反相C18柱层析法制备高纯度辣椒碱单体

王 洋1,韩 爽2,曹 迪1,刘 举1,周云鹏1,徐利锋1,陈 烨1,*

(1.辽宁大学药学院,辽宁 沈阳 110036,2.辽宁省肿瘤医院,辽宁 沈阳 110042)

 

摘 要:为得到纯品辣椒碱单体,去除辣椒碱类化合物其余成分的副作用,研究了高纯度辣椒碱单体制备方法。以辣椒精为原料,得到辣椒碱类化合物,利用多种柱色谱技术进行分离和纯化,最终用反相C18柱层析法得到高纯度辣椒碱单体。经高效液相色谱法检测辣椒碱类化合物为辣椒碱和二氢辣椒碱的混合物。辣椒碱单体纯度为98%。反相C18柱层析法能有效分离纯化辣椒碱类化合物,可以用于制备高纯度辣椒碱单体。

关键词:辣椒碱单体;辣椒碱类化合物;反相C18柱层析

 

Preparation of High Purity Capsaicin Monomer by Reverse Phase C18 Column Chromatography

 

WANG Yang1,HAN Shuang2,CAO Di1,LIU Ju1,ZHOU Yun-peng1,XU Li-feng1,CHEN Ye1,*

(1. College of Pharmacy, Liaoning University, Shenyang 110036, China;

2. Liaoning Cancer Hospital & Institute, Shenyang 110042, China)

 

Abstract:A novel method was developed to prepare high purity capsaicin monomer using reverse phase C18 column chromatography. Capsaicinoids were extracted from capsicum oleoresin and then fractionated by column chromatographies on silica gel, alumina and reverse phase C18 silica gel. As a result, a mixture was obtained consisting of capsaicin with a purity of 98% as determined by HPLC and dihydrocapsaicin. This study suggests that reverse phase C18 column chromatography is an effective method to purify capsaicinoids and prepare high-purity capsaicin monomer.

Key words:capsaicin monomer;capsaicinoids;reverse phase C18 column chromatography

中图分类号:TQ283 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)24-0065-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324013

辣椒起源于南美洲的秘鲁和中美洲的墨西哥一带,通常被作为药物和调味品使用[1]。辣椒(capsicum)又名大椒、辣子、番椒等,属于一年生草本茄科植物,是一种常用的辛香料。引起辛辣味的物质主要是辣椒碱类化合物(capsaicinoids),这是一类含酚羟基的生物碱,主要包括辣椒碱(capscaicin)、降二氢辣椒碱(nordihydrocapsaicin)、二氢辣椒碱(dihydrocapsaicin)等[2]。其中辣椒碱(capscaicin)在辣椒果实中的含量在0.2%~1.0%之间[3],还有一些特殊的如柿子椒辣椒碱含量为0%,墨西哥灯笼椒辣椒碱含量接近2%。由于这类生物碱结构及理化性质都较为接近,很难用常规的分离方法将辣椒碱单体分离,国内外对辣椒碱的药理研究都是以辣椒碱类化合物为对象,研究表明辣椒碱具有长效镇痛作用[4-5],对带状疱疹后神经痛、牛皮癣、皮肤搔痒症、糖尿病性神经痛等症状具有明显的治疗效果[6-7],此外辣椒碱还具有抗癌[8]、调节心血管压力[9]、保护胃黏膜[10]、减肥[11]、刺激毛发生长[12]等功能。有资料表明,辣椒碱类化合物中有些成分对辣椒碱的药用功能有拮抗作用[13],辣椒碱与神经细胞上的辣椒碱受体结合,促进钙离子或钠离子等阳离子进入,使神经冲动被阻断,从而发挥抑菌作用[14],因而有必要将辣椒碱单体从辣椒碱类化合物中进一步分离出来,便于研究辣椒碱与其他物质的作用关系,从而发挥更好的药理作用。据报道辣椒碱微乳的体外透皮速率均显著高于相应对照制剂,是一具有开发潜力的新剂型[15]。并且辣椒碱对藻类等海洋污损生物有明显的趋避作用,作为海洋防污剂具有广阔的开发前景[16]。

辣椒碱不仅在医药学方面有一定作用,在食品科学中也占据重要作用。辣椒碱能够抑制食品中重要真菌及细菌,如啤酒酵母菌、葡萄球菌等,当处于中性条件时能使抑菌作用达到最大效果,并且抑菌活性在高温时稳定,实践中受限较小,在食品工业中可作为天然防腐剂广泛应用[17]。王静等[18]研究了辣椒碱对大鼠血脂的影响,发现辣椒碱具有减少脂肪细胞个数、降低大鼠腹腔脂肪湿重的效果,说明辣椒碱具有一定的减肥作用。经研究发现适当浓度的辣椒碱可以增进毛细淋巴管和毛细血管中淋巴液和血液的循环,从而提高皮肤新陈代谢能力,达到美容皮肤的作用。因此辣椒碱可用于生产美容护肤品,改善面部、手臂部肤质[19] 。

目前关于辣椒碱单体制备的文献报道很少,常用的分离方法如溶剂萃取法、柱层析法、超临界二氧化碳流体萃取法等都难以将其从辣椒碱类化合物中提取分离出来,但这些方法的提取效果都不理想,不仅操作复杂、成本较高,而且不适合大规模分离纯化操作。由于辣椒碱单体其他各组分之间的化学结构非常相似,最主要的辣椒碱和二氢辣椒碱只是碳链第6位单双建的差别[20],因此分离难度很大。本实验将采用反相C18硅胶柱层析法制备辣椒碱单体结晶,并研究其分离工艺,以期建立一种有效制备高纯度辣椒碱单体的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒碱对照品(纯度≥97.7%) 美国Sigma公司。

甲醇、乙腈(色谱纯) 天津市大茂化学试剂厂;无水硫酸钠、乙醚均为分析纯;100~200目柱层析硅胶 青岛海洋化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

1525型高效液相色谱仪、2487型检测器、Symmetry C18色谱柱(4.6mm×150mm,5µm) 美国Waters公司;INOVA 600型核磁共振仪(内标TMS,溶剂 CDCl3) 美国Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 含量测定

分析色谱:Symmetry C18色谱柱(4.6mm×150mm,5µm);检测波长[21]:281nm;流动相:乙腈-水(1:1,V/V);流速:1mL/min;进样量:20mL。

1.3.2 辣椒碱类似物制备

取辣椒精2kg(辣椒碱含量为1.8%),加20L 5%的氢氧化钠溶液,调节pH值,置入分液漏斗,静置分层,收集下层水溶液。用一定量的乙醚萃取水溶液3次,再用饱和碳酸钠溶液萃取除去乙醚液中的杂质,然后用3%的氢氧化钠溶液萃取出其中的辣椒碱类化合物,结晶。

1.3.2.1 硅胶柱层析法分离纯化

将硅胶与正己烷溶剂混合,搅拌均匀,湿法装柱。装柱时轻敲层析柱下部, 使填装紧密。将辣椒碱初品5g加入到15mL乙酸乙酯中溶解,称取15g硅胶加入其中拌样,湿法上样,用洗脱剂乙酸乙酯-正己烷(1:5,V/V)进行洗脱,收集辣椒碱部分,减压浓缩、真空干燥。

1.3.2.2 氧化铝柱层析法分离纯化

将辣椒碱初品5g加入15mL乙酸乙酯中溶解,加入15g中性氧化铝,搅拌均匀以后在50℃条件下真空干燥。然后将干燥后的氧化铝装入层析柱,用复合溶剂乙酸乙酯-正己烷(1:5,V/V)洗脱,洗脱液减压蒸馏浓缩。

1.3.2.3 反相C18硅胶柱层析法分离纯化

辣椒碱类化合物含有辣椒碱、二氢辣椒碱。由于两者在化学结构上只相差一个双键,极性非常相近,普通硅胶、氧化铝分离材料难以分离二者,对辣椒类化合物采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法检测,二者保留时间相差约3min,可以完全分开辣椒碱和二氢辣椒碱,因此选择与高效液相色谱柱填料组分、结构类似的柱层析用反相C18硅胶分离辣椒碱与二氢辣椒碱。也有文献报道过用C18硅胶分离辣椒碱,艾秀珍等[22]用反相制备液相色谱法从辣椒碱类化合物中分离得到了高纯度辣椒碱单体,得到的辣椒碱单体纯度为95.23%,该方法需要制备色谱柱碳十八硅胶柱(200mm×l0.0mm),该系统设备较昂贵,处理量小,使扩大生产困难,不利于实现大规模生产。吴波等[23]用半制备型高效液相色谱制备辣椒碱单体的方法,同样存在以上缺陷。专利 201110385818.6用自制反相色谱柱分离出单体辣椒碱,将原料液直接湿法上样,此方法上样量小,湿法上样比干法上样分离纯度低,分离效果差。鉴于以上文献报道,采用以下实验方法分离辣椒碱和二氢辣椒碱。

取辣椒碱类化合物 20g按质量比1:2的比例加入乙酸乙酯溶解,再按质量比1:1.5的比例加入反相C18硅胶,50℃干燥拌样。

按照拌样-反相C18硅胶(1:16,m/m)称取反相C18硅胶,甲醇作为溶剂,湿法装柱。1d后干法上样。

洗脱系统:甲醇-水(6:4,V/V),洗脱液经HPLC检测回收,减压蒸馏回收溶剂,得到辣椒碱油状物。

由于辣椒碱油状物脂溶性好并且其中含有水溶性杂质,因此辣椒碱油状物用乙酸乙酯和水混合萃取,浓缩物溶于乙醚中-4℃条件下结晶,过滤、干燥。

1.3.3 紫外扫描检测

精密称取分离辣椒碱单体结晶9.0mg,辣椒碱对照品8.0mg,置10mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度。分别精密移取1.0mL上述溶液至10mL容量瓶中,用甲醇定容,分离的辣椒碱单体质量浓度为90μg/mL,辣椒碱对照品质量浓度为84μg/mL,对二者进行紫外扫描。

1.3.4 HPLC检测

精密称取分离的辣椒碱单体结晶与辣椒碱对照品各约50mg,置10mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,摇匀(辣椒碱质量浓度5mg/mL)。分别精密移取1.0mL上述溶液至10mL容量瓶中,甲醇定容,使辣椒碱质量浓度为500μg/mL,0.45μm微孔滤膜滤过,进样量20μL。分别对辣椒碱类化合物、辣椒碱对照品,分离的辣椒碱单体进行HPLC检测。

2 结果与分析

2.1 各层析法得到产物的产率及纯度

硅胶柱层析法分离纯化得辣椒碱油状物2.6g,产率52%,经HPLC检测,纯度90%左右。纯度较低;氧化铝柱层析法分离纯化得辣椒碱油状物2.7g,产率54%,经HPLC检测,纯度90%左右。纯度较低;反相C18硅胶柱层析法分离纯化得到单体辣椒碱结晶13g,产率65%,纯度为98%。

2.2 紫外扫描检测

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1.分离的辣椒碱单体;2.辣椒碱对照品。

图 1 分离的辣椒碱单体及辣椒碱对照品紫外扫描图谱

Fig.1 UV absorpiton spectra of capsaicin standard and capsaicin monomer

由图1可知,分离的辣椒碱单体与辣椒碱对照品溶液的紫外扫描图谱完全重叠,可证明分离后的辣椒碱单体为辣椒碱纯品。

2.3 HPLC检测

所得辣椒碱类化合物的纯度为97.61%、产率为1.7%,其中辣椒碱含量68.49%、二氢辣椒碱含量27.34%。由图2b、c可见,分离得到的辣椒碱单体与辣椒碱对照品(图2a)二者具有相同的保留时间;辣椒碱对照品纯度不小于97.7%,二者进样质量浓度相同,辣椒碱对照品峰面积为1172282,分离得到的辣椒碱单体峰面积为1172239,通过峰面积的比较,确证分离得到的辣椒碱单体纯度不小于97.7%。

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a.辣椒碱类化合物

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b.辣椒碱对照品

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c.分离的辣椒碱单体

图 2 各辣椒碱类物质的HPLC色谱图

Fig.2 HPLC profiles of capsaicinoids, capsaicin standard
and capsaicin monomer

2.4 高纯度辣椒碱与辣椒碱对照品的熔点测定

取分离的辣椒碱单体与辣椒碱对照品,进行熔点测定,两者熔点基本一致。辣椒碱对照品熔点为65~66℃[24];分离的辣椒碱单体熔点为65.3~65.6℃。

2.5 高纯度辣椒碱核磁氢谱检测

1H-NMR(600MHz):δ 0.98(6H,d,CH3×2);1.36
(2H,m,CH2);1.59(2H,m,CH2);1.95~2.05(2H,m,
CH2);2.17~2.23(2H,m,CH2);2.26(1H,m,CH);3.77(3H,s,OCH3);4.24(2H,d,ArCH2NH);5.38(2H,m,CH = CH);6.75~6.85(3H,m,ArH);8.25(1H,t,NHCO);8.86(1H,s,OH)。

综上可知,经反相C18柱层析硅胶分离得到的单体结晶成分为单一结构辣椒碱。

3 结 论

采用反相C18硅胶柱层析法制备辣椒碱单体结晶。辣椒碱类化合物干法上样,甲醇-水(6:4,V/V)的体系洗脱,乙酸乙酯与水萃取后溶于乙醚中,-4℃条件下结晶,得纯度98%的辣椒碱单体。本方法具有分离效率高、分离时间短、分离产品质量好、操作方便、成本较低等特点,而且分离量较大,分离效率高,适合工业化生产,更加重要的是,本实验方法比艾秀珍等[22]用反相制备液相色谱分离纯度提高了2%。此外,C18硅胶色谱柱经甲醇再生后可重复利用,节约资源。

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收稿日期:2013-02-27

作者简介:王洋(1980—),男,助理研究员,硕士,研究方向为有机药物合成、天然产物的分离提纯及结构修饰。

E-mail:13940355775@163.com

*通信作者:陈烨(1965—),男,副研究员,博士,研究方向为新药研发。E-mail:sy-chenye@163.com