两种化学修饰剂对小麦酯酶活性及稳定性的影响

陈 铭1,陆利霞1,2,*,熊晓辉1,2,游京晶1,2

(1.南京工业大学食品与轻工学院,江苏 南京 210009;2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心,江苏 南京 210009)

 

:目的:用右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰纯化后的小麦酯酶,并考察修饰酶的酶学性质。方法:分别采用高碘酸钠和三聚氯氰活化右旋糖酐和mPEG,得到修饰的小麦酯酶,通过红外光谱表征修饰酶基团变化,测试修饰酶的反应动力学参数,并考察温度及pH值对修饰酶活力的影响。结果:修饰后的酶与纯化酶相比,修饰酶对底物乙酸-1-萘酯的亲和力增强,并保留了大部分酶的活力,右旋糖酐修饰酶活保持率在67.1%,mPEG修饰酶的酶活保持率达到87.7%。另外,右旋糖酐修饰酶的最适温度和pH值分别为35℃和6.4,KmVmax分别为2.00mmol/L和2000µg/min,而mPEG修饰酶的最适温度和pH值为35℃和6.8,KmVmax为1.25mmol/L和2500µg/min。两种修饰酶在耐热性、耐酸碱性等方面都优于纯化酶,mPEG修饰酶的最适pH值发生改变。结论:修饰酶较纯化酶更稳定,具有一定的实用意义。

关键词:小麦酯酶;右旋糖酐;单甲氧基聚乙二醇;酶活力;稳定性

 

Two Chemical Modifiers Affect Wheat Esterase Activity and Stability

 

CHEN Ming1,LU Li-xia1,2,*,XIONG Xiao-hui1,2,YOU Jing-jing1,2

(1. College of Food Science and Light Industry, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China;

2. Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety, Nanjing 210009, China)

 

Abstract:Objective: To modify purified wheat esterase with dextran and methoxy polyethyleneglycol (mPEG), and characterize the modified enzymes. Methods: Dextran and mPEG were activated by sodium periodate and trimer cyanuric chloride, respectively, before being used to prepare the modified wheat esterases. Changes in the active groups in the modified enzyme molecules were described through infrared spectroscopy, and their kinetic parameters and the effects of temperature and pH on the modified enzyme activities were investigated. Results: In comparison with the native enzyme, the modified enzyme had better affinity for the substrate alpha-naphthyl acetate, and retained the majority of enzyme activity. The residual activity of dextran-modified enzyme was 67.1%, and the mPEG modified enzyme retained 87.7% of the original activity. In addition, thermal stability and acid-base stability of the two modified enzymes were better than those of the native one, and the optimal pH of the mPEG-modified enzyme was changed. Conclusion: The modified enzymes have more stability than the native enzyme and thus are of important practical significance.

Key words:wheat esterase;dextran;methoxy polyethyleneglycol;enzyme activity;stability

中图分类号:Q814 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0158-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321033

小麦酯酶(wheat esterase)属于植物酯酶,可以被有机磷和氨基甲酸酯类抑制,也被称为植物胆碱酯酶[1]。在机体内,它在蛋白质的信号活化作用和控制生物内在活性等许多生物过程中发挥关键作用[2]。在机体外,它的水解作用等同于乙酰胆碱酯酶和其他胆碱酯酶。Schwartz等[3]研究表明植物酯酶水解乙酸苯酯类羧酸酯表现出大量的活性。从小麦面粉中提取的天然酶活性低、稳定性差,使得小麦酯酶应用范围受到限制,而目前未见对小麦酯酶化学修饰的文献报道,因此,如何通过化学修饰提高酶分子结构的稳定性、扩展酶的使用范围,延长酶的使用和保管期限成为酶生产应用的重要研究内容。选择合适的化学修饰剂和修饰条件,在保持酶活性基础上,较大范围内改变酶的性质,提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性,改变酶的底物专一性和最适pH值等性质的方法已经被广泛应用[4]。

右旋糖酐是由α-葡萄糖通过α-1,6-糖苷键连接而成,经活化后的双羟基可与酶分子上的游离氨基共价结合。在右旋糖酐对酶修饰的文献报道中,被修饰蛋白酶比天然酶的热和酸碱稳定性明显提高[5]。聚乙二醇的生物相容性已经通过美国FDA认证,可以对一些氨基、巯基和催化位点进行定点修饰。根据已报道聚乙二醇的化学修饰研究中,研究者往往采用mPEG对超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶和辣根过氧化物酶等进行化学修饰,获得比较好的结果[6]。本实验采用活化的右旋糖酐和mPEG对纯化后的小麦酯酶进行化学修饰,以期改变酶的一些相关特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦面粉 南京市大桥北路永辉超市。

右旋糖酐(平均分子质量为40000u)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG-5000) 百灵威科技有限公司;三聚氯氰 上海阿拉丁试剂有限公司;高碘酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultra-15 50k离心过滤器装置 德国Meker公司;Nexus670型傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司;UV 1800型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;HH-2型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;雷磁PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂;FD-3冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 小麦酯酶液的制备

对熊晓辉等[7]纯化制得的小麦酯酶液用离心过滤装置于4℃、6700r/min离心15min进行超滤浓缩,收集浓缩液,并测定酶活力。

1.4 小麦酯酶的修饰

1.4.1 右旋糖酐的活化及修饰

将现配的高碘酸钠溶液(质量浓度4g/35mL)缓慢加入右旋糖酐溶液中(质量浓度1.67g/15mL),在25℃条件下避光24h搅拌反应,将所得物用截留分子质量为8000~12000u的透析袋在蒸馏水中透析24h,得到氧化右旋糖酐溶液[8]。取5mL右旋糖酐液与制备得到的1mL小麦酯酶液混合,在25℃全温摇瓶柜中避光振荡16h,加入0.1mol/L NaBH4溶液0.5mL继续振荡4h终止反应,调至pH7.0,得到经右旋糖酐修饰的小麦酯酶液避光冷藏保存[9]。

1.4.2 mPEG的活化及修饰

将1.1g三聚氯氰、10g mPEG、2g无水Na2CO3和5g分子筛5Å溶于100mL的无水苯中,25℃搅拌24h,过滤去除Na2CO3和分子筛5Å等悬浮物,加入200mL无水乙醚沉淀,再用400mL苯溶解沉淀。如此重复3次以去除其中的三聚氯氰,所得沉淀冷冻干燥后得到的白色粉末即为活化的mPEG。将50mg活化的mPEG和5mL的小麦酯酶液混合,加入15mL的磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0),25℃条件下磁力搅拌4h,仍然用截留分子质量为8000~12000u的透析袋在磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0)透析24h,调至pH7.0,得到经mPEG修饰后的小麦酯酶液,冷藏备用[10]。

1.4.3 酶活保持率

根据修饰后反应体系前后的小麦酯酶液的体积和酶活变化,按式(1)计算酶活保持率。

476509.jpg (1)

式中:C1为修饰后反应体系的酶活力/U;C0为反应前加入酶的酶活力/U;V1为修饰反应后反应体系的体积/mL;V0为反应前加入酶的体积/mL。

1.5 酶活力测定

根据Baker等[11]方法稍作改进:取10µL的酶液,用pH6.38的磷酸缓冲液稀释至10mL,在3mL的稀释液中加入50µL的浓度为0.016mol/L乙酸-1-萘酯丙酮溶液,振荡混合,在35℃恒温水浴10min后,加入0.5mL固蓝B溶液(0.8g/L的固蓝B盐,3.6g/L的SDS),混合均匀在35℃水浴中保温10min,在585nm波长处测得溶液的吸光度。用磷酸缓冲液代替稀释酶液作为空白对照。酶活力单位定义:单位时间、单位体积内小麦酯酶与底物反应生成1µg产物α-萘酚所需的酶量为一个酶活力单位,即1U,利用式(2)计算酶活力(E)。参照胡晓燕[12]对小麦酯酶酶活测定进行标准曲线的制作。

476527.jpg (2)

式中:kb分别为α-萘酚标准曲线斜率和截距相关的参数;N为稀释倍数;V为反应体积/mL;A585nm为吸光度;3.55为反应体系的体积/mL;10为稀释酶液体积/mL。

相对酶活力是指同组实验中,最高酶活力设为100,同组其他酶活力与最高值之比,以百分数表示。

1.6 红外光谱表征分析

采用KBr压片法[13]分别测定纯化酶和修饰酶的红外吸收光谱,扫描范围为4000~400cm-1,根据红外吸收光谱图,以判断酶修饰基团的变化。

1.7 温度对酶活力的影响

1.7.1 酶的最适温度

分别将纯化酶、右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶置于20(室温)、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃和70℃的反应体系下反应10min,加入显色剂后,在相应温度下保温10min,其他条件不变,测定酶活力。

1.7.2 酶的热稳定性

将纯化酶、右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶置于45、55℃和65℃密封保温,每隔一段时间取出微量测定酶活力。

1.8 pH值对酶活力的影响

1.8.1 酶的最适pH值

将纯化酶、右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶分别用pH值为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0和7.2的磷酸缓冲液进行稀释,其他条件不变,测定酶活力。

1.8.2 酶对酸碱的稳定性

将纯化酶、右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶分别与pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液等体积混合,25℃条件下密封120min测定酶活力。

1.9 酶促动力学参数

分别测定以乙酸-1-萘酯为底物,浓度为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32mmol/L的纯化酶和修饰酶的酶活力,用Lineweaver-Burk法[14]做图,计算纯化酶和修饰酶的Km和Vmax值。

2 结果与分析

2.1 纯化酶和修饰酶酶活力

制备的小麦酯酶液酶活力1878U/mL;右旋糖酐修饰酶酶活力210U/mL,酶活保持率为67.1%;mPEG修饰酶酶活力为780U/mL,酶活保持率为87.7%。

2.2 红外光谱表征分析

484365.jpg 

图 1 纯化酶和修饰酶的红外光谱图

Fig.1 Infrared spectra of the native and modified enzymes

由图1可知,在3418cm-1左右出现宽钝的峰为分子间氢键O—H伸缩振动和N—H伸缩振动吸收峰缔合而成,2970cm-1和2927cm-1分别为—CH3和—CH2—基团不对称震动吸收峰,1637cm-1和1403cm-1分别为酰胺的N—H弯曲振动和C—N伸缩峰,1124cm-1是胺类C—N伸缩振动吸收峰,这直接反映了小麦酯酶蛋白构象。

在右旋糖酐和mPEG修饰酶的红外图中,在3245cm-1附近出现比纯化酶较强的峰,尤其是mPEG修饰酶,这是由于修饰剂连到酶上引起羟基O—H的伸缩振动加强。2927cm-1处的峰在右旋糖酐修饰酶中加强,在mPEG修饰酶中2970cm-1峰消失减弱,可见—CH3和—CH2—基团在修饰酶中发生了细微的变化。酰胺中1637cm-1和1403cm-1在修饰酶中发生移动,且1637cm-1减弱,1403cm-1在mPEG修饰酶中加强,这表明酰胺类的N—H和C—N基团被作用。在1124cm-1处,两修饰酶均加强,说明小麦酯酶蛋白与右旋糖酐和mPEG分子间发生了较强的相互作用,可能影响了酶蛋白的C—N伸缩振动。

2.3 最适温度

487510.jpg 

图 2 纯化酶和修饰酶的最适温度

Fig.2 Optimal temperatures of the native and modified enzymes

由图2可知,随着温度的变化,经过右旋糖酐和mPEG修饰后的小麦酯酶的相对酶活力变化趋势基本相同,最适温度没有改变,依然是在35℃左右。纯化酶随着温度的升高,酶活降低速率较快,在高温70℃条件下,天然纯化酶的相对酶活力只有22.3%,而右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶可以达到43.2%和54.9%。

2.4 热稳定性

表 1 纯化酶和修饰酶的热稳定性比较

Table 1 Comparison of thermal stability between the native and modified enzymes

温度/℃

时间/min

相对酶活力/%

纯化酶

右旋糖酐修饰酶

mPEG修饰酶

45

0

100

100

100

10

92.4

94.4

90.4

30

77.1

80.8

91.7

60

71.1

75.9

88.8

120

68.4

72.1

87.5

 

 

 

 

 

55

0

100

100

100

10

88.8

92.0

90.2

30

64.7

78.3

90.4

60

56.9

71.7

87.4

120

47.3

69.2

83.6

 

 

 

 

 

65

0

100

100

100

10

83.1

88.0

89.7

30

61.2

79.7

87.7

60

51.3

74.6

82.3

120

43.5

64.8

80.9

 

 

由表1可知,修饰后的小麦酯酶和纯化酶比较,热稳定性提高。在65℃、120min后,天然酶酶活力只有原来的43.5%,而右旋糖酐修饰酶酶活力可以达到64.8%,提高了近50%,mPEG修饰酶酶活仍然有80.9%,比纯化酶提高了近1倍。这与刘恩岐等[15]使用mPEG修饰生姜蛋白酶的热稳定性不如右旋糖酐修饰酶的热稳定性有所不同。其中,mPEG修饰酶在45℃和55℃,随着时间增加,酶活力有一个小幅度的提高,可能是高温诱导了酶的某些催化特性的改变。

2.5 最适pH值

476580.jpg 

图 3 纯化酶和修饰酶的最适pH值

Fig.3 Optimal pH of the native and modified enzymes

由图3可知,在不同pH值的磷酸缓冲液中稀释反应,右旋糖酐修饰酶和纯化酶的相对酶活力变化趋势相近,两者的最适pH值为6.4没有改变,但是右旋糖酐修饰酶的相对酶活力有所提高。mPEG修饰酶的最适pH值升高至6.8左右,相对于纯化酶更趋于7.0,而相对酶活力较右旋糖酐修饰酶亦有所提高。这对小麦酯酶的生产应用提供了依据。

2.6 酸碱稳定性

484409.jpg 

图 4 纯化酶和修饰酶的酸碱稳定性

Fig.4 Acid-base stability of the native and modified enzymes

由图4可知,在不同pH值磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,修饰酶和纯化酶都表现出对酸碱的敏感性,但是相比较纯化酶,修饰酶的相对酶活力都有所提高。mPEG修饰酶表现出比纯化酶和右旋糖酐修饰酶更好的酸碱稳定性,且表现出更好的耐碱性。在pH4.0、120min处理后,纯化酶相对酶活力只有37.2%,而右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶的相对酶活力分别是61.6%和68.1%,两者耐酸性分别提高65.5%和83.0%。在pH8.0、120min处理后,右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶的相对酶活力较纯化酶分别提高33.3%和52.5%。

2.7 动力学参数

根据Lineweaver-Burk图(图5),纯化酶的双倒数方程为y=0.0014x+0.0004(R2=0.9937);右旋糖酐修饰酶的双倒数方程为y=0.0009x+0.0005(R2=0.9989);mPEG修饰酶的双倒数方程为y=0.0005x+0.0004(R2=0.998)。计算在0.2mol/L的磷酸缓冲液、pH6.38、35℃和底物为乙酸-1-萘酯的条件下纯化酶和修饰酶的KmVmax,分别得到纯化酶、右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶的Km为3.50、2.00mmol/L和1.25mmol/L,Vmax为2500、2000µg/min和2500µg/min。与纯化酶相比,两种修饰酶的Km都减小。这与应国清等[16]采用单甲氧基聚乙二醇修饰蚓激酶的结果相一致。这说明经过修饰后的小麦酯酶对底物乙酸-1-萘酯的亲和能力增强,可能酶的空间结构发生改变,影响了反应的微环境。

476615.jpg 

图 5 纯化酶和修饰酶的Lineweaver-Burk图

Fig.5 Lineweaver-Burk plot for the native and modified enzymes

3 结 论

右旋糖酐和聚乙二醇由于其无毒、反应条件温和、不与酶活性中心的基团结合、易保留酶活等优点,是目前较常用的化学修饰剂[17]。右旋糖酐修饰酶和mPEG修饰酶都保持大多数酶活,且与底物的亲和能力增强,对温度和酸碱的稳定性都表现出不同程度的提高。这主要是右旋糖酐和mPEG与酶发生交联修饰后,酶分子表面形成屏障,从而避免蛋白质结构因展开而失活,同时也抵抗了外界环境对酶活的影响[18]。在抵抗酸碱和温度的外界环境上,mPEG修饰酶比右旋糖酐修饰酶稳定性好,这可能是mPEG修饰酶被修饰后降低了酶分子自我分解率和变性率[19]。

mPEG修饰酶的最适pH值发生改变,接近中性,更适合于生产应用,这可能是酶的氨基被修饰后,影响了酶活性中心基团,使得酶学特性发生改变。在较高温度下,短时间内mPEG修饰酶的酶活力提高,其作用机理尚待探讨。综上所述,mPEG修饰酶可以更好地提高小麦酯酶酶稳定性,改变酶学特性,对小麦酯酶的生产应用具有进一步研究的潜在价值。

同时,mPEG修饰小麦酯酶仍有很多不足:mPEG修饰酶是随机的,修饰位点不确定[20],造成修饰酶修饰产物的不确定,也无法测定修饰率;实验所选定pH值范围狭窄,尤其碱性环境对修饰酶的影响没有充分展开,且修饰机理不明。进一步拓宽pH值范围,对修饰产物的定性分析和结构测定是完善mPEG对小麦酯酶修饰的下一步工作。

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收稿日期:2013-04-25

基金项目:“十二五”农村领域国家科技计划项目(2013BAD19B09);江苏省科技基础设施建设计划项目(BM2012026)

作者简介:陈铭(1986—),男,硕士研究生,研究方向为食品安全。E-mail:xiaoming_318@163.com

*通信作者:陆利霞(1972—),女,副教授,博士,研究方向为食品安全。E-mail:llxhn66@126.com