呋喃酮和酱油酮的填充柱超临界流体色谱对映体拆分

孙 蕾，都荣强，谢建春*，孙宝国

(北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048)

摘 要：采用填充柱超临界流体色谱对外消旋呋喃酮和酱油酮进行手性拆分。首先在分析型条件下，考察手性柱种类、改性剂种类和含量、柱温、柱压、流速等参数对容量因子、选择性因子、分离度的影响，获得拆分呋喃酮的较佳条件为手性柱Chiralpak AD-H、柱温30℃、柱压10MPa、改性剂1.0%(V/V)甲醇、流速1.5mL/min，得到分离度1.54；拆分酱油酮的较佳条件为手性柱Chiralpak AD-H、柱温33℃、柱压13MPa、改性剂1.5%(V/V)乙醇、流速1.5mL/min，得到分离度1.51。利用较佳条件进行制备规模放大，获得呋喃酮和酱油酮的对映体产品，光学纯度(对映体过量，e.e，%)均≥90%，回收率≥70%。对映体产品的获得可为探讨手性呋喃酮和酱油酮应用于食品加香的可行性提供基础条件。

关键词：填充柱超临界流体色谱；呋喃酮；酱油酮；手性拆分；对映体

Resolution of Furaneol and Homofuraneol by Packed Column Supercritical Fluid Chromatography

SUN Lei，DU Rong-qiang，XIE Jian-chun*，SUN Bao-guo

(Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract：The separation of racemic furaneol and homofuraneol by packed column supercritical fluid chromatography was studied. First, on an analytical scale, the effects of chiral column type, modifier solvent type and modifier solvent content in mobile phase, column temperature, column pressure and flow rate on capacity factor (k’), selectivity factor (α) and resolution factor (Rs) were investigated. The optimum conditions for resoluting furanone were Chiralpak AD-H column, column temperature of 30 ℃, column pressure of 10 MPa, 1.0% (V/V) methanol in mobile phase and flow rate of 1.5 mL/min, whereby Rs was 1.54. The optimum conditions to resolute homofuraneol were Chiralpak AD-H column, column temperature of 33 ℃, column pressure of 13 MPa, 1.5% (V/V) ethanol in mobile phase and flow rate of 1.5 mL/min, whereby Rs was 1.51. Second, experiments on a preparative scale were carried out under the above optimum conditions, and the enantiomers of furaneol and homofuraneol were successfully obtained with a purity of no less than 90% as well as a recovery yield of no less than 70%. The present work will be helpful for evaluating the potential applications of chiral furaneol or chiral homofuraneol to enhance food flavor, where the enantiomers of furaneol and homofuraneol are prerequisite.

Key words：packed column super critical fluid chromatography；furaneol；homofuraneol；chiral preparative resolution；enantiomer

中图分类号：TQ65 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0077-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324016

呋喃酮和酱油酮是食品增香中广泛使用的两种香料。呋喃酮化学名为4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone，DMHF)。酱油酮也称环高呋喃酮，化学名为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(2-ethyl-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone，EMHF)。呋喃酮天然存在于草莓、菠萝、甜瓜、咖啡等多种食品中，具有强烈的似红糖、麦芽酚、烘烤食品的气息，并带有水果气味，可用于草莓、焦糖、巧克力、菠萝蜜、热带水果、烤肉等多种食用香精的调配。酱油酮天然存在于酱油中，含量50～100mg/kg，具有浓郁的天然水果香味、轻微焦糖味和烘烤食品味，水中气味阈值为20µg/L，1988年起酱油酮被工业化生产，至今世界销量已达2t/年[1]。

A. 4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(呋喃酮)

B. 2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(酱油酮)

*.手性碳。

图 1 呋喃酮(A)和酱油酮(B)的化学结构

Fig.1 Chemical structures of furaneol and homofuraneol

呋喃酮、酱油酮均含有一个手性中心，两光学异构体(图1)。手性结构往往对化合物的香气特征有影响，如γ-癸内酯，其R构型具有奶香味，而S构型具有水果香味。但至今具有光学异构体的绝大多数香料在食品中实际使用的仍是其外消旋体。在未来的发展中，若能使用手性香料代替现今的消旋体用于食品增香，不仅可显著提高食品风味的逼真性，而且还可节约原料，有利于食品安全。

随着手性固定相的商品化，色谱直接拆分已成为制备质量毫克至千克级光学纯化合物的首选方法[2]。填充柱超临界流体色谱(packed column supercritical fluid ghromatography，pSFC)主要以超临界二氧化碳为流动相，具有绿色环保、分离效率高的技术优势，目前在手性化合物的分离制备上得到越来越多的青睐[3-6]。多糖衍生类手性固定相是手性分离中具有广泛适用性的一类手性固定相[7-8]。本课题组以Chiralpak AD、Chiralcel OD、Chiralcel OB、Chiralcel OJ等涂覆型多糖衍生类手性固定相为基础，成功地进行了系列γ(δ)-烷基内酯香料的超临界流体色谱手性拆分[9-11]。本研究将较系统地研究呋喃酮和酱油酮的pSFC拆分方法，考察手性固定相、改性剂、柱温、柱压、流速等参数对分离的影响，获得较佳的分析型色谱分离条件；然后制备型规模放大，获得了两香料的对映体产品。Emura等[12]报道的关于呋喃酮对映体绝对构型研究中，曾提到采用多糖衍生物键合固定相Chiralpak IA进行pSFC拆分，可获得呋喃酮对映体样品，但相关的pSFC方法披露很少，且对映体光学纯度不太理想。本实验拟将建立pSFC手性拆分获得高纯度呋喃酮、酱油酮对映体的方法，为探讨手性呋喃酮和酱油酮开发的必要性及在食品中应用的可行性提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

呋喃酮和酱油酮(气相色谱纯度＞98.0%) 广州华宝香精香料有限公司；分析型手性柱(Chiralpak AD-H、Chiralcel OB-H、Chiralcel OD-H、Chiralcel OJ-H(均为(250mm×4.6mm，5μm))，制备型手性柱Chiralpak AD-H
(250mm×10mm，5μm) 日本大赛璐化学工业株式会社；甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈(均为色谱纯) 北京迪马科技公司；高纯二氧化碳(纯度99.99%、40L钢瓶装) 北京亚南气体科技有限公司。

1.2 仪器与设备

12位干浴氮吹仪 美国Organomation Associates公司；Berger MiniGram超临界流体色谱仪(兼有分析和制备模式) 瑞士Metter-Toledo公司；1200(VWD)紫外-可见检测器(190～600nm) 美国Agilent公司；FCM-1200超临界流体泵和改性剂泵、手动进样器(进样环10μL或100μL)、柱温箱(30～60℃)、自动馏分收集器、ALP/SFC在线旋光检测器 美国PDR.Chiral Inc.公司。

1.3 方法

1.3.1 分析型手性拆分方法研究

分析型手性色谱柱，仪器设置为分析模式。样品呋喃酮质量浓度为2mg/mL(溶剂乙醇)，酱油酮质量浓度为3mg/mL
(溶剂甲醇)，紫外检测波长230nm，进样10μL。通过考察手性色谱柱种类、改性剂种类、改性剂含量、柱温、柱压、流速，对容量因子(k’)、选择性因子(α)和分离度(Rs)等分离参数的影响，选择较佳的色谱分离方法。

k’=(tR－t0)/t0 (1)

α=k’2/k’1 (2)

Rs=2(tR2－tR1)/(W1＋W2) (3)

式(1)～(3)中：t0为死时间(注入10µL正己烷测得)；tR1、tR2分别为先、后流出组分的保留时间；k’1、k’2分别为先、后流出组分的容量因子；W1、W2分别为先、后流出组分的色谱峰宽。

1.3.2 制备型拆分获得对映体产品

手性色谱柱Chiralpak AD-H(250mm×10mm，5μm)，紫外检测波长230nm。拆分呋喃酮：柱温30℃、柱压10MPa、改性剂1.0%(V/V)甲醇、流动相流速7mL/min、样品质量浓度10mg/mL(溶剂甲醇)、进样50µL；拆分酱油酮：柱温33℃、柱压13MPa、改性剂1.5%(V/V)乙醇、流动相流速7mL/min、样品质量浓度10mg/mL(溶剂乙醇)、进样50µL。分别重复进样20次。

在仪器稳定后，根据色谱出峰时间自动馏分收集，氮吹浓缩，得酱油酮和呋喃酮对映体产品，按式(4)计算回收率。

回收率/%=(M1＋M2)/M总×100 (4)

式(4)中：M1、M2为拆分所得两对映体(Ⅰ和Ⅱ)的质量/mg；M总为外消旋呋喃酮或外消旋酱油酮的总进样量/mg。

1.3.3 光学纯度分析

在获得的较佳分析型超临界流体色谱条件下，对收集的对映体产品进行分析，按式(5)计算光学纯度(对映体过量，e.e，%)：

e.e/%=(A1－A2)/(A1＋A2)×100 (5)

式(5)中：A1为对映体Ⅰ峰面积；A2为对映体Ⅱ峰面积。

2 结果与分析

2.1 分析型手性拆分方法研究

在手性填充柱超临界流体色谱中，固定相是影响手性分离的最主要因素，其次是改性剂种类。系统性pSFC手性拆分方法的建立，一般是首先选择手性固定相(手性柱)种类，其次改性剂(种类和含量)，再就是柱温、柱压和流速[9,13]。

2.1.1 固定相的选择

固定柱压12MPa、柱温30℃、流速1.5mL/min、改性剂1.5%甲醇，利用Chiralpak AD-H、Chiralcel OD-H、Chiralcel OB-H、Chiralcel OJ-H 4种手性柱，分别对呋喃酮、酱油酮进行拆分，结果见表1。

表 1 不同手性柱上呋喃酮和酱油酮的拆分结果

Table 1 Resolution efficiencies of furaneol and homofuraneo using different chiral columns

从表1可以看出，在Chiralpak AD-H上，呋喃酮和酱油酮的拆分效果较好，分离度较高，Rs分别为1.36和0.89。而对于Chiralcel OD-H、Chiralcel OB-H、Chiralcel OJ-H手性柱，除呋喃酮在Chiralcel OJ-H上有较小分离外(Rs=0.19)，其他未实现任何手性分离，因此拆分呋喃酮和酱油酮的较佳手性柱选择Chiralpak AD-H。

Chiralpak AD-H、Chiralcel OD-H、Chiralcel OB-H、Chiralcel OJ-H 4种多糖衍生类手性固定相的结构分别为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(苯甲酸酯)、纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)。与OB、OJ相比，AD、OD上存在氨基，可与呋喃酮或酱油酮的羟基、羰基形成更强的氢键作用，因此Chiralpak AD-H、Chiralcel OD-H上呋喃酮和酱油酮的容量因子大于使用Chiralcel OB-H、Chiralcel OJ-H上。另外，固定相中多糖大分子排列的空间结构，对分离的选择性有影响[14]。4种手性柱中，呋喃酮和酱油酮在Chiralpak AD-H上选择性因子都最大，表明它们可与直链淀粉固定相的空间结构更好地契合。上述研究结果与文献[15]报道的Chiralpak AD是目前手性分离中使用频率较高的固定相一致。

2.1.2 改性剂种类的选择

在Chiralpak AD-H上，固定柱温30℃、柱压12MPa、流速1.5mL/min，利用甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈4种改性剂，改性剂含量1.5%，对呋喃酮和酱油酮手性拆分，结果见表2。

表 2 呋喃酮和酱油酮在不同改性剂上的拆分结果

Table 2 Resolution efficiencies of furaneol and homofuraneol using different modifier solvents

CO2作为流动相的缺点是极性弱，因而常在流动相中加入甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈改性剂以调节流动相的极性。流动相中改性剂的种类、含量对溶质分子在固定相和流动相间的分配系数有影响，从而影响容量因子、选择性因子和分离度。从表2可以看出，3种醇型改性剂中，随着极性按甲醇、乙醇、异丙醇依次减小，保留增强，容量因子增大。醇型改性剂对呋喃酮、酱油酮与固定相AD的氢键结合有破坏作用，因而容量因子均小于使用乙腈为改性剂时。超临界流体色谱手性分离时，改性剂对选择性因子和分离度的影响较为复杂，没有规律[13]。乙腈为改性剂时，酱油酮未实现任何分离，呋喃酮得到了一定分离，但分离度小于改性剂为甲醇或异丙醇时的结果。表2显示：拆分呋喃酮、酱油酮的较佳改性剂分别为甲醇、乙醇，此时所得分离度最大。这与Gahm等[16]报道在Chiralpak AD-H上醇型改性剂一般有较好表现相一致。

2.1.3 改性剂含量的影响

在Chiralpak AD-H上，固定柱温30℃、柱压12MPa，改性剂为甲醇(呋喃酮)或乙醇(酱油酮)，流速1.5mL/min，调节改性剂的含量，所得结果见图2。

图 2 改性剂含量对呋喃酮(A)和酱油酮(B)手性拆分的影响

Fig.2 Effect of modifier solvent content in mobile phase on the resolution of furaneol and homofuraneol

从图2可以看出，随着改性剂含量升高，流动相的极性增大，洗脱能力增强，容量因子减少，选择性因子减小，分离度呈先上升后减小的趋势。对于呋喃酮，甲醇含量为1.0%时，分离度最高，为1.43；A对于酱油酮，乙醇含量1.5%时分离度最高，为1.32。为此，拆分呋喃酮、酱油酮的改性剂含量分别选择1.0%甲醇和1.5%乙醇。

2.1.4 柱压的影响

在Chiralpak AD-H上，固定柱温30℃、改性剂1.0%甲醇(呋喃酮)、1.5%乙醇(酱油酮)、流速1.5mL/min，考察柱压对手性分离的影响，结果见图3。

图 3 柱压对呋喃酮(A)和酱油酮(B)手性拆分的影响

Fig.3 Effect of column pressure on the resolution of furaneol and homofuraneol

柱压是超临界流体色谱分离的又一重要参数。柱压对溶质和流动相的传质效率有影响，从而影响分离度，但对分离选择性的影响一般很小[17]。由图3可知，因柱压升高会引起超临界CO2流体密度增大，对组分的溶解力增强，从而容量因子减小。但随着柱压的升高，选择性因子几乎不变化，分离度则呈先增加后减小的趋势。总之，拆分呋喃酮和酱油酮柱压分别选择10MPa和13MPa较好，此时分离度最高，分别为1.54和1.39。

2.1.5 柱温的影响

在Chiralpak AD-H上，固定柱压10MPa(呋喃酮)或13MPa(酱油酮)，改性剂为1.0%甲醇(呋喃酮)或1.5%乙醇(酱油酮)，流速1.5mL/min，考察柱温对手性分离的影响，结果见图4。

图 4 柱温对呋喃酮(A)和酱油酮(B)手性拆分的影响

Fig.4 Effect of column temperature on the resolution of furaneol and homofuraneol

柱温影响超临界流体密度及溶质在固定相和流动相中的扩散系数，尤其影响溶质与固定相手性位点作用的强弱，因而是手性超临界流体色谱的重要参数[18]。但考虑到手性固定相的稳定性和使用寿命，实际操作中柱温只限很小范围调节，从而表现为与改性剂含量相比其影响并不显著。由图4可知，柱温升高，超临界流体密度减小，溶质的溶解能力减弱，容量因子增加。但呋喃酮的选择性因子和分离度均减小，酱油酮的选择性因子减小，分离度呈先增大后减小趋势。温度30℃时，呋喃酮分离度最大，为1.54；柱温为33℃时，酱油酮的分离度最大，为1.51。为此，拆分呋喃酮和酱油酮柱温分别选择30℃和33℃较好。

2.1.6 流速的影响

在手性柱Chiralpak AD-H上，呋喃酮：柱温30℃、柱压10MPa、改性剂1.0%甲醇；酱油酮：柱温33℃、柱压13MPa、改性剂1.5%乙醇，改变流速，所得结果见图5。

流速不影响溶质在固定相和流动相间的分配系数，因而对容量因子、选择性因子不产生影响，但流速可影响分离度和分离时间，流速增加将使分离时间缩短。由图5可知，随着流速增加，容量因子、选择性因子几乎不变，但分离度呈先增加后减小的趋势。在1.5mL/min时，呋喃酮达到最大分离度为1.54，酱油酮达到最大分离度为1.51。由于超临界流体色谱的分离时间本身就很短(十几分钟)，选择分离条件时主要考虑分离度，为此，拆分呋喃酮和酱油酮的流动相流速均选择1.5mL/min。

图 5 流速对呋喃酮(A)和酱油酮(B)手性拆分的影响

Fig.5 Effect of flow rate on the resolution of furaneol and homofuraneol

2.1.7 较佳手性拆分条件

图 6 较佳条件下拆分呋喃酮(A)和酱油酮(B)的超临界流体色谱图

Fig.6 SFC chromatograms for the resolution of furaneol and homofuraneol under the optimum separation conditions

通过以上研究，使用分析型色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，拆分呋喃酮的较佳条件为手性柱Chiralpak AD-H、柱温30℃、柱压10MPa、改性剂1.0%甲醇、流速1.5mL/min，分离度1.54；拆分酱油酮的较佳条件为手性柱Chiralpak AD-H、柱温33℃、柱压13MPa、改性剂1.5%乙醇、流速1.5mL/min，分离度1.51。

由图6可知，由于有互变异构体，酱油酮存在4个峰，前两个小峰分别为2-甲基-4-羟基-2-乙基-3(2H)-呋喃酮的一对对映体，后两大峰分别为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮的一对对映体，即酱油酮以2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮为主[1]。本实验主要针对2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮建立酱油酮pSFC拆分方法。

从图6还可知，呋喃酮、酱油酮均先流出的旋光性为(－)，后流出的为(＋)。参考Makoto等[12]报道的呋喃酮、酱油酮旋光性与绝对构型关系，确定呋喃酮、酱油酮均先流出的为S型，后流出的为R型。

2.2 制备型拆分获得对映体产品

超临界流体色谱最大优势是易于制备型规模放大，理论上，在只改变柱内径而柱长及填料粒径不变的前提下，利用相同的柱温、柱压、改性剂等条件，可获得与分析条件下相同的容量因子和分离度[19]。

利用以上分析型较佳条件，使用制备型色谱柱(250mm×10mm，5μm)，在流速7mL/min，样品质量浓度10mg/mL，进样50µL条件下，重复进样20次，拆分呋喃酮和酱油酮，结果见表3。获得呋喃酮和酱油酮的对映体产品，光学纯度≥90%，回收率≥70%。

表 3 呋喃酮和酱油酮的制备型色谱柱拆分结果

Table 3 Preparative resolution of furaneol and homofuraneol

将分离获得的呋喃酮和酱油酮的对映体产品，请实验室的3位同学及具有调香经验的2位老师嗅闻，发现呋喃酮和酱油酮的两对映体香气特征类似，但香气强度差异较大，均是R构型的香气较强烈，S构型香气较弱，这与多数其他呋(吡)喃酮类香料已报道的两对映体香气特征差异相一致[20]。

3 结 论

3.1 本实验较系统地研究了呋喃酮、酱油酮的超临界流体色谱手性拆分方法，考察了固定相种类、改性剂种类和含量、柱压、柱温、流速等因素的影响，获得拆分呋喃酮的较佳条件为Chiralpak AD-H柱、柱温30℃、柱压10MPa、改性剂1.0%甲醇、流速1.5mL/min，得到分离度1.54；拆分酱油酮的较佳条件为ChiralpakAD-H柱、柱温33℃、柱压13MPa、改性剂1.5%乙醇、流速1.5mL/min，得到分离度1.51。所得分离度均大于1.5，以上均实现了两对映体的基线分离。

3.2 利用建立的分析型手性拆分方法，进行制备规模放大，获得呋喃酮对映体光学纯度为90%，酱油酮对映体光学纯度92%。呋喃酮和酱油酮均两对映体香气特征类似，而香气强度差别较大。本实验对映体产品的获得可为评价手性呋喃酮和酱油酮开发的必要性及在食品中应用的可行性提供条件。

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