基于不同PLS算法的方竹笋中蛋白质分析的
近红外光谱特征波段选择

黄 维1，田丰玲2，刘振尧2，杨 琼3，赵小辉3，杨季冬1,2,3,*

(1.西南大学化学化工学院，重庆 400715；2.长江师范学院化学化工学院，重庆 408100；

3.重庆三峡学院化学与环境工程学院，重庆 404000)

摘 要：利用近红外光谱法对金佛山方竹笋的蛋白质分析，采用间隔偏最小二乘法(PLS)与反向间隔偏最小二乘法(BiPLS)，实现蛋白质光谱特征波段选择。将全波段分划分为12与17个波段，对全波段和每个小波段分别用PLS回归建模，然后优化组合各个区间，建立BiPLS模型，用交互验证均方差(RMSECV)与预测均方差(RMSEP)对模型进行评价。结果表明：iPLS与 BiPLS的效果均优于基于全波段的PLS模型，尤以BiPLS模型效果最佳。当间隔数为12时，所选特征波段5、3、6、12、4、2、11建立的模型效果最佳，其交互验证均方差RMSECV与预测均方差RMSEP分别为0.321%、0.218%。该方法快速无损，有效地减少建模的变量数，使模型预测精度得到提高。

关键词：近红外光谱；蛋白质；方竹笋；间隔偏最小二乘法；反向区间偏最小二乘法；波段优选

Wavelength Selection for FT-NIR Spectroscopic Analysis of Protein in Chimonobambusa quadrangularis Shoot Based on iPLS and BiPLS Models

HUANG Wei1，TIAN Feng-ling2，LIU Zhen-yao2，YANG Qiong3，ZHAO Xiao-hui3，YANG Ji-dong1,2,3,*

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China；

2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China；

3. College of Chemistry and Environmental Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404000, China)

Abstract：Objective: To select the characteristic wavelength bands for non-destructive analysis of proteins in Chimonobambusa quadrangularis shoot by FT-NIR spectroscopy combined with interval partial least squares (iPLS) and backward interval partial least squares (BiPLS). Methods: The full wavelength range was divided into 12 or 17 bands. PLS models were developed based on the full wavelength range or on each band and then BiPLS models were built by optimized combinations of various intervals. The models were evaluated by the mean square error of cross validation (RMSECV) and root mean square error of prediction (RMSEP). Results: The iPLS and BiPLS models were both more effective than the PLS models based on the full wavelength range and the BiPLS model was the best one. When 12 intervals were adopted, the combination of 7 ([5, 3, 6, 12, 4, 2 and 11]) spectral intervals provided the best model showing a 0.321% RMSECV and a 0.218% RMSEP. The proposed method allowed rapid and non-destructive determination of proteins with less variables used in the modeling and thus improved prediction accuracy.

Key words：near infrared spectroscopy；protein；Chimonobambusa quadrangularis；interval partial least squares；backward interval partial least squares；wavelength selection

中图分类号：O657.39 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0133-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322027

重庆南川金佛山盛产方竹笋(Chimonobambusa quadrangularis (Fenzi) Makino)为禾本科竹亚科寒竹属植物，其营养成分丰富，含蛋白质4.32%、脂肪0.15%、粗纤维1.5%、总糖1.24%，还有钙、磷、铁、锌、硒等元素及VB1、VB2、VC及18种氨基酸，是一种高蛋白、低脂肪的绿色食品[1]。近年发现，金佛山方竹笋内含多糖物质具有抗癌作用，能抑制亚硝胺的产生，对肠癌、食道癌和高血压等具有一定疗效，被誉为“竹类之冠”、“笋中之王”，2008年成为国家地理标志产品[2]。

人体必需的赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸，以及在蛋白质代谢过程中占有重要地位的谷氨酸和有维持蛋白质构型作用的胱氨酸，在方竹笋中都有一定的含量。蛋白质含量为方竹笋中一项重要的营养品质指标。传统的测定食品中蛋白质含量的法定方法为凯氏定氮法[3]、双缩脲法、Lowry法、紫外分光光度法、甲醛滴定法、电流法[4-5]等。但这些方法都须对方竹笋作破坏性的前处理，而且操作繁琐，需要消耗化学试剂，难以实现在线实时检测。因此，建立一种快速无损检测方竹中的蛋白质方法具有重要意义。近红外漫反射光谱技术由于其快速、无破坏性、无污染等优点，被广泛地应用于定性、定量测量中，并且可以实现在线实时检测和无损检测[6-7]。近红外光谱分析技术在食品[8]、制药业、纺织业、石油以及烟草行业等得到广泛应用。Svenssona等[9]在全谱范围内用偏最小二乘法建立了腌制鲱鱼中蛋白质含量与近红外光谱间的模型，其相关系数为0.93，交互验证均方根偏差0.25g/100g；Schönbrodt等[10]在800～1666nm范围内用偏最小二乘(partial least square，PLS)法建立了油脂埋植剂中释放的蛋白质含量，其预测标准偏差为57～176μg；朱向荣等[11]采用近红外光谱法结合化学计量学法测定液态奶中蛋白质和脂肪的含量，蛋白质模型的交互验证均方差(root mean square error of cross validation，RMSECV)与预测均方差(root mean square error of prediction，RMSEP)分别为2.270和2.564。而利用近红外光谱法进行快速无损分析测定方竹笋中的蛋白质含量尚未见报道。

在传统的近红外光谱建模方法中，为了不丢失光谱中的任何目标信息，往往利用全谱建模[12]。但实验证明，这样的模型复杂费时[13]，因测试样本通常是多组分的混合物，近红外光谱吸收常常掺杂着非目标组分的吸收，或有时干扰目标组分的微弱吸收，导致某些波段的样本光谱与样本组分性质之间的关联性较差，出现波段冗余的现象，当然也还有其他诸多原因不能很好地提供样本的组成信息[14]。若选取这样的波段建模，不仅影响光谱灵敏度，而且影响校正模型的准确度，因此建模型前进行特征波段选择是十分必要的，近年在化学计量学领域，对PLS方法进行了发展改进，先后发展了间隔偏最小二乘(interval partial least square，iPLS)法、移动窗口偏最小二乘算(moving windows partial least squares，MWPLS)法、组合间隔偏最小二乘法(synergy interval partial least squares，SiPLS)法、后向间隔偏最小二乘(backward interval partial least squares，BiPLS)法等建模方法，这些方法的优势在不同领域得到应用[15-17]。本研究拟对金佛山方竹笋的营养品质成分——蛋白质中的总氨基酸进行快速无损分析，提出一种基于iPLS的蛋白质近红外光谱区选择方法，尽可能选择灵敏度较高的波段，以简化模型、提高模型精度，同时在iPLS的基础上应用BiPLS将多个被选中信息区间进行组合并建立优化模型，以期为竹笋中蛋白质的开发利用提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

方竹笋产自重庆南川。

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、氢氧化钠、乙醇(95%)均为分析纯。

VECTOR 22/N傅里叶变换近红外光谱仪(配有PbS检测器、漫反射积分球附件，附带OPUS 5.0光谱软件) 德国Bruker公司；EL104分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；XT-200高速多功能粉碎机 宁波科莱尔有限公司；KDN-O8C自动凯氏定氮仪 上海仪电科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 近红外光谱的采集

方竹笋中蛋白质含量根据GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》[3]中凯氏定氮法测得。根据标准要求在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对误差依次不得超过算术平均值的5%、2%。以上测定均重复测定2次，测定过程中所得数据超过标准要求精度的重新进行测定，有效测定结果作为建模的数据。

采集光谱时，将烘干的方竹笋样品粉碎并均匀地装入近红外光谱仪附带的10cm石英样品杯内，利用近红外光谱仪的旋转器使其匀速转动，用积分球漫反射采样系统采集样本近红外光谱。以空气为参比，扫描范围800～2500nm(即12500～4000cm-1)，扫描64次，分辨率4cm-1。每个样品扫描2次。

1.2.2 应用不同iPLS选择最佳波段

1.2.2.1 iPLS

iPLS是Nørgaarda等[18-19]在2000年提出的一种算法，其原理是首先将整个光谱机械的分割成若干个等宽子区间，然后在每个子区间进行偏最小二乘法回归，建立待测的局部回归模型。采用留一法交互验证(leave-one-out cross validation，LOO-CV)计算RMSECV，分别比较各局部模型的精度，当RMSECV值最小，表明该子区间为最佳建模区间。iPLS算法步骤如下：1)采用中心化、自动化等预处理方法对原始光谱进行预处理；2)确定全谱区范围内建模的最佳主成分数；3)通过iPLS算法将整个光谱区域划分为n个等宽的子区间；4)在每个子区间上进行PLS回归，建立蛋白质的“局部回归模型”，即可得到n个局部回归模型；5)以RMSECV值为各模型的精度衡量标准，分别比较全谱模型和各局部模型的精度，取精度最高的局部模型所在的子区间为入选区间；6)为了得到更准确的波段，将光谱区域重新分区，重复以上3)、4)、5)的步骤，比较不同分区的入选区间建模的效果，从而确定最佳区间；7)在最佳区间进行内PLS回归，建立最优预测模型。

1.2.2.2 BiPLS

BiPLS是在iPLS的基础上，依次减少信息量最差或共线性变量最多的i(i = 0，1，2…k)个区间，即去除1个区间，在剩余的k～i个区间上建立最优PLS模型，直到剩下最后1个区间为止，并给出相应的RMSECV值。每次去除的区间是当该区间被去除之后建立的模型所得到的RMSECV最小。例如，将整个光谱分为17个区间，去除一个区间，剩下的16个区间上建立PLS模型，模型的RMSECV值最大的即为首先去除的区间。当 RMSECV最小时模型的效果最佳[20]。

2 结果与分析

2.1 光谱常规分析与光谱预处理方法

图 1 方竹笋近红外原始光谱图

Fig.1 Near-infrared spectra of Chimonobambusa quadrangularis shoot

由图1可以看出，校正集样本吸收光谱图重叠严重，含量不同的样本的近红外光谱十分接近，无法直接判定蛋白质的含量与个别波长处的吸收强度之间的相关性，不可能从某一个波长点来确定其含量，而必须在一定的区间内建立数学模型来确定近红外光谱和含量间的关系。图1中800～1250nm区间处于C—H等键的多级倍频区，信号弱，噪音干扰大。而1250～2500nm区间，则是C—H键和O—H 键的一级倍频和组合频区，信号强，能反映出样品的性质和组成间有关联。据文献[21]报道，蛋白质N—H键基频的二级倍频为近红外区域的1034nm 附近的吸收峰，2050～2180nm对应于蛋白肽键的吸收。实际建模过程中，应根据不同基团的吸收将光谱数据分段建立校正模型，从而找到方竹笋中蛋白质的最佳建模区域。

本实验采用并比较了消除常量偏移、矢量归一化、多元散射校正以及一阶和二阶导数5种预处理方法，此5种预处理方法对金佛山方竹笋中蛋白质的校正模型效果不同，其中采用消除常量偏移处理所得模型效果最佳。因此，本实验优先采用的是消除常量偏移。

2.2 校正集与预测集划分

表 1 校正集和预测集样品标准值统计表

Table 1 Statistics of protein content measured by the standard destructive method for the calibration and prediction sets of Chimonobambusa quadrangularis shoot

本实验首先采用消除偏移常量对光谱异常的样品进行剔除，共剔除了10个样品，参与建模的蛋白质样品数为142个。根据浓度范围和分布均匀的原则，对剔除蛋白质异常样品后剩余的142个蛋白质样品进行分类，确定校正样品(112个)和验证样品(30个)的集合。由表1可知，样品中定标集化学值范围为11.65～17.66%，平均值为15.16%；预测集化学值范围为11.98～17.35%，平均值为15.04%。

2.3 模型特征波段选择

为得到稳健的校正模型，以RMSECV、RMSEP以及相关系数R作为模型的精确度衡量标准，以选取最优的建模参数以及检验PLS校正模型。

2.3.1 PLS模型

在运用PLS算法中，PLS主因子数尤为重要，若选取的主成分数太少，将会丢失原始光谱较多的有用信息，拟合不充分；若选取的主成分数太多，会出现过拟合现象，所建模型的预测误差会显著增大[6]。本实验采用交互验证方法来选取最佳的主成分数，RMSECV值越小，说明模型的预测能力越好。

图 2 不同主成分数对应的RMSECV直方图

Fig.2 RMSECV bar plot as a function of the number of PLS factors for determining protein base on full wavelength spectrum

由图2可知，RMSECV先随着主成分数的增加而逐渐减小，然后随着主成分数的增加而增加，当主成分数为8时，PLS模型具有最小的RMSECV，模型效果最佳。当主成分数大于8时，出现过拟合现象的可能性增大，因此，本实验将最大主成分数设置为8。PLS模型的结果如表2所示，其RMSECV=0.47%，校正集与验证集的相关系数分别为Rc=93.93，Rp=95.7。在以下的研究中，各个PLS模型的主成分数均不大于8。

表 2 17个区间数的 BiPLS优化结果

Table 2 Selection of the most ef?cient interval regions by BiPLS for prediction of protein with 17 intervals

2.3.2 iPLS模型

对原始光谱采用中心化预处理后，确定全波段(800～2500nm，共850个数据点)的最佳主成分数，随后采用iPLS首先将全波段划分为12、17个区间，各个区间优化结果如图3所示。

横坐标上方数字(3、4、5、6、7、8)表示该分区建模时的最佳主成分数；虚线表示采用全波段建模时的RMSECV。

图 3 iPLS优化12个区间(a)和17个区间(b)结果图

Fig.3 Histogram of iPLS prediction results with 12 intervals (a) and
17 intervals (b), respectively

由图3a可知，区间数为12时，蛋白质在2、9、11、12区间的RMSECV均在虚线以上，最小RMSECV为0.33%，其最佳主成分数、RMSEP、Rc、Rp分别为7、0.337%、97.07、96.94，对应波段为800～950nm。由图3b可知，区间数为17时，蛋白质在1、2、4、7、8、11、12、13、14、15、16、17区间的RMSECV均在虚线以上，最小的RMSECV为0.432%，对应波段为1000～1100nm，其最佳主成分数、RMSEP、Rc、Rp分别为5、0.675%、94.5、87.77。

2.3.3 BiPLS模型

在上述iPLS的基础上，以17个区间数的iPLS建立BiPLS模型。首先去除RMSECV最大的区间1，在剩余的16个区间上建立最优模型，重复上述步骤，直到只剩下1个区间(区间3)。结果如表2所示。随着不断剔除区间，模型的RMSECV值先减小，然后增加。如表2第9行所示，根据RMSECV值，当剩下10个区间数时，PLS模型的结果最佳。所选区间为 7、16、14、17、13、5、12、4、6、2，其最佳成分数、RMSECV、Rc、Rp、RMSEP分别为7，0.332%，97.02，97.53，0.303%。如表2第5行所示，根据其RMSEP，最佳PLS模型由13个区间组合建立，所选区间为8、10、9、7、16、14、17、13、5、12、4、6、2，其最佳成分数、RMSECV、Rc、Rp、RMSEP分别为7、0.354、96.43、98.55、0.226。重复上述步骤，如表3所示，以12个区间数建立模型，当剩下7个区间数时，PLS模型的结果最佳。所选的区间为5、3、6、12、4、2、11，其最佳成分数、RMSECV、Rc、Rp、RMSEP分别为7、0.321%、97.04、98.76、0.218%。

表 3 12个区间数的 BiPLS优化结果

Table 3 Selection of the most ef?cient interval regions by BiPLS for prediction of protein with 12 intervals

3 结 论

在方竹笋蛋白质近红外光谱分析过程中，进行特征波段选择是十分必要的。iPLS模型的效果优于基于全波段的PLS模型，虽然iPLS方法简便、可视化、运算量小，可以很快找到特征波长区间，但是只能在1个子区间内建模，没有考虑到多个区间的组合，会遗失某些在其他区间的有效信息[22-23]。而BiPLS是在iPLS的基础上选择特征区间建立模型，能够检测并避免将信息微弱的区域建立模型，同时选择相关性较大的区域建立模型，因此相对PLS与iPLS，BiPLS能更好地选择化学信号强的光谱区域建立模型[24-25]。本实验基于12个区间中由5、3、6、12、4、2、11波段组合优化得到最佳模型，其RMSEP为0.218%。通过BiPLS对方竹笋中蛋白质特征吸收波段选择，不仅可以得到精度更高的预测模型，而且还可以为市场上干方竹笋的收购提供在线检测的理论依据。

参考文献：

[1] 王莉, 付甫永. 金佛山方竹笋的生物学特性及采收加工技术[J]. 贮藏与加工, 2008(11): 64-66.

[2] 王中伦, 李明, 梁蔚. 重庆市南川方竹笋获国家地理标志产品保护[J]. 世界竹藤通讯, 2009, 7(1): 40-41.

[3] GB/T 5009.5—2010 食品中蛋白质的测定[S].

[4] 陈鸿琪. 蛋白质定量分析的进展[J]. 理化检验: 化学分册, 2000, 36(7): 333.

[5] 谢平会, 杨征武, 祝丽玲. 电流法快速测定鲜奶中蛋白质[J]. 中国乳品工业, 2000, 28(4): 33-35.

[6] 陆婉珍. 现代近红外光谱分析技术[M]. 2版. 北京: 中国石化出版社, 2006: 1-44.

[7] BLANCO M, VILLARROYA I. NIR spectroscopy: a rapid-response analytical tool[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2002, 21(4): 240-250.

[8] 韩东海, 鲁超, 刘毅, 等. 生鲜乳中还原乳的近红外光谱法鉴别[J]. 光谱学与光谱分析, 2007, 27(3): 465-468.

[9] SVENSSONA V T, NIELSEN H H, BRO R, et al. Determination of the protein content in brine from salted herring using near-infrared spectroscopy[J]. Lebensm-Wiss u-Technol, 2004, 37: 803-809.

[10] SCHÖNBRODT T, MOHL S, WINTER G, et al. NIR spectroscopy: a non-destructive analytical tool for protein quantification within lipid implants[J]. Journal of Controlled Release 2006, 114: 261-267.

[11] 朱向荣, 单杨, 李高阳, 等. 近红外光谱法快速测定液态奶中蛋白质和脂肪含量[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 191-195.

[12] BLANCO M, COELLO H, ITURRIAGA J, et al. NIR calibration in non-linear systems: different PLS approaches and arti?cial neural networks[J]. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2000, 50: 75-82.

[13] SOROL N, ARANCIBIA E, BORTOLATO S A, et al. Visible/near infrared-partial least-squares analysis of brix in sugar cane juice: a test ?eld for variable selection methods[J]. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2010, 102(2): 100-109.

[14] 王立琦, 张礼勇, 江连洲, 等. 基于iPLS的油脂过氧化值近红外光谱特征波段选择[J]. 食品科学, 2011, 32(9): 97-100.

[15] BALABINA R M, SMIMOV S V. Variable selection in near-infrared spectroscopy: benchmarking of feature selection methods on biodiesel data[J]. Analytica Chimica Acta, 2011, 692(1/2): 63-72.

[16] DYRBY M, PETERSEN R V, NLARSEN J, et al. Towards on-line monitoring of the composition of commercial carrageenan powders[J]. Carbohydrate Polymers, 2004, 57(3): 337-348.

[17] SHETTY N, GISLUM R, JENSENM A M D, et al. Development of NIR calibration models to assess year-to-year variation in tota non-structural carbohydrates in grasses using PLSR[J]. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2012, 111(1): 34-38.

[18] NØRGAARDA L, SAUDLAND A, WAGNE J, et al. Interval partial least squares regression (iPLS): a comparative chemometric study with an example from near-infrared spectroscopy[J]. Applied Spectroscopy, 2000, 54(3): 413-419.

[19] NØRGAARDA L, HAHNA M T, KNUDSEN L B, et al. Multivariate near-infrared and Raman spectroscopic quanti?cations of the crystallinity of lactose in whey permeate powder[J]. International Dairy Journal, 2005, 15(12): 1261-1270.

[20] ZOU Xiaobo, ZHAO Jiewen, LI Yanxiao. Selection of the ef?cient wavelength regions in FT-NIR spectroscopy for determination of SSC of ‘Fuji’ apple based on BiPLS and FiPLS models[J]. Vibrational Spectroscopy, 2007, 44(2): 220-227.

[21] 王云, 徐可欣, 常敏. 近红外光谱技术检测牛奶中脂肪及蛋白质含量校正模型的建立[J]. 光学仪器, 2006, 28(3): 3-7.

[22] CHEN Quansheng, JIANG Pei, ZHAO Jiewen. Measurement of total ?avone content in snow lotus (Saussurea involucrate) using near infrared spectroscopy combined with interval PLS and genetic algorithm[J]. Spectrochimica Acta Part A, 2010, 76(1): 50-55.

[23] 王加华, 李鹏飞, 韩东海, 等. 基于iPLS 原理最优化信息区间的桃糖度组合权重PLS模型研究[J]. 红外与毫米波学报, 2009, 28(5): 386-391.

[24] LEARDI R, NØRGAARDA L. Sequential application of backward interval partial least squares and genetic of relevant spectral regions[J]. Journal of Chemometrics, 2004, 18(11): 486-497.

[25] 蔡健荣, 汤明杰, 吕强, 等. 基于SiPLS的猕猴桃糖度近红外光谱检测[J]. 食品科学, 2009, 30(4): 250-253.