黄参多糖提取工艺参数优化

罗光宏1，李金燕2，叶生宝2，苏凤贤3,*，王海蓉2

(1.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000；

2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；3.温州科技职业学院，浙江 温州 325006)

摘 要：以水提醇沉法提取黄参多糖，用硫酸-苯酚比色法测定黄参多糖含量。通过单因素试验和Box-Behnken试验，对黄参多糖提取工艺参数进行优化。结果表明：黄参多糖的最佳提取工艺为料液比1:26.7(g/mL)、浸提温度90℃、浸提时间67min、浸提2次，在此条件下，多糖得率为3.41%。

关键词：黄参；多糖；参数优化；响应面分析

Optimization of Process Parameters for the Extraction of Polysaccharides from Sphallerocarpus gracilis Roots

LUO Guang-hong1，LI Jin-yan2，YE Sheng-bao2，SU Feng-xian3,*，WANG Hai-rong2

(1. Gansu Engineering Research Center for Microalgae, Kai-yuan Bio-tech Development Center, Hexi University, Zhangye 734000, China；

2. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China；

3. Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China)

Abstract：Polysaccharides from the roots of Sphallerocarpus gracilis were extracted into water and precipitated with ethanol, and then determined by the sulfuric acid-phenol method. One-factor-at-a-time and Box-Behnken experimental designs were used to obtain the optimal extraction parameters for polysaccharides. Analysis of variance showed that solid-to-liquid ratio and extraction time as well as the quadratic terms of all four response factors tested had a significant effect on the yield of polysaccharides. A regression equation with a correlation coefficient of 94.57% was established, which could fit the experimental data at a 94.57% confidence interval showing the reliability of the predictive model. Using ridge analysis, the optimal extraction parameters of polysaccharide were obtained as follows: extraction temperature of 90 ℃, extraction duration of 67 min, solid-toliquid ratio of 1:26.7 and 2 repeated cycles of extraction. Under these conditions, the yield of polysaccharides was 3.41%.

Key words：Sphallerocarpus gracilis；polysaccharide；parameter optimization；response surface methodology

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0040-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324008

多糖是一类具有多种生物活性功能的高分子化合物，Lu Xinshan等[1]研究了从黄山毛峰绿茶中提取的多糖(Huangshan Mountain tea polysaccharide，HMTP)对降低CCl4诱导引起的小鼠氧化损伤作用的护肝效果，连续14d每日对小鼠喂服一定剂量的HMTP，通过对小鼠肝损伤的血清标记物研究表明HMTP可以明显降低CCl4对机体的毒性影响，同时HMTP还可以通过控制丙二醛和15-F2t异前列腺素的形成显著抑制肝脂质过氧化作用，进而提高谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的抗氧化水平。国内外大量研究资料表明，多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗疲劳和抗衰老等功效，因此有着广阔的应用前景[2]。迷果芹(Sphallerocarpus gracilis)俗称黄葑、小叶山红罗卜，因其根肉呈淡黄色、形似人参，故又名黄参[3-4]，为伞形科(Umbelllferae)迷果芹属(Sphallerocarpus Bess.)的多年生草本单种植物，在我国黑龙江、吉林、甘肃、青海等地和蒙古、前苏联西伯利亚东部及远东地区均有分布。黄参富含人体必需的多种氨基酸、矿物质和微量元素，有很高的药用价值和保健功效。据《晶珠本草》记载：加果治黄水病，腰肾寒症，是藏医名为“五根散”首药[5]。研究表明，黄参具有祛风、胜湿、止痛等功效，对治疗晚期胃癌、诱导癌细胞调节有良好效果[6-7]。黄参是一种纯天然保健食品，而多糖又是其中主要功效成分[8-9]。贾磊等[10-11]通过实验证实，黄参多糖对小鼠运动时能量补充及激发糖代谢和能量代谢酶系活性有积极作用，并对小鼠骨骼肌自由基代谢和超微结构产生深刻影响，同时在提高机体免疫能力及抗疲劳方面也有显著功效。目前关于多糖提取工艺的报道较多[12-14]，而关于黄参多糖提取的报道较少[3,9,15]。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是将数学与统计学相结合，采用多元二次回归方法作为函数估计的工具来拟合因素与响应值之间的函数关系[16]，依此对函数的响应面和等高线进行分析，进而寻求最佳工艺参数。

本研究借鉴和改进前人研究的方法[17-20]，采用最简便的醇溶水提法，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对黄参多糖提取工艺进行研究，以期为制定科学、简便、经济的黄参多糖制备工艺提供实验依据，为进一步利用甘肃优质药材进行多糖提取和协同增效作用进行癌细胞增殖抑制以及细胞凋亡方面的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄参(Sphallerocarpus gracilis)，2012年10月新鲜采挖于甘肃省张掖市山丹县，采样使用几何法，再经四分法取样，从中选取无腐烂、无病虫害和霉变的新鲜黄参于4℃冰箱冷藏备用。

无水葡萄糖、无水乙醇、95%乙醇溶液、浓硫酸、苯酚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DKB-501A型超级恒温水槽 北京长源设备厂；TD5M离心机 北京离心机厂；RT-9型中药粉碎机 浙江省缙江县超力机械厂；电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海康华生化仪器制造厂。

1.3 方法

1.3.1 黄参多糖样品的提取制备

准确称取经干燥、粉碎、过60目筛的黄参粉0.50g，置于100mL锥形瓶中，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，85℃水浴加热提取50min；浸提完毕后立即冷却，于4000r/min离心10min；取上清液，用三氯甲烷-正丁醇(4:1，V/V)洗脱蛋白；取上清液缓慢加入3倍体积的95%乙醇溶液，于4℃冰箱中静置过夜，然后在4000r/min离心5min，收集沉淀；依次用80%、95%乙醇溶液、丙酮溶液反复洗涤，再于3000r/min离心5min，得黄参多糖粗提物，用蒸馏水溶解备用。

1.3.2 多糖得率的测定

1.3.2.1 测定波长的确定

目前，苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量[21-22]技术已经相当成熟，本实验在没有光谱扫描的条件下，初步确定以490nm作为吸收波长，再结合原料特点和预实验结果，进行小范围调整，最后将测定波长定为495nm。

1.3.2.2 显色时间的选择

移取葡萄糖标准溶液和供试样品溶液各1.0mL，置于试管中，依次加入蒸馏水1.0mL、5%苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，摇匀，在沸水浴加热条件下分别显色10、15、20、25min和30min。反应终止立即冷却，在495nm波长处测定吸光度，确定显色时间对多糖含量的影响。

1.3.2.3 标准曲线的制备

精确称取经105℃干燥至恒质量的葡萄糖0.1000g，配制成质量浓度为100μg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL和1.4mL葡萄糖标准溶液，配制成葡萄糖含量为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50μg/mL和1.75μg/mL的葡萄糖标准溶液，置于具塞刻度试管中，依次加蒸馏水补充至2.0mL。各加入5%苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5mL，充分振摇，静置5min，沸水浴加热10min后取出，冷却至室温，再于495nm波长处以2.0mL蒸馏水取代葡萄糖标准溶液作为空白对照测定吸光度。以葡萄糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2.4 精密度实验

分别移取6份供试样品溶液各0.5mL，置于具塞试管中，按1.3.2.3节方法测定吸光度，重复测定6次。

1.3.2.5 重复性实验

分别移取6份供试样品溶液各0.5mL，置于具塞试管中，按1.3.2.3节方法测定吸光度，计算多糖含量。

1.3.2.6 加标回收实验

移取5份供试样品溶液各0.5mL，分别加入100μg/mL的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4mL和0.5mL，测定吸光度，按式(1)计算加标回收率。

(1)

1.3.2.7 黄参多糖得率计算

采用硫酸-苯酚比色法，以葡萄糖为标准样液，将黄参粗多糖溶解并稀释至适当质量浓度，移取0.5mL粗多糖液，测定吸光度，按式(2)计算多糖得率。

(2)

式中：m2为供试液于分光光度计读数后带入根据标准曲线得到的回归方程计算出的葡萄糖的质量/μg；V2为样品液的总体积/mL；n为稀释倍数；V1为样品测定液的体积/mL；m1为供试样品的质量/g。

1.3.3 黄参多糖提取工艺单因素试验

1.3.3.1 料液比对黄参多糖得率的影响

称取黄参粉0.50g，按料液比1:15、1:20、1:25、1:30和1:35加入蒸馏水，85℃水浴加热处理50min，浸提1次，按1.3.1节方法制备黄参多糖样品，计算黄参多糖得率。每个处理平行3次，取平均值。

1.3.3.2 浸提温度对黄参多糖得率的影响

选取1.3.3.1节得出的最适料液比，按60、70、80、90℃和100℃水浴加热处理50min，浸提1次。在此条件下，计算黄参多糖得率。

1.3.3.3 浸提时间对黄参多糖得率的影响

选取1.3.3.1节和1.3.3.2节得出的最适料液比和浸提温度，分别加热40、60、80、100min和120min，浸提1次。在此条件下，计算黄参多糖得率。

1.3.3.4 浸提次数对黄参多糖得率的影响

按1.3.3.1～1.3.3.3节得出的最适浸提条件，调整浸提次数分别为1、2、3、4、5次，计算黄参多糖得率。

1.3.4 黄参多糖提取工艺参数优化

在单因素试验基础上，分别以料液比、浸提温度、浸提时间和浸提次数为响应因素，以多糖得率作为响应值(y)，运用SAS 9.2统计软件进行响应面设计，研究此4因素对多糖得率的影响，响应面试验因素与水平见表1。每个处理重复3次，取平均值进行统计分析。

表 1 响应面分析因素与水平

Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 黄参多糖的定量分析

2.1.1 显色时间的选择

分别移取葡萄糖标准溶液和供试样品溶液各1.0mL置于试管中，加1.0mL蒸馏水，在495nm波长处每隔一定时间测定1次吸光度。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，结果见图1。

图 1 显色时间对吸光度的影响

Fig.1 Effect of reaction time for color development on the absorbance

由图1可知，葡萄糖标准溶液和供试样品溶液显色后，随着显色时间的延长吸光度呈缓慢下降趋势，所以选择10min为最佳显色时间。根据结果，补充实验设计，添加5min的显色时间点，测得供试样品溶液的吸光度为0.487，低于供试样品溶液显色10min时的吸光度，因此进一步说明10min确实为最佳显色时间。

2.1.2 标准曲线的制备

根据1.3.2.3节方法制作标准曲线，得回归方程为y=2.0425x-0.0046，R2=0.9992，在0～1.75μg/mL范围内葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。

2.1.3 精密度实验

表 2 精密度实验(n=6)

Table 2 Precision of the method (n = 6)

由表2可知，测得的供试样品溶液吸光度相对标准偏差(RSD)较小，可见用硫酸-苯酚法测定黄参多糖含量精密度较高。

2.1.4 重复性实验

表 3 重复性实验

Table 3 Repeatability of the method

由表3可知，所得供试样品溶液多糖含量的相对标准偏差较小，可见用该法测定黄参多糖含量的重复性较好，精度较高，能达到一般分光光度法的要求。

2.1.5 加标回收实验

表 4 加标回收率测定结果

Table 4 Recoveries of polysaccharides in spiked samples

由表4可知，该方法的平均回收率为100%，相对标准偏差(RSD)为1.0%，说明该法加标回收率高，RSD较小，准确度较高。

综上，通过对线性关系、显色稳定性、精密度、重复性和加标回收率的考察，用硫酸-苯酚分光光度法定量分析黄参多糖含量的方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于黄参多糖含量的测定。

2.2 黄参多糖提取工艺参数分析

2.2.1 料液比对黄参多糖得率的影响

图 2 料液比对多糖得率的影响

Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polysaccharides

由图2可知，多糖得率随浸提液的增多而呈缓慢上升趋势。浸提液增多，细胞内外的多糖浓度差增大，传质推动力也越大，有利于多糖的浸出[23]。但当料液比在1:30～1:35时，多糖得率呈下降趋势，这说明料液比太高太低都会影响得率[24]。综上说明增加浸提液用量虽有利于多糖提取，但用量过多既会增大试剂消耗量，又不利于后期的分离浓缩。因此，兼顾多糖得率、试剂消耗量及后续处理，最终采用1:25料液比为宜。

2.2.2 浸提温度对黄参多糖得率的影响

图 3 浸提温度对多糖得率的影响

Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of polysaccharides

由图3可知，随着浸提温度的升高，多糖得率逐渐增加，且增幅较料液比对多糖得率影响明显。当温度高于90℃时，多糖得率下降。这可能是伴随浸提温度的升高，原料溶胀度增大，加快了传质运动，从而使得多糖的溶出率增加，因而导致多糖得率上升[25]。同时热作用加大了对黄参细胞壁组织的破坏，进而使细胞内的多糖容易浸出[23]，但考虑多糖是活性物质，温度过高易破坏其结构，且温度高能耗也大，故选择浸提温度在90℃左右为宜。

2.2.3 浸提时间对黄参多糖得率的影响

由图4可知，多糖得率在浸提时间为40～60min内随浸提时间延长而增加，之后呈下降趋势。这说明在被浸提物与浸提液未达到扩散平衡前，浸提时间越长则浸提物溶解度越大，多糖得率也越高[23]。但是浸提时间长于60min以后多糖得率反而有所下降，说明目的产物浸出过程与时间密切相关，时间过短，产物溶解不充分，但时间过长，又会引起产物结构的变化进而使得率降低[25]。因此选取最佳浸提时间为60min。

图 4 浸提时间对多糖得率的影响

Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of polysaccharides

2.2.4 浸提次数对黄参多糖得率的影响

图 5 浸提次数对多糖得率的影响

Fig.5 Effect of number of repeated extractions on the extraction efficiencyof polysaccharides

由图5可知，增加浸提次数，黄参多糖得率明显上升，当浸提2次时，多糖得率达最大，之后多糖得率缓慢下降。为了降低操作成本，缩短生产周期，浸提次数以2次为宜。

2.3 黄参多糖提取工艺参数优化

表 5 Box-Behnken试验设计及结果

Table 5 Process variables and levels in Box-Behnken design arrangement and experimental results

按照4因素响应面设计方案，安排了27组处理组合，分别测定不同处理的相应指标，结果如表5所示。

2.3.1 回归模型的建立

以料液比、浸提温度、浸提时间和浸提次数为响应因素，以多糖得率作为响应值，建立工艺参数的回归模型：

y=3.536667＋0.21x1＋0.008333x2＋0.2125x3―0.000833x4―0.382917x12＋0.03x1x2＋0.09x1x3―0.005x1x4―0.302917x22―0.01x2x4―0.354167x32―0.0025x3x4―0.284167x42 (1)

对响应面试验结果进行方差分析，结果如表6所示。

表 6 响应面回归模型方差分析

Table 6 Analysis of variance (ANOVA) of the quadratic regression model

注：**. P＜0.01，差异极显著；*. P＜0.05，差异显著。

方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数正负反映了影响的方向。从表6可以看出，x1、x3的一次项及所有响应因素的二次项对多糖得率影响极为显著，说明因素的各项系数与响应值不是简单的线性关系。对回归系数进行检验，可知x1、x3的一次项对多糖得率作用影响呈正效应，而所有响应因素的二次项对多糖得率影响均为负效应。其他变量影响均不显著(P＞0.05)，无统计学差异。

在α=0.05显著水平剔除不显著项，简化回归模型，得到优化后的回归方程为：

y = 3.536667＋0.21x1＋0.2125x3―0.382917x12―0.302917x22－0.354167x32―0.284167x42 (2)

回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高[26]。对表6中失拟项作F检验，F1=7.513942，P=0.1231，说明失拟项在α=0.05水平不显著，可以进一步考察回归项对多糖得率的影响。用统计量F2对回归方程作F检验，F2=14.91797，P＜0.0001，说明回归方程在α=0.05水平显著，试验数据与采用的二次数学模型基本符合。二次回归方程R2=94.57%，调整后的R2=88.23%，说明回归方程可以在94.57%的置信区间对实际情况进行拟合，可用于黄参多糖提取不同工艺参数对黄参多糖得率影响的预测，具有实际应用意义。

2.3.2 两因素交互作用对多糖得率的影响

a.料液比和浸提温度

b.料液比和浸提时间

图 6 各两因素交互作用对多糖得率影响的响应面及等高线图

Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on the extraction efficiency of polysaccharides

分别两两固定变量x3和x4，x2和x4于零水平，依次得到其他两个变量交互作用的响应面和等高线图，如图6所示。可以看出，交互效应对多糖得率影响近似椭圆，表明这两个交互项的交互作用不显著，这与表6中回归模型系数显著性检验结果一致，验证了回归模型方差分析的正确性。

由图6a可知，在浸提时间60min和浸提2次条件下，当固定料液比不变时，随着浸提温度的升高，多糖得率先增加后减少，呈开口向下的抛物线形状，且上升趋势略高于下降趋势；当固定浸提温度不变时，随着浸提液用量增多，多糖得率先显著增加，之后略有减少，亦呈开口向下的抛物线形状；从等高线变化趋势可知，料液比对多糖得率的变化略为敏感。

由图6b可知，在浸提温度90℃和浸提2次条件下，当固定料液比不变时，随着浸提时间的延长，多糖得率先迅速增加后略有减少，呈开口向下的抛物线形状，且上升趋势高于下降趋势；当固定浸提时间不变时，随着料液比水平加大，多糖得率显著增加，后略有减少，且减少趋势不明显；从等高线变化趋势可知，过程对浸提时间和料液比变化无显著性差异。

由图6还可以看出，响应因素的响应面出现鞍面，无极值存在，因此不能直接从响应面图上找出最佳参数，需进一步作岭脊分析。

通过岭脊寻优可知，当编码半径为0.5时响应值最大，此时多糖得率取得最高值3.61%，此时料液比编码水平为0.33856，浸提温度编码水平为0.03310，浸提时间编码水平为0.36638，浸提次数编码水平为－0.007211，对应的最佳工艺参数为：料液比1:26.7(g/mL)、浸提温度90℃、浸提时间67min、浸提2次。

2.3.3 验证实验

为了检验模型预测的准确性，按最佳工艺条件提取，重复3次，实际测得多糖得率为3.41%，与理论预测值相比相对误差为0.2%，可见该模型能较好地模拟和预测黄参多糖得率，具有实用价值。

3 结 论

3.1 通过对线性关系、显色稳定性、精密度、重复性和加标回收率的考察，结果表明，采用硫酸-苯酚分光光度法定量分析黄参多糖含量简便、准确、灵敏度高、重复性好，方法准确，易于操作。

3.2 通过响应面设计和方差分析可知，料液比x1和浸提时间x3的一次项，所有响应因子的二次项对多糖得率影响极为显著，二次回归方程R2=94.57%，说明回归方程可以在94.57%的置信区间对实际情况进行拟合，可用于黄参多糖提取不同工艺参数对黄参多糖得率影响的预测，具有实际应用意义。

3.3 确定了黄参多糖的最佳提取工艺参数为料液比1:26.7(g/mL)、浸提温度90℃、浸提时间67min、浸提2次，在此条件下，多糖得率为3.41%。

参考文献：

[1] LU Xinshan, ZHAO Yan, SUN Yanfei, et al. Characterisation of polysaccharides from green tea of Huangshan Maofeng with antioxidant and hepatoprotective effects[J]. Food Chemistry, 2013, 141: 3415-3423.

[2] 唐洁. 植物多糖生物活性功能的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(5): 130-132.

[3] 于瑞涛, 朱鹏程, 陶燕铎, 等. 苯酚硫酸法测定迷果芹多糖的含量[J]. 分析试验室, 2008, 27(12): 222-224.

[4] 陈叶, 陈天仁, 罗光宏. 黄参营养价值及加工工艺技术研究[J]. 食品科技, 2003(11): 96-100.

[5] 胡端龙, 刘小兰, 陶燕铎, 等. 迷果芹挥发油化学成分研究[J]. 天然产物研究与开发, 2009, 21(10): 343-345.

[6] 许岸高, 刘集鸿. 黄参冲剂联合化疗治疗晚期胃癌[J]. 广东医学, 1999, 20(2): 150-151.

[7] 贾恢先, 邹卿, 叶相清, 等. 山丹黄参的分布及微量元素含量研究[J]. 西北植物学报, 2001, 21(1): 188-190.

[8] 杨小舟, 张继, 杨晓龙, 等. 微波辅助提取黄参多糖的工艺研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(9): 319- 321.

[9] 何国光, 刘晔玮, 张鹤, 等. 黄参多糖含量测定条件优选[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(11): 1400-1402.

[10] 贾磊, 聂秀娟, 肖雯, 等. 黄参多糖干预运动小鼠免疫功能的实验研究[J]. 成都体育学院学报, 2010, 36(7): 72-76.

[11] 贾磊, 聂秀娟, 方梅, 等. 黄参多糖对小鼠骨骼肌自由基代谢及超微结构的影响[J]. 河北体育学院学报, 2010, 24(5): 58-62.

[12] 孙培龙, 杨开, 赵培城, 等. 姬松茸子实体多糖提取方法的研究[J]. 食品科学, 2003, 24(6): 71-76.

[13] 高丽君, 王汉忠, 崔建华, 等. 白首乌可溶性多糖提取工艺研究[J]. 食品科学, 2004, 25(10): 178-180.

[14] 李亚娜, 林永成, 佘志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺[J]. 华南理工大学学报: 自然科学版, 2004, 32(11): 28-32.

[15] 于瑞涛, 朱鹏程, 陶燕铎, 等. 迷果芹多糖提取工艺研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(16): 7512-7513.

[16] 叶红, 吴涛, 周春宏. 马尾藻多糖提取工艺的优化[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(7): 22-25.

[17] 苏凤贤, 杨全文, 李彩霞, 等. 密枝瑚菌多糖提取工艺参数优化[J]. 天然产物研究与开发, 2011, 23(4): 751-754.

[18] 郭小鹏, 田呈瑞, 高春燕, 等. 黄参粗多糖脱蛋白工艺以及对亚硝酸盐清除作用的研究[J]. 食品工业科技, 2011, 32(2): 274-276.

[19] 倪受东, 严德江, 徐先祥. 大黄多糖的提取及含量测定[J]. 中国药业, 2007, 16(13): 10-11.

[20] 张芬琴, 李彩霞, 李鹏, 等. 荷叶离褶伞可溶性多糖提取工艺研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(5): 224-225.

[21] 张志军, 刘建华, 李淑芳, 等. 灵芝多糖含量的苯酚-硫酸法检测研究[J]. 食品工业科技, 2006, 27(2): 325-327.

[22] 余瑞元, 袁明秀, 陈丽蓉, 等. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京: 北京大学出版社, 2005: 194-196.

[23] 庞凌云, 祝美云, 李瑜, 等. 苜蓿芽水溶性多糖提取工艺的研究[J]. 浙江农业科学, 2007(6): 643-645.

[24] 马亚团, 周文明, 田鹏, 等. 小麦麸皮多糖提取工艺研究[J]. 西北农业学报, 2006, 15(3): 197-200.

[25] 王鸿, 邓泽元, 刘蓉, 等. 响应曲面法优化山蕗菜根多糖的提取工艺[J]. 食品科学, 2010, 31(2): 46-50.

[26] 安金双, 王迪, 马士淇, 等. 响应面法优化灰树花中多糖超声波提取工艺的研究[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(6): 11-15.