黏度的影响

Fig.2 Effect of homogenization pressure on apparent viscosity of raw and heated soymilk

物料的表观黏度反映了分子内部情况，黏度降低有助于蛋白水化作用。将不同处理的豆乳用MCR301流变仪测定其表观黏度。由图2可知，随着均质压力增加，生豆乳表观黏度显著下降(P＜0.05)。豆乳未均质时，豆乳中的蛋白、油滴等颗粒分布不均匀、相互聚集，蛋白质、油滴之间相互缠绕。均质增加了豆乳体系中蛋白质、油滴等颗粒分布的均匀性和分散性，减少大分子之间的缠绕作用，使生豆乳蛋白表观黏度下降。

不同均质压力的熟豆乳，加热后豆乳表观黏度也随均质压力增加显著下降(P＜0.05)；这说明均质后加热，豆乳中蛋白质、油滴之间相互缠绕作用进一步减少，这有利于蛋白的水化作用。

2.3 豆乳粒径

豆乳是以水为连续相，蛋白质、脂肪(以油滴形式存在)、纤维为分散相不连续分散在水中，形成O/W的乳浊液。豆乳颗粒粒径减小增加了豆乳脂肪球的比表面积，颗粒的数量增多有利于豆乳中蛋白质的水化作用；豆乳颗粒分散性增加，可以提高蛋白溶解度。因此说，乳液的粒径大小及粒径的分布都会影响豆乳蛋白的溶解性、稳定性及产品的感官性状等。经过不同压力均质豆乳加热后的粒径变化，结果见表1及图3。

表 1 均质和加热对豆乳粒径的影响

Table 1 Effect of homogenization pressure and heating on particle size of raw and heated soymilk

注：D4,3体积平均粒径，D4,3=Σnidi4/Σnidi3；D3,2表面积平均粒径，D3,2=Σnidi3/Σnidi2；D0,5中位粒径：粒径低于此值颗粒体积占颗粒总体积的50%；同一列中的不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

图 3 豆乳颗粒粒径分布图

Fig.3 Particle size distribution of raw and heated soymilk

由表1和图3可以看出，随着压力增加，豆乳颗粒的粒径显著下降(P＜0.05)，当压力≥100MPa时，D4,3、D3,2、D0,5的数值＜亚微米级。D4,3、D3,2、D0,5分别从未均质的14.05、3.40、12.83μm在140MPa下降到0.28、0.28、0.27μm，粒径大小达到了亚微米级。

未均质生豆乳(0MPa)的粒径主要分布在3～40μm，粒径最大体积峰在15.89μm处，这部分颗粒体积占总体积的87.8%；粒径小于1μm的颗粒体积仅占总体积的6.33%。均质压力＜100MPa时，豆乳大小及分布与未均质豆乳变化相同。均质压力≥100MPa时，粒径分布形状发生了极大的改变，粒径最大体积位置及主要分布区间均在亚微米级处。140MPa豆乳的粒径主要分布在0.2～0.68μm，粒径最大体积峰在0.28μm处，这部分颗粒占总体积的91.6%。豆乳颗粒粒径减小有利于豆乳中蛋白质的水化作用。

由表1及图3可知，均质压力＜100MPa时，均质压力增加，加热使豆乳颗粒粒径显著下降(P＜0.05)；当压力≥100MPa时，加热后豆乳粒径变化不显著。未均质豆乳粒径加热后，D4,3、D3,2、D0,5分别下降到8.07、0.49、1.18μm。加热后，0MPa豆乳的粒径分布范围在0.15～10.2μm和10.2～112.5μm两个部分，增加了大粒径的体积和小粒径体积。小粒径增加有利于豆乳颗粒分散和蛋白质水化作用。大粒径分布范围增加，增加了豆乳不稳定性，使豆乳蛋白溶解度有下降趋势；加热后，大于10μm的豆乳颗粒粒径体积减少了50%左右，大粒径体积减少有利于豆乳溶解度增加。因此，从粒径总体分布情况分析，加热使豆乳蛋白质溶解度增加。

2.4 透射电镜

a

fg

m

1μm

b

fg

1μm

c

1μm

d

m

1μm

e

1μm

f

fga

1μm

g

1μm

h

250nm

i

1μm

j

250nm

k

1μm

pa

l

p

pa

250nm

a、b. 0MPa；c. 20MPa；d. 40MPa；e. 60MPa；f. 80MPa；g、h. 100MPa；i、j. 120MPa；k、l. 140MPa；fg. 游离脂肪球；fga. 脂肪聚集物；pa. 蛋白质聚集物；p. 游离蛋白质；m. 脂肪和蛋白聚集物。

图 4 0～140MPa先均质后加热豆乳的透射电镜图

Fig.4 Transmission electron micrographs of soymilk homogenized at 0—140 MPa and then heated

由图4可知，随着均质压力增加，豆乳颗粒大小逐渐减小，而且油滴分布均匀、分散性得到改善，这有利于豆乳蛋白的水化作用，提高其溶解度。豆乳颗粒分散增强也使豆乳的黏度下降。

图4a、b是未均质豆乳透射电镜图，从图中可以观察到大小不一的油滴，最大直径超过4μm，也存在小于0.5μm以下的油滴；而且发现脂肪蛋白聚集物m或游离油滴fg，还有脂肪聚集物fga和黑色蛋白聚物pa。20～140MPa条件下，球形油滴周围可以看到黑色蛋白聚集物pa。随着均质压力增加，豆乳颗粒逐渐减小，而且油滴分布均匀。在140MPa观察到游离蛋白质p及蛋白质聚集物pa；在油滴周围吸附蛋白质，这增加了油滴的稳定性。压力达到100MPa后熟豆乳颗粒分散性增强；140MPa熟豆乳颗粒分散性和均匀性最高，140MPa熟豆乳颗粒分散性和均匀性效果相当于与Cruz等[24]用200MPa处理生豆乳的效果。

2.5 荧光光谱分析

荧光光谱是一种分析蛋白质三级局部结构的有效方法。蛋白质三级结构的侧链上的芳香族氨基酸——色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)具有自然荧光，其中色氨酸(Trp)的荧光强度最大，酪氨酸(Tyr)次之，苯丙氨酸(Phe)最小，甚至在大多数情况下Phe的荧光不被激发。Tyr残基的荧光往往由于被猝灭而变得很弱。因此，蛋白质内源荧光主要来自Trp。因此，可以利用荧光强度的变化来反应酶蛋白质局部三级结构的变化[25]。

Tyr在中性水溶液的最大激发波长是282nm，Tyr所在溶液环境影响其最大激发波长，通过光谱扫描，豆乳的最大激发波长为295nm。不同处理条件豆乳的荧光光谱结果见表2。

表 2 豆乳荧光光谱分析结果

Table 2 Intrinsic relative fluorescence intensity of raw and heated soymilk subjected to homogenization at different pressures

注：a～f.同一列中的不同字母表示差异显著(P＜0.05)；u～w.不同字母表示出峰位置差异显著(P＜0.05)。

由表2可知，对于生豆乳，随着均质的增加，豆乳的荧光强度变化为先下降后升高再下降，呈波浪式显著变化(P＜0.05)。未均质生豆乳荧光强度最大为(151.9±1.8)%，40MPa和60MPa的生豆乳最低；而且随着均质压力增大，发生了明显的峰位移(P＜0.05)。当均质压力大于80MPa后，发射波长发生了4nm红移。均质后使深埋在内部的色氨基酸暴露于蛋白表面，从而使蛋白荧光强度增强，而内部色氨基酸被构象遮蔽会使蛋白荧光发生猝灭[26]。豆乳荧光强度的猝灭或增加，说明均质改变了大豆蛋白发生构象，蛋白构象改变可能使亲水的基团暴露出来，增加了蛋白质的溶解性。

加热后，相同均质处理条件的豆乳荧光强度都显著下降(P＜0.05)，且发射波长发生了7～12nm红移。红移增加使色氨基酸微环境的呈现极性[26]，有利于蛋白质溶解度的提高。

2.6 SDS-PAGE 电泳分析

大豆蛋白主要由大豆11S球蛋白(glycinin)和7S球蛋白(β-conglycinin)组成，二者占大豆蛋白质的70%。11S蛋白是一个六聚体，分子质量320～380kD，它由6个酸性亚基(A)和6个碱性亚基(B)通过二硫键连接组成，这两种亚基的分子质量大约分别为38kD和20kD。7S蛋白是一类由3种亚基(α’、α及β)通过非共价作用构成的三聚体；其分子质量150～200kD，其中α’分子质量57～72kD、α分子质量57～68kD、β分子质量45～52kD[13]。

由图5可知，豆乳的11S由A1、A2、A3和A4组成，7S由α’、α和β组成。由图6可知，所有的生豆乳在58kD处出现了AB条带即11S亚基；未均质生豆乳在36kD处出现了A亚基浅色条带及20kD处出现了B亚基浅色条带；说明生豆乳制备过程中分解了11S蛋白。

观察图5可以发现，生豆乳均质后A1、A2及B条带加深，α及β条带变浅，增加了A3条带；这说明高压均质的机械剪切力可以降解蛋白大分子聚集物，解离出11S蛋白亚基。随着均质压力的增加，α、β、A、B条带的颜色均逐渐变浅，即随着均质压力的增加，不仅可以解离大分子蛋白，也可以解离小分子的7S和11S蛋白。而7S-β、7S-α、A、B含量降低，生豆乳蛋白质的溶解度增加，这可能是均质导致蛋白分子空间展开与重构，从而增加了豆乳蛋白的极性，提高了蛋白溶解度[27]。

加热后，7S、11S的电泳条带都加深。从图5也可以观察到，随着均质压力增加，7S-β的电泳条带颜色加深；这说明加热分解了蛋白质大聚集物，产生可溶小分子蛋白，这有利于提高熟豆乳的溶解度。本研究选用大豆亚基类型与Nik等[23]选用大豆亚基类型一致；Nik等[23]认为全基因型豆乳加热后的溶解度增加。

加热后，在大于130kD的电泳条带处出现了很浅的条带，即出现了可溶蛋白聚集物(图5)，这说明加热后分解了生豆乳没有被电泳迁移的大聚集物。Utsumi等[28]认为加热导致蛋白分子解离，形成了分子质量大于106D的可溶性聚集体。大的复合物主要是由大豆球蛋白的碱性亚基和大豆伴球蛋白的β亚基以及少量α、α’组成。叶荣飞等[29]认为大豆分离蛋白形成的小分子聚集物为A、α、α’组成。形成可溶聚集物的原因可能是均质的机械作用破坏了大聚集物空间结构，加热促使其分解产生小分子可溶聚集物。均质压力升高而机械作用增大，故加热后产生的小分子聚集物条带颜色逐渐加深，从而提高了豆乳蛋白质溶解度。

1～7. 0、20、60、80、100、120、140MPa的生豆乳；8～14. 0、20、60、80、100、120、140MPa的熟豆乳。

图 5 豆乳还原性SDS-PAGE电泳图

Fig.5 Reducing SDS-PAGE patterns of raw soymilk and heated soymilk

因为β-巯基乙醇可断开二硫键，所以通过对比还原和非还原电泳图可判断亚基间是否有二硫键交联。对比图5、6可以发现，非还原性SDS-PAGE电泳加入β-巯基乙醇后，位于58kD处生豆乳蛋白质的AB基团产生的条带消失，而在36kD处出现了A亚基条带；由图6可知，均质压力增加，生豆乳AB条带仍然存在，而且不同均质压力的生豆乳条带深浅度无明显变化。这说明均质压力在20～140MPa剪切力作用不能切断AB亚基的二硫键或切断二硫键能力低。加热后，位于58kD处生豆乳蛋白质AB基团消失，而在36kD处出现了深色A亚基条带，在20kD处出现了B亚基条，但在20kD处B亚基条带颜色比未加热浅(图6)，可能是碱性亚基与其他亚基形成大分子聚集物。Ren Changang等[30]认为B亚基易于形成大分子聚集物。

1～7. 0、20、60、80、100、120、140MPa的生豆乳；8～14. 0、20、60、80、100、120、140MPa的熟豆乳。

图 6 豆乳非还原性SDS-PAGE电泳图

Fig.6 Non-reducing SDS-PAGE patterns of raw soymilk and heated soymilk

3 结 论

豆乳蛋白质溶解性对其加工特性和商品价值有很重要的意义。高压均质增加了生豆乳蛋白的溶解度，降低豆乳的黏度和粒径，加热进一步增加豆乳的这些特性。均质压力≥100MPa，均质后加热豆乳体系颗粒仍有很高分散性。均质和加热都改变大豆蛋白分子的构象和色氨基酸微环境的极性。均质和加热能够分解蛋白质，诱导可溶蛋白产生聚集物生成，提高豆乳蛋白质溶解度。豆乳蛋白质溶解度改变与豆乳粒径、黏度、分散性及蛋白空间结构有关。

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