实时荧光PCR法检测食品中鸭肉成分

程 欣，何玮玲，黄 明*

(南京农业大学食品科技学院，食品安全与营养协同创新中心，江苏 南京 210095)

摘 要：以鸭肉细胞核中基因序列(IL-2)为目标序列，设计特异性引物和TaqMan探针，设计并构建扩增内标，针对内标设计TaqMan探针，通过对聚合酶链式反应(PCR)反应体系和反应条件的优化，建立用于检测食品中鸭肉成分的添加有扩增内标的的荧光PCR方法。通过扩增曲线和Ct值分析该方法的特异性、检测限和灵敏度。结果表明：TaqMan探针实时荧光PCR法具有很高的特异性，所建立的方法能够检测出0.5ng的鸭组分DNA，灵敏度可达0.1%。应用该方法对市售38份样本进行抽样检测，结果令人满意。

关键词：细胞核基因；扩增内标；实时荧光聚合酶链式反应；鸭肉

Establishment and Application of Fluorescent Real-Time PCR for the Detection of Duck Meat in Foods

CHENG Xin，HE Wei-ling，HUANG Ming*

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, College of Food Science and Technology,

Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：Fluorescent real-time PCR system for the assay of duck meat in foods was established on the basis of a pair of primers and the TaqMan probe specific for duck was designed according to the sequence of duck nuclear gene (IL-2). We also designed and established an internal amplification control (IAC) and TaqMan probe for IAC. Results showed that the specificity of TaqMan real-time PCR was reliable and it could detect the presence of duck meat even when the concentration of DNA was reduced to 0.5 ng. The sensitivity of this method was 0.1%. Its accuracy was verified with 38 food samples from the market.

Key words：nuclear DNA；internal amplification control；fluorescent real-time polymerase chain reaction；duck meat

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0092-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324019

近年来，肉品的质量安全问题已经成为全社会关注的热点话题。在经济利益的驱使下，一些不法分子为牟取暴利而掺杂使假，将相对廉价的鸭肉、猪肉等深加工后冒充牛羊肉进行销售[1-2]，这些行为不仅损害牛羊产品质量，对穆斯林产生了巨大伤害，还极可能引入过敏原危害消费者健康，也会对牛羊产品在国际上的声誉造成损害，2013年欧洲多国出现的“马肉风波”为我们敲响了警钟。

以往人们通常依靠感官和经验鉴别肉的种类，随着现代分子生物学的发展，逐步形成了分别以蛋白质检测与核酸检测为基础的方法体系。近几年来，实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)以其高特异性、高灵敏性、无污染和可定量等优点，越来越多地应用于食品中的肉类鉴别。实时荧光PCR是利用PCR反应体系中荧光信号的变化对产物生成进行实时监测的技术，它不仅省去了凝胶电泳的繁琐操作，减少了假阳性的发生率，还可以避免实验过程中溴化乙锭对人体的潜在危害。目前应用最广泛的实时荧光PCR技术包括两类：利用双荧光标记探针的荧光基团解离产生荧光强度变化的TaqMan实时荧光PCR，以及利用染料分子插入双链DNA产生荧光变化的SYBR Green实时荧光PCR。其中TaqMan实时荧光PCR技术因具有良好的特异性而得到广泛应用[3-6]。

目前已有大量应用实时荧光PCR进行物种鉴别的报道[7-9]，李进波等[10]根据鲑亚科鱼类生长激素基因保守序列设计特异性引物和探针，建立了一种鉴定食品中鲑亚科鱼类成分的实时荧光PCR方法。麻丽丹等[11]采用实时荧光定量PCR方法成功对食品中的花生和芹菜成分进行了检测。Fajardo等[12]应用实时PCR对混合肉中的鹿肉进行了鉴别，并成功对其进行了定量分析。Chisholm等[13]用实时PCR鉴别了马肉和驴肉。Koppel等[14]基于细胞核中DNA成功建立了检测牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉的多重荧光定量PCR方法。本研究基于鸭的细胞核基因的特异性位点设计引物和探针，同时人工构建与靶基因同源性极低的扩增内标(internal amplification control，IAC)，通过优化扩增体系，旨在建立添加有扩增内标的食品中鸭肉成分的荧光PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭肉、鸡肉、驴肉、牛肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米均购于南京超市。

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司；Premix Ex Taq酶 宝生物工程(大连)有限公司；引物和探针合成、人工全基因合成由上海辉睿生物科技有限公司完成；DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

MLX-206迷你离心机 美国Crystal公司；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MB-102恒温振荡金属浴 杭州博日科技有限公司；NanoDrop-2000微量核酸蛋白分析仪 美国热电公司；7500 Real-Time PCR扩增仪 美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的制备

按照DNA提取试剂盒的说明书进行操作。50mg样品(鸭腿、鸡腿、驴肉、牛肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米)的总DNA均溶解于100μL TE缓冲液中，利用核酸蛋白分析仪检测DNA质量浓度和纯度。

1.3.2 引物与探针的合成

根据GenBank中已发表的鸭(登录号：HQ008784.1)基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物和探针，再将引物和探针序列在NCBI网站中进行BLAST分析比较和评估，保证引物与探针的特异性。使用荧光基团FAM作为探针的发光基团。引物和探针序列、Tm值与扩增片段大小见表1。

表 1 引物和探针DNA序列

Table 1 DNA sequences of the primers and probes used in this study

1.3.3 TaqMan探针实时荧光PCR法的特异性

1.3.3.1 TaqMan探针实时荧光PCR法反应体系及反应条件

反应采用20μL体系：Premix Ex Taq酶(2×)10μL，PCR正向引物(10μmol/L)0.4μL，PCR反向引物(10μmol/L)
0.4μL，探针0.8μL，Rox Reference DyeⅡ染液(50×)0.4μL，DNA模板2.0μL，灭菌蒸馏水6.0μL。反应条件为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。

1.3.3.2 TaqMan探针实时荧光PCR法特异性分析

以1.3.1节中提取出的鸭肉、鸡肉、驴肉、牛肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米的DNA为模板，按照1.3.3.1节的反应条件进行TaqMan探针实时荧光PCR特异性实验。

1.3.4 扩增内标的构建

用软件随机生成一段DNA序列，将其在NCBI中比照，若没有出现与之同源的真核生物DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上鸭目标片段的引物序列，从而形成鸭目标DNA的扩增内标DNA序列。将扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段连接载体pMD19-T Simple，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，测定其在260nm和280nm波长处的吸光度，计算质粒质量浓度，－20℃保存备用，菌液于甘油管中于
－70℃保存。

1.3.5 TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测限

1.3.5.1 基因组DNA检测限分析

将提取的鸭肉DNA模板原液(质量浓度为250ng/μL)进行梯度稀释，即250、25、2.50、0.25ng/μL和0.025ng/μL 5个质量浓度梯度，采用优化的反应体系考察其检测限。该实验重复3次，每次分别设3个平行，以Ct值小于36为阳性判别标准。

1.3.5.2 加有扩增内标和鸭DNA的二重荧光定量PCR反应体系及反应条件

反应采用20μL体系，反应体系包括：Premix Ex Taq酶(2×)10μL，PCR正向引物(10μmol/L)0.4μL，PCR反向引物(10μmol/L)0.4μL，探针(鸭)0.8μL，探针(内标)0.8μL，Rox Reference DyeⅡ染液(50×)0.4μL，DNA模板2.0μL，内标模板2.0μL，灭菌蒸馏水3.2μL。反应条件为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。

1.3.5.3 扩增内标对检测限的影响

以1.3.5.1节中所得的最低检测限为鸭模板量评价扩增内标对检测体系检测限的影响。将含有扩增内标的质粒原液进行10倍梯度稀释，采用优化的反应体系进行二重荧光定量PCR，考察内标的添加量对基因组DNA检测限的影响。

1.3.6 重复性实验

依照1.3.5.2节对随机抽取的3个质量浓度均为100ng/μL的鸭肉DNA进行荧光PCR反应，实验分3次进行，每次分别设3个平行，考察该体系的稳定性。

1.3.7 TaqMan探针实时荧光定量PCR法的灵敏度

将鸭肉粉末与牛肉粉末以一定比例混合，制成鸭肉含量分别为20%、10%、5%、1%、0.1%和0%的混合肉样品，提取各组DNA，依照1.3.5.2节的反应体系对该方法的灵敏度进行分析，实验分3次进行，每次分设3个平行。

1.3.8 抽样检测

利用本研究建立的鸭TaqMan探针实时荧光PCR方法对市场上销售的38份牛肉制品进行检测，所得Ct值小于36判断为阳性，Ct值大于36判断为阴性。

2 结果与分析

2.1 样品总DNA的提取

使用试剂盒法对提取肉中的总DNA，利用核酸蛋白分析仪检测DNA质量浓度。结果表明这些样品DNA符合荧光PCR检测的条件。

2.2 TaqMan探针实时荧光PCR法的特异性

表 2 鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR特异性检测结果

Table 2 The specificity of TaqMan real-time PCR identification

注：—.未检测出。表4同。

由表2可知，鸭肉DNA样本经过TaqMan探针实时荧光PCR扩增在36个循环内有扩增，而其他10种DNA样本及阴性对照组在40个循环内没有出现实时扩增曲线，可判断为阴性结果。

2.3 TaqMan探针实时荧光PCR法的检测限

将提取的鸭肉DNA模板原液(质量浓度为250ng/μL)进行梯度稀释，取各质量浓度DNA进行TaqMan探针实时荧光PCR，扩增曲线见图1，得到标准曲线斜率为－3.53；相关系数R2为0.99；根据公式：扩增效率(E)=10-1/斜率－1，得E=91.99%，在可接受区间80%～105%内。

1～5. DNA质量浓度分别为250、25、2.5、0.25ng/μL和0.025ng/μL。

图 1 鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR法检测限分析扩增曲线

Fig.1 Amplification curves for the limit of detection of real-time PCR

以Ct值小于36为阳性判别标准，由表3可知，当荧光定量PCR体系中模板量为0.5ng时，鸭DNA模板检测Ct值为(34.62±0.001)，100%为阳性，模板量为0.05ng时结果全为阴性。可以初步确定该荧光定量PCR检测体系的检测限为0.5ng。

表 3 鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR法检测限分析结果

Table 3 The limit of detection of TaqMan real-time PCR

表 4 二重TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测限分析结果

Table 4 The limit of detection of duplex TaqMan real-time PCR

以所得的最低检测限0.5ng为鸭模板量评价扩增内标对检测体系检测限的影响。将扩增内标原液进行10倍梯度稀释作为体系中内标的添加量，进行二重荧光定量PCR。由表4可知，当用于检测鸭肉成分的PCR体系中分别含有4.5×104拷贝/μL的扩增内标时，对检测体系最低检测限Ct值影响小于0.2，此时扩增内标的Ct值为(28.75±0.26)。

2.4 重复性实验

表 5 二重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测法重复性实验

Table 5 The repeatability of duplex TaqMan real-time PCR

由表5可知，3个个体来源的DNA样品的3次独立重复实验的Ct值并无显著差异，说明检测结果重复性好。

2.5 TaqMan探针实时荧光PCR法的灵敏度

1～5.鸭肉含量分别为20%、10%、5%、1%和0.1%。

图 2 鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR法的灵敏度

Fig.2 Amplification curves of duck DNA showing thesensitivity of
real-time PCR

由图2可知，鸭肉含量为20%、10%、5%、1%、0.1%和0%的样品，所得Ct值分别为(24.60±0.05)、(26.53±0.16)、(30.58±0.17)、(31.22±0.25)、(34.21±0.21)，0%时无有效检测信号。

图 3 灵敏度分析中内标扩增曲线

Fig.3 Amplification curves of IAC indicating the sensitivity of real-time PCR

由图3可知，内标Ct值为(28.50±0.15)。图2、3结果表明，当鸭肉含量为0.1%时扩增良好，即该法灵敏度可达0.1%，能满足实际检测需要。

2.6 抽样检测

表 6 市售牛肉制品的鸭肉成分荧光PCR检测结果

Table 6 Results obtained by fluorescent PCR for duck meat in commercial beef products

由表6可知，所抽牛肉制品中掺有鸭肉的不合格率为13.16%。

3 讨论与结论

从20世纪90年代末至今，大量研究[15-18]报道了应用免疫学方法对食品中各种动物源性成分的鉴定技术，但商品化的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒与免疫层析试纸条等免疫学鉴定技术存在着特异性较低、受样品基质影响大的局限。而且肉制品中的特征蛋白质会随着不同加工条件而发生变性，因此需要针对不同变性程度的抗原设计特异性抗体，食品的加工程度极大地影响着免疫检测试剂盒的选择性与灵敏度[15-16]。此外，通过十二磺基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管凝胶电泳和等电聚焦电泳等电泳技术对肉制品提取物中的蛋白质分布特征进行定性、定量分析，从而鉴别肉类的方法也屡见报道[19-20]。但是，肉中的蛋白质种类多、含量不一，致使基于蛋白质的鉴定技术有易产生假阳性结果的缺点。

DNA的热稳定性与酸碱稳定性均优于蛋白质，以动物种属间遗传信息的差异作为物种鉴别的检测靶点具有特异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，已逐渐成为食品中肉类成分鉴别的主流方法[21-22]。近几年基于时效性和准确性上的优势，实时荧光PCR技术已经逐步取代了一般PCR方法，成为对动物源性成分进行定性检测最常用的分子生物学方法[23-26]。

国标法进行动物源性成分检测的方法必须进行酶切、电泳和DNA测序才能区分各成分，耗时长、步骤相对繁琐[27]，而本研究建立的实时荧光PCR检测方法，不需要经过以上多个步骤，通过特异性引物和探针在进行PCR过程中检测荧光增量即可得知检测结果，检测效率大大提高。

本实验结果表明，TaqMan探针实时荧光PCR特异性较好，只有鸭肉DNA有扩增，重复性好，结果稳定。可靠地检测鸭肉成分的PCR体系必须建立在合适的基因片段选择上，所选的基因必须有种属特异性强、种内变异性小的特点。本实验所选择的目标基因为细胞核基因中的单拷贝序列，最低可检测出0.5ng的DNA，灵敏度可达0.1%，已经可以满足实际需要。由于PCR过程很容易受到一些不明因素的影响，产生假阴性结果，因此本实验加入了内标来避免假阴性的产生。由于内标与目标DNA共用引物，故需要找到内标最适浓度，结果表明当加入的内标浓度为4.5×104拷贝/μL时，不会对鸭DNA的Ct值产生显著影响。

当前，动物源性成分检测受到越来越多的关注，尤其是在饲料和食品等领域，对进出口饲料进行牛羊源性成分检测，是防止疯牛病、痒病等动物性疾病通过贸易途径传入我国的重要手段[27]。而目前市场上销售的肉干、肉肠和肉丸等，由于添加了大量香料，消费者进食时很难分辨是否为某种肉类制品，且不同肉类制品的价格差异又很大，如果缺乏相关的检验监管，不法商人就有鱼目混珠的机会。本实验所建立的实时荧光定量PCR方法是防止商家掺假牟利的有效手段。

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