可视传感器技术快速测定淡水鱼细菌总数

黄星奕，穆丽君，姚丽娅

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

摘 要：以鳊鱼为对象，采用可视传感器检测技术建立一种淡水鱼细菌总数快速测定的方法。首先，利用可视传感器技术采集鳊鱼的气味，用图像处理技术提取传感器阵列与样品气味反应前后的图像颜色差值作为鱼的气味特征信息；同时，采用平板计数法测定细菌总数来评定鱼的新鲜等级；最后，采用最小二乘法(PLS)和联合区间偏最小二乘法(siPLS)建立基于气味信息与细菌总数间高效、精确的鱼类新鲜度判别模型。结果显示，siPLS模型较优，其校正集和预测集相关系数分别达到88.96%和83.29%。结果表明，可视传感器技术能够用于预测鱼的细菌总数，具有方便、快速、无损、成本低等优越性。

关键词：鳊鱼；细菌总数；可视传感器技术；偏最小二乘法；联合区间偏最小二乘法

A Rapid Method for Detecting Aerobic Plate Count in Freshwater Fish by Visual Sensor Technology

HUANG Xing-yi，MU Li-jun，YAO Li-ya

(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract：A new method for rapid detection of aerobic plate count (APC) in Parabramis pekinensis as a freshwater fish was developed based on visualized sensor array technology. Information about the odor of P. pekinensis was extracted using visualized sensor arrays and odor characteristics were obtained as the color difference of images of sensor arrays before and after exposure to the headspace gas of fish samples using image processing technique. Meanwhile, the grades of fish freshness were evaluated through measuring APC by plate counting method. A partial least squares (PLS) model and a synergy interval partial least square (siPLS) model were set up based on the data relationship between odor characteristics from sensor arrays and APC values. The siPLS model gave better results with correlation coefficient of 88.96% for calibration set and 83.29% for prediction set. The results of this study indicate that visual sensor arrays can be used to predict APC as a convenient, fast, low-cost and non-destructive method

Key words：Parabramis pekinensi；aerobic plate count (APC)；visual sensor technique；partial least squares (PLS)；synergy interval partial least square (siPLS)

中图分类号：TP391.41 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0083-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324017

鱼肉组织细嫩，含水量高，酶作用旺盛，加上体内外微生物的作用，使得鱼肉中的蛋白质易水解，鱼肉鲜味下降，产生不良气味继而腐败不能食用。因此，评价鱼肉的新鲜度对鱼的运输仓储、加工过程以及食品安全都有着重要意义[1-4]。目前，评价鱼类新鲜度主要采用一些常规的分析方法，如人工感官评定、理化分析、测定细菌总数等。其中，测定细菌总数是判定食品是否新鲜的重要方法。食品中的细菌总数不仅可以反应出食品被污染的程度，也可反应食品生产中的一般卫生状况，是判定食品新鲜程度的一项重要依据。

可视传感器技术是一种新兴的气敏性无损检测技术，正越来越多地受到国内外学者关注。其具体原理是利用金属卟啉等化学显色剂与待检测气体反应前后的颜色变化对待测气体进行定性和定量分析[5-11]。与理化方法相比，该方法具有无损样本、快速、方便等优点，与模拟人类嗅觉、味觉的电子鼻和电子舌技术相比，具有检测灵敏度高、传感器不受环境的温度和湿度影响、价格较低等优点[12]。鉴于可视传感器技术的诸多优点，本实验以鳊鱼为研究对象，以鳊鱼细菌总数平板计数法测定值为参照，旨在建立基于可视传感器技术的细菌总数快速测定方法，进而建立基于细菌总数的淡水鱼新鲜度评判模型。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳊鱼购自超市，同1批次、体型一致、鳞片较完整、体质量大约为400g。购买后置于装有水的塑料箱中运回实验室。将鳊鱼取出擦干体表，并贴好标签放于4℃恒温冰箱中贮藏待测。每天取15个鳊鱼样本用于可视传感器技术的检测，待检测完以后将这15个样本用于细菌总数的测定。连续测定12d以后，样本腐败严重，不再继续进行实验。

平板计数琼脂(plate count agar，PCA)培养基、磷酸二氢钾(分析纯)、氯化钠(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；JA2003电子天平 上海上平仪器有限公司；PSX智能型恒温恒湿培养箱 宁波莱福科技有限公司；嗅觉可视化系统 江苏大学课题组自主研制。

1.3 方法

1.3.1 细菌总数的测定

采用平板计数法测定鳊鱼的细菌总数，按照GB/T 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》实验操作进行[13]。菌落总数的检测主要采用直接镜检计数法，即鱼肉在经过处理后，采用普通营养琼脂平板在37℃有氧条件下培养48h，在显微镜下计算出生长在平板的细菌菌落总数(aerobic plate count，APC)。每天测试15个鳊鱼样本，每个鳊鱼样本平行测试3次，取平均值作为细菌总数的测定值。测试12d，共180个样本。

1.3.2 传感器制备及检测

鳊鱼在贮藏过程中，由于自身酶以及内外部细菌的作用，体内的蛋白质被水解，产生含有酸臭味的混合气体。本研究主要以胺类、酸类、醇类、芳香烃等具有腐败特性的有机小分子气体为目标气体，共选取16种化合物，制成溶液后固定在C2反相硅胶板上，形成一个4×4的可视传感器阵列，如图1所示[14]。

传感器阵列检测鱼的具体流程为：用氮气冲洗整个管路和反应室中的空气，同时将鳊鱼样本置于样品室中密封集气。待冲洗完毕，再用氮气作为载气，将样品室中的鳊鱼顶空挥发气体载入反应室，与可视传感器阵列上的气敏材料反应。用平板扫描仪获取传感器阵列与鱼的顶空气味反应前后的图像。每天测试15个鳊鱼样本，每个鳊鱼样本平行测试3次，取平均值作为传感器的测定值。测试12d，共180个样本。

1.3.3 数据处理

1.3.3.1 可视化传感器阵列响应信号提取

可视传感器阵列的颜色变化可以通过肉眼直接看到，但是无法直观地进行量化和描述。研究采用计算机图像处理技术对这些颜色变化进行量化、识别。将扫描仪获得的图像先进行简单的图像预处理，再用阈值分割法从背景图像中分割出每个传感器，找到传感器的中心点，最后以中心点为原点，10个像素为半径画圆，获取圆内的R、G、B平均值作为传感器的表征值，将反应前后图像每个传感器点的R、G、B均值作差，所得的差值作为传感器的响应信号。整个处理过程在Matlab 7.0环境下运行[15]。

1.3.3.2 偏最小二乘法

偏最小二乘回归(partial least square，PLS)是一种多元统计数据分析方法。具体步骤为：设因变量Y和自变量集合X,X=[X1,X2…Xn]。为研究因变量与自变量间的统计关系，观测m个样本点，则构成m×n的观测矩阵X=[X1,X2…Xn]m×n。从矩阵X中提取综合X最多的变异信息且最能解释Y的t1(t1为X1,X2…Xn的线性组合)成分，再实施X、Y分别对t1的回归，若回归方程精度高则算法终止。否则，利用t1解释X后的残余信息进行第2轮的成分提取，反复迭代，达到较满意的精度为止。若对X共提取了k个成分(t1,t2…tk)，PLS回归通过Y对t1,t2…tk后，再表达成Y关于原变量X的回归方程[16]。

1.3.3.3 联合区间偏最小二乘法

联合区间偏最小二乘法(synergy interval partial least square，siPLS)是Lars Norgaard于2000年提出的一种变量筛选法的改进，是用来消除信息的冗余的一种方法。具体步骤为：先对原始数据进行预处理(如排序)，建立基于全局变量的PLS模型；再将所有变量划分为多个等宽的子区间，设为n个，在n个子区间上分别建立PLS模型，以交互验证均方根误差(root mean square error of cross validation，RMSECV)衡量每个模型的精确度，取出精度较好的前m个模型所对应的子区间；最后建立基于这m个子区间的PLS模型，同样以RMSECV判断模型的精确度[17]。

1.3.3.4 PLS与siPLS模型比较标准

通常用以下3个值作为模型的评价指标来判断模型的可行性、预测能力以及稳定性。1)交互验证均方根误差：该指标主要用于评价某种建模方法的可行性及所建模型的预测能力；2)预测均方根误差(root mean squared error of prediction，RMSEP)：即模型对预测集样本的预测均方根误差，主要用于评价所建模型对外部样本的预测能力。RMSEP越小，则表明模型对外部样本的预测能力越高，反之预测能力越低；3)相关系数(correlation coefficient，R2)：或称平方相关系数，用于考察样本的预测值和实测值之间的相关程度，R2越接近于1，则说明两者的相关程度越好，训练集和预测集的相关系数分别表示为RC和RP。总之，模型的RC和RP越高，RMSECV和RMSEP越低，模型性能就越好。

2 结果与分析

2.1 鳊鱼细菌检测

据水产行业标准以及相关文献，常将鱼类新鲜度等级的菌落总数划分为：APC＜106CFU/g，样本为一级品；APC值在106～107CFU/g之间，样本为合格品；APC＞107CFU/g，表明样本已腐败，为不合格品[18-19]。鳊鱼在低温贮藏条件下，不同时期的APC也有所不同。对每天的15个鳊鱼样本的APC取平均值，并计算出每天15个样本的菌落平均值方差，如表1所示。从表1可知，鳊鱼在4℃条件下贮藏4d，所测得的APC＜106CFU/g，这期间的样本为一级品；待样本存放到第8天时，APC的数目逐渐增加，这时样本为合格品；贮藏9d以后，样本中的细菌含量大大增加，APC值变大，样本已经完全腐败，属于不合格品。

表 1 4℃贮藏条件下鳊鱼APC值的变化

Table 1 Changes of Parabramis pekinensis’s APC stored at 4 ℃

2.2 鳊鱼可视传感器检测

图2为鳊鱼在4℃贮藏条件下1～12d的传感器响应特征图像，由于鳊鱼在不同贮藏期内的挥发性气味的种类以及含量不同，传感器的响应强度也不一样，故所得的特征图像差异较大。

由图2可知，当鳊鱼贮藏1～4d时，传感器的响应强度较弱，但是阵列上化合物的响应呈增强趋势，说明能与传感器阵列发生反应的胺类，含硫类化合物以及鱼体内外的微生物较少，该时期的鳊鱼仍处于新鲜期；5～8d时，传感器对鳊鱼的挥发气味敏感性增加，颜色变化较为明显，说明鱼体内的一些蛋白质以及烃类化合物开始水解，一些含氮、胺、硫类化合物逐渐增多，腐败性细菌开始滋生，鱼体逐渐产生腐败气体；9～12d时，传感器的颜色变化十分明显，部分传感器阵列的响应由弱到强，传感器阵列能够与鳊鱼的挥发气味发生强烈反应，是由于鱼体内部的酶以及体内外微生物的作用，鱼体中的有机化合物逐渐被水解，含氮、硫的腐败性臭味气体急剧增加，传感器颜色变化十分明显。

2.3 PLS建模

建立PLS模型时，首先要确定建立模型的因子数。这是因为，若因子数太少，模型过于简单，则对预测样本的预测精度低。而因子数过多，模型过于复杂，容易使模型过拟合，也会降低精度。由图3可知，当主成分数取11时，RMSECV最小，模型最优。PLS模型预测值与实测值之间的相关关系如图4所示。校正集的RC和RMSECV分别为0.8711、1.33，预测集的RP和RMSEP分别为0.8323和1.54。PLS模型的校正集和预测集的准确率较高，说明可视传感器阵列的响应信号与APC间相关性较高。

图 3 模型的因子数对RMSECV的影响

Fig.3 Effect of the number of PCs on RMSECV

a.校正集

b.预测集

图 4 PLS模型预测值与实测值之间的散点图

Fig.4 Scattered point maps of measured value versus RGB value for predicting areobic plate count by PLS in calibration (a) and prediction (b) set

2.4 siPLS建模

区间3、4、7、10分别对应11～15、16～20、31～35、44～48之间的变量。

图 5 联合区间偏最小二乘模型选择的最佳子区间

Fig.5 Optimal spectral region selected by siPLS within the intervals
3 , 4 , 7 and 10

为建立精确度高的基于鳊鱼细菌菌落总数的siPLS模型，本研究将整个变量区域划分为不同个数的子区间，并尝试联合多个子区间建模，用RMSECV来评价各个模型的性能。最终将整个变量区域划分为10个子区间，取主成分数为6，并采用第3、4、7、10区间组合时，RMSECV最小，此时所建的模型最优。

由图5可知，最能表征鱼的特征气味信息的传感器阵列上的敏感材料点为(1,1)、(1,2)、(1,3)、(1,4)、(3,3)、(3,4)、(4,1)、(4,2)、(4,3)、(4,4)。

a.校正集

b.预测集

图 6 siPLS模型的预测值与实测值之间的散点图

Fig.6 Scattered point maps of measured value versus RGB value for predicting areobic plate count by siPLS in calibration (a) and prediction (b) set

由图6可知，校正集的RC和RMSECV分别为0.8896、1.23，预测集的RP和RMSEP分别为0.8329和1.56，结果表明siPLS的模型精度高，且可视传感器阵列的响应信号与APC有较好的相关性。

与PLS模型相比，siPLS模型的RC和RP分别提高了1.85%、0.06%，RMSECV下降了0.1，总体精度高于PLS模型，且模型得到了很大的简化。这应该是与全变量相比，siPLS方法降低了信息冗余的缘故。由于APC表征了食品新鲜度的不同等级，因此，预测出鱼的APC值，进而可评价出鱼的新鲜度。

3 结 论

本研究利用可视传感器技术检测鳊鱼，提取传感器阵列反应前后的颜色信息与可表征鱼新鲜度等级的APC分别建立了PLS和siPLS模型。比较两模型可知，siPLS模型较简化且更优，模型的训练集和预测集的正确率较高。结果表明：随着鱼新鲜度的下降，APC值会不断增加，鱼体也会产生不同的气味信息；并且，传感器所得的气味颜色信息与APC的相关性较大，基于可视化传感器技术的siPLS判别模型可以快速、精确地预测鱼贮藏期间APC的变化。可视传感器技术能够简便、高效、无损地检测鱼的新鲜度，为生产加工过程中快速评价鱼的新鲜度提供新方法。

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