噬菌体展示技术筛选可特异结合阪崎肠杆菌的多肽 屈 玮,袁静静,朱威东,汪明明,刘 健* (合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽 合肥 230009)
摘 要:利用噬菌体展示七肽库,通过优化筛选条件,得到阪崎肠杆菌的特异结合多肽。经过4轮筛选,得到的噬菌体单克隆进行测序,用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定阳性单克隆,并评价阳性单克隆的特异性。结果表明:优化吐温-20体积分数、结合时间和洗脱时间,提高了筛选效率,有助于获得结合肽共有序列;ELISA法鉴定出一个与阪崎肠杆菌特异结合的阳性单克隆E2,编码七肽序列QNDGTPR;特异性实验结果表明:E2与其他4株参考菌株细菌没有显著结合力,具有良好的特异性。综上,利用噬菌体展示技术,可成功筛选到阪崎肠杆菌特异结合多肽QNDGTPR。 关键词:阪崎肠杆菌;噬菌体展示;特异性多肽
Screening of Enterobacter sakazakii-binding Peptides by Phage Display Technique
QU Wei,YUAN Jing-jing,ZHU Wei-dong,WANG Ming-ming,LIU Jian* (School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Abstract:In this study, we used a phage-displayed random peptide library to identify phage clones, and the displayed peptides could specifically and strongly bind to the cell surface of Enterobacter sakazakii. The capability of the phage clones to interact specifically with Enterobacter sakazakii was demonstrated by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). We assessed the selectivity of phage-bacteria binding by comparing the binding capability of the selected clones to the target bacteria and a panel of other bacterial species. Tween-20 concentration, and binding and elution time were optimized to enhance the stringency of selection or elution and to obtain a consensus binding sequence. After four rounds of screening, positive phage clone DNAs were sequenced and their specific binding activity was identified by ELISA. The affinity of the phage clones encoding QNDGTPR peptides was significantly higher than that from the control group. No phage clone significantly bound to other selected bacterial species. Overall, Enterobacter sakazakii-binding peptide QNDGTPR was screened and obtained by a random peptide library and the peptide may be used to develop novel diagnostic probes. Key words:Enterobacter sakazakii;phage display;specific peptides 中图分类号:TS201.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0217-04 doi:10.7506/spkx1002-6630-201321044 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种重要的食源性条件致病菌,研究表明其能通过污染婴儿配方奶粉而引起婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎等疾病[1-2]。2002年国际食品微生物标准委员会把阪崎肠杆菌看成是“严重危害特定人群,危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的重要食源性致病菌[3]。联合国粮农组织和世界卫生组织把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌,因为它与婴儿疾病之间有确定的因果关系[4],但是该菌的生存环境及致病机制并不是十分清楚。因此,对婴儿奶粉及制品中阪崎肠杆菌进行检测十分重要,准确及时的检测手段是预防和控制阪崎肠杆菌传播的关键。 阪崎肠杆菌传统的检测方法需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤,具有检测周期长、操作复杂、不易分辨结果等缺点,已不能适应食品中病源菌快速大批量检测的实际需要[5]。近年来,PCR法、金标试纸法、免疫法及其他特异性显色生化鉴定技术等快速检验方法,已广泛应用于阪崎肠杆菌的快速检测。Mohan等[6]通过鉴定和分子克隆阪崎肠杆菌的外膜蛋白A(ompA)基因,建立了针对该基因的PCR检测阪崎肠杆菌的方法。高旗利等针对细菌16S~23S rDNA间区序列设计特异性引物,建立了检测奶粉中阪崎肠杆菌的PCR法[7]。叶应旺等根据阪崎肠杆菌中寡-1,6-葡萄糖苷酶基因,设计引物建立的PCR方法[8]。Almeida等[9]利用荧光原位杂交(FISH) 技术,针对阪崎肠杆菌的16S rRNA设计了一条肽核酸(PNA)探针,建立了检测体系,具有很好的特异性和很高的灵敏性。杨柳等[10]建立一种免疫磁珠吸附一荧光定量PCR快速检测阪崎肠杆菌的方法,免疫磁珠对奶粉中的阪崎肠杆菌吸附率达77.7%。但是这些技术也存在一定缺陷,如需要一定的设备、技术要求高、操作复杂、检测费用也较昂贵等[11]。 噬菌体展示技术是一种非常有效的多肽高通量筛选方法[12],可以简便、有效地获得细胞特异性结合多肽,具有和抗体类似的灵敏度与专一性,同时具有成本低廉、方法简单等优势,可为微生物快速检测提供快速、准确和灵敏的检测平台[13]。近年来,噬菌体展示技术已用于多种致病菌识别多肽的高通量筛选研究,如致病芽孢杆菌孢子[14]、单增李斯特菌菌体[15]、金黄色葡萄球菌[16]等。但迄今为止,尚未见对阪崎肠杆菌特异结合肽筛选的有关研究报道。因此本实验利用噬菌体展示技术,筛选阪崎肠杆菌结合多肽,并对其特异性和结合能力进行评价。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 噬菌体展示七肽库试剂盒 美国NEB公司;阪崎肠杆菌ATCC 51329和ATCC 29544 合肥工业大学叶应旺博士惠赠;大肠杆菌(CDC85933)、金黄色葡萄球菌(ATCC6535)、副溶血性弧菌(CMCC17802)和单增李斯特菌(ATCC54003) 本实验室保存。 IPTG、X-gal、四环素 美国BBI公司;PEG8000 生工生物工程(上海)股份有限公司;HRP-抗M13单克隆抗体 美国GE公司;ABTS 美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备 ZHWY-211B 型恒温摇床 上海智诚公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;CT14RD型冷冻离心机 天美科技有限公司;Biophotometer Plus型紫外分光光度计 德国Eppendorf公司;MK3型酶联免疫检测仪 美国Thermo公司。 1.3 方法 1.3.1 阪崎肠杆菌制备 将阪崎肠杆菌标准株转接至LB液体培养基中,37℃培养过夜;5000r/min离心10min,收集细胞置冰上,使用TBST(含体积分数0.01%吐温-20)洗涤2次,重悬在TBST中,稀释菌体OD600nm至1。 1.3.2 不同吐温-20体积分数对噬菌体筛选结果的影响 取100μL阪崎肠杆菌稀释菌液与20μL噬菌体肽库,加入1.5mL离心管中,再加入TBST至体积为500μL,在冰上摇床上孵育2h;然后16000r/min离心5min,去除上清收集菌体,再分别使用含不同吐温-20体积分数(0.01%、0.05%、0.2%、0.4%)的TBST溶液洗涤菌液并离心收集,重复10次,以去除未结合的噬菌体;然后加入非特异性洗脱缓冲液0.2mol/L甘氨酸-HCl(pH2.2),洗脱收集特异结合的噬菌体。筛选得到的筛选液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal 1.3.3 不同结合时间对噬菌体筛选结果的影响 取100μL阪崎肠杆菌稀释菌液与20μL噬菌体肽库,加入1.5mL离心管中,再加入TBST至体积为500μL,分别在冰上摇床上孵育1、2、3、4h;然后16000r/min离心5min,去除上清收集菌体,并使用TBST重悬洗涤离心10次,去除未结合的噬菌体;然后加入非特异性洗脱缓冲液0.2mol/L甘氨酸-HCl(pH2.2),洗脱收集特异结合的噬菌体。筛选得到的筛选液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal平板培养测定噬菌体滴度,并计算菌体回收量。 1.3.4 不同洗脱时间对噬菌体筛选结果的影响 取100μL阪崎肠杆菌稀释菌液与20μL噬菌体肽库,加入1.5mL离心管中,再加入TBST至体积为500μL,在冰上摇床上孵育2h;然后16000r/min离心5min,去除上清收集菌体,并重悬洗涤离心10次,去除未结合的噬菌体;然后加入非特异性洗脱缓冲液0.2mol/L甘氨酸-HCl(pH 2.2),分别洗脱2、4、6、8min,然后收集特异结合的噬菌体。筛选得到的筛选液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal平板培养测定噬菌体滴度,并计算菌体回收量。 1.3.5 特异结合噬菌体的筛选 取100μL阪崎肠杆菌稀释菌液与20μL噬菌体肽库,加入1.5mL离心管中,再加入TBST至体积为500μL,在冰上摇床上孵育2h;然后16000r/min离心5min,去除上清收集菌体,并重悬洗涤离心10次,去除未结合的噬菌体;然后加入非特异性洗脱缓冲液0.2mol/L甘氨酸-HCl (pH 2.2),洗脱收集特异结合的噬菌体。同上重复筛选3次,每轮筛选逐轮降低阪崎肠杆菌用量(80、60、40μL),同时增加TBST液体中吐温-20(0.05%、0.2%和0.4%),并改变结合时间和洗脱时间,以获得高亲和力噬菌体。各轮筛选得到的筛选液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal平板培养测定噬菌体滴度,并计算菌体回收量。 1.3.6 噬菌体单克隆DNA提取及测序分析 从第4轮筛选后的噬菌体滴度测定平板(噬菌斑总量不超过100个)中,随机挑选10个单噬菌斑,进行扩增培养,使用PEG8000/NaCl纯化噬菌体单克隆,NaI溶液抽提噬菌体单链DNA。用96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’),送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,采用DNAman软件分析测序结果。 1.3.7 ELISA法体外鉴定目标噬菌体阳性克隆 将100μL的阪崎肠杆菌稀释液加入96孔ELISA板中包被过夜,使用TBST洗涤10次,然后使用BSA封闭1h。将测序的10个噬菌体单克隆(1012PFU/mL)分别加入ELISA板,室温振荡作用1h,然后使用TBST洗涤6次,然后加入HRP标记的抗-M13抗体稀释液(1:5000),室温振荡作用1h;TBST洗涤6次;加入ABTS作为底物显色,室温作用30min;于检测步骤前加入30%的H2O2终止反应;用酶标仪于405nm波长处测定。以实验组光密度(OD405nm)值高于阴性对照组(原噬菌体库)2倍以上为阳性克隆。 1.3.8 ELISA法体外鉴定目标噬菌体特异性 利用酶联免疫吸附实验,检测噬菌体阳性克隆,对阪崎肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌的吸附能力大小。 2 结果与分析 2.1 不同体积分数吐温-20对筛选结果的影响 以阪崎肠杆菌ATCC 51329为筛选靶菌株,进行亲和筛选,比较TBST溶液中不同体积分数吐温-20对富集效果的影响,投入的噬菌体量和回收量(回收噬菌体/投入噬菌体比值)见表1,随着吐温-20体积分数增大,噬菌体回收量不断降低,由1.4×10-6(0.01%吐温-20)减少为5.1×10-9(0.4%吐温-20),而且噬菌体产出率明显减少。所以首轮筛选使用0.01%吐温-20,以增加噬菌体回收量,保持噬菌体肽库的多样性;然后其余3轮逐渐增加吐温-20体积分数(分别使用0.05%、0.2%和0.4%)来逐步提高选择的严格性。 表 1 TBST中不同体积分数吐温-20对噬菌体筛选效果的影响 Table 1 Effect of Tween-20 concentration on the stringency of selection during bio-scanning against Enterobacter sakazakii
2.2 不同结合时间对筛选结果的影响 表 2 不同结合时间对噬菌体筛选效果的影响 Table 2 Effect of binding time on the stringency of selection during bio-scanning against Enterobacter sakazakii
以阪崎肠杆菌ATCC 51329为筛选靶菌株,进行亲和筛选,比较噬菌体肽库和靶细菌的孵育结合时间对富集效果的影响,投入的噬菌体量和回收量见表2,随着结合时间的延长,噬菌体回收量和产出率逐步提高,但是结合从2~4h产出率变化较小。所以前两轮筛选结合时间选择2h,以提高噬菌体回收量;后两轮筛选结合时间选择1h,以提高筛选的严格度。 2.3 不同洗脱时间对筛选结果的影响 以阪崎肠杆菌ATCC 51329为筛选靶菌株,比较非特异性洗脱缓冲液0.2mol/L甘氨酸-HCl(pH2.2)洗脱时间对筛选结果的影响,投入的噬菌体量和回收量见表3,随着洗脱时间延长,噬菌体回收量不断降低, 噬菌体产出率明显减少。所以前两轮洗脱时间选择2min,以增加噬菌体回收量;后两轮洗脱时间选择6min,以提高选择的严格性。 表 3 不同洗脱时间对噬菌体筛选效果的影响 Table 3 Effect of elution time on the stringency of selection during bio-scanning against Enterobacter sakazakii
2.4 噬菌体随机肽库的筛选及富集 以阪崎肠杆菌ATCC 51329和ATCC 29544为筛选靶菌株,进行4轮亲和筛选,每轮投入的噬菌体量和收获量见表4。筛选结果表明噬菌体在阪崎肠杆菌ATCC 51329上出现明显富集,噬菌体回收量逐步提高,末轮回收量高于第1轮8000多倍。阪崎肠杆菌ATCC 29544结果类似。 表 4 阪崎肠杆菌4轮生物淘选的富集效应 Table 4 Selective enrichment of phages through 4 rounds of bio-scanning against Enterobacter sakazak
2.5 噬菌体克隆的DNA序列测定和分析 表 5 结合克隆的DNA序列和多肽序列 Table 5 Peptide sequences that bind to Enterobacter sakazakii
以阪崎肠杆菌为靶菌株,经4轮筛选后,随机挑取10个蓝色噬菌斑,进行扩增,提取ssDNA,进行DNA序列测定,再根据七肽库的精简遗传密码表推导出氨基酸序列。由表5测序分析结果表明,阪崎肠杆菌ATCC 51329获得两个不同序列,其中一个序列(QNDGTPR)出现于9个单克隆中,为优势序列;阪崎肠杆菌ATCC 29544获得3个不同序列,其中一个序列(QNDGTPR)出现于8个单克隆中。因此,QNDGTPR为两种菌种共有优势序列。 2.6 ELISA检测筛选的噬菌体展示多肽对靶细胞的亲和力
E1、E2和E3为噬菌体单克隆,M13噬菌体为对照组;*.与阴性对照相比差异显著(P<0.05);**.与阴性对照相比差异极显著(P<0.01)。 图 1 ELISA测定噬菌体单克隆与阪崎肠杆菌的亲和力 Fig.1 ELISA results of bacteria-binding by representative phage clones 由图1中ELISA结果显示,含上述3种多肽序列的噬菌体单克隆,都具有与阪崎肠杆菌较强的亲和力,其中编码E2序列(QNDGTPR)的噬菌体结合能力更强,达到极显著差异,因此选择编码E2序列的阳性噬菌体克隆进行进一步研究。 2.7 ELISA检测筛选E2多肽特异性
阪崎肠杆菌(A)是ATCC 51329菌株,阪崎肠杆菌(B)是ATCC 29544菌株;**.与阴性对照相比差异极显著(P<0.01)。 图 2 噬菌体单克隆E2的特异性评价 Fig.2 Selectivity of phage E2 as determined by ELISA 对ELISA进行分析,图2显示噬菌体单克隆E2对两株阪崎肠杆菌均具有较好的结合特异性,而与副溶血性弧菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌没有显著结合力。 3 讨 论 本实验中采用的噬菌体展示技术是一种高效的多肽高通量筛选方法[12],通过该方法筛选到的多肽可作为微生物检测的探针,适合微生物的快速高通量检测[14]。筛选高亲和力和高特异性多肽是进行噬菌体展示技术的核心步骤。本研究针对两株阪崎肠杆菌,通过优化洗涤溶液TBST中吐温-20体积分数、结合时间和洗脱时间,成功筛选到高亲和力和高特异性的E2多肽序列。通过逐轮逐轮增加吐温-20的体积分数、缩短结合时间和延长洗脱时间的方式,解决了初始筛选时回收率过低的问题,保证回收噬菌体的多样性;在筛选后期提高筛选的严格度,以获得结合肽共有序列。通过以上措施,筛选到的E2序列具有良好的特异性,能以较强的亲和力与靶细菌结合,而与大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌结合力较弱。 阪崎肠杆菌实际上至少包括6个基因种,并且均被认为有致病性[17]。但由于该菌遗传的多样性和分类的复杂性,尚未找到所有菌株共有的保守序列并建立合适的分子检测方法。本研究中,阪崎肠杆菌ATCC 51329属于Cronobacter muytjensii sp. nov.,阪崎肠杆菌ATCC 29544属于Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. nov.[17],其他种的阪崎肠杆菌的特异结合多肽,有待于进一步的研究。 因此本研究筛选出的多肽具有高亲和力和高特异性,具有成为新颖阪崎肠杆菌检测探针的潜力,可用于阪崎肠杆菌的前期富集或快速检测。 参考文献: [1] JOSHOA B G, JEFFREY L K, LARRY R B. Enterobacter sakazakii: a coliform of increased concern to infant health[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 104(1): 1-34. [2] 王翔, 祝长青, 徐幸莲, 等. 阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展[J]. 食品科学, 2011, 32(13): 350-354. [3] ICMSF. Microbiological testing in food safety management: volume 7[R]. New York: Academic/Plenum Publishers, 2002. [4] BIERING G, KARLSSON S, CLARK N V C, et al. Three cases of neonatal meningitis caused by Enterobacter sakazakii in powdered milk[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1989, 27(9): 2054-2056. [5] 杨万颖, 祝仁发, 李传礼, 等. 婴儿食品中阪崎肠杆菌检测方法的改进[J]. 检验检疫科学, 2008, 18(2): 39-42. [6] MOHAN NAIR K M, VENKITANARAYANAN K S. Cloning and sequencing of the ompA gene of Enterobacter sakazakii and development of an ompA-targeted PCR for rapid detection of Enterobacter sakazakii in infant formula[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(4): 2539-2546. [7] 高旗利, 张霞, 罗茂凰, 等. 奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究[J]. 检验检疫科学, 2005, 15(4): 3-8. [8] 叶应旺, 吴清平, 郭伟鹏, 等. PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(3): 422-424; 467. [9] ALMEIDA C, AZEVEDO N F, IVERSEN C, et al. Development and application of a novel peptide nucleic acid probe for the specific detection of Cronobacter genomospecies (Enterobacter sakazakii) in powdered infant formula[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(9): 2925-2930. [10] 杨柳, 苏明权, 马越云, 等. 免疫磁珠与荧光定量PCR联合检测乳制品中阪崎肠杆菌的实验研究[J]. 现代预防医学, 2011, 38(6): 1086-1089. [11] 封莉, 黄继超, 刘欣, 等. 食源性致病菌快速检测技术研究进展[J]. 食品科学, 2012, 33(21): 332-339. [12] SMITH G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228: 1315-1317. [13] SINGH A, POSHTIBAN S, EVOY S. Recent advances in bacteriophage based biosensors for food-borne pathogen detection[J]. Sensors, 2013, 13(2): 1763-1786. [14] LUSVARGHI S, KIM J M, CREEGER Y, et al. Refined multivalent display of bacterial spore-binding peptides[J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2009, 9(7): 1815-1820. [15] NANDURI V, BHUNIA A K, TU S I, et al. SPR biosensor for the detection of L. monocytogenes using phage-displayed antibody[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 23(2): 248-252. [16] RAO S S, MOHAN K V, GAO Y, et al.Identification and evaluation of a novel peptide binding to the cell surface of Staphylococcus aureus[J]. Microbiological Research, 2013, 168(2): 106-112. [17] IVERSEN C, MULLANE N, MCCARDELL B, et al. Cronobacter gen. nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov., comb.nov., Cronobacter malonaticus sp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov., Cronobacter genomospecies 1, and of three subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov., Cronobacter dublinensis subsp. Lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov.[J]. International Jouranl of Systematic and Evolutonary Microbiology, 2008, 58(6): 1442-1447. 收稿日期:2012-11-27 基金项目:教育部高等学校博士点新教师类专项科研基金项目(20110111120025);安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2011A214) 作者简介:屈玮(1979—),男,讲师,博士,研究方向为功能性食品。E-mail:quweiok@126.com *通信作者:刘健(1970—),男,研究员,博士,研究方向为分子营养学。E-mail:liujian509@gmail.com
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