双向电泳技术分离燕窝水溶性蛋白

郭丽丽1,2，吴亚君1，刘鸣畅1，王 斌1，韩建勋1,2，葛毅强2,3，陈 颖1,*

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；

3.中国农村技术开发中心，北京 100045)

摘 要：为研究燕窝功效成分以及建立燕窝真伪检测和质量分级体系，采用双向电泳技术分离了燕窝水溶性蛋白。以印度尼西亚苏门答腊岛毛燕为材料，从提取溶剂、提取条件、水化上样缓冲液和分离胶体积分数4个方面对燕窝蛋白双向电泳技术进行优化。结果表明：以超纯水作为提取溶剂，60℃静置提取6h，以8mol/L尿素、4g/100mL CHAPS、65mmol/L DTT、0.2%(体积分数)Bio-Lyte 4/6 Ampholyte、0.1% Bio-Lyte 5/8 Ampholyte、0.001g/100mL溴酚蓝组成的溶液作为水化上样缓冲液，采用8%的分离胶体积分数可获得高分离度、高重复性的燕窝蛋白双向电泳图谱。同时，采用4个不同的燕窝样品对所建立的方法进行验证，证实了方法的可靠性。

关键词：燕窝；蛋白质；提取；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；双向电泳

Application of Two-Dimensional Electrophoresis Technology in Separation of
Water-Soluble Protein from Edible Bird’s Nest

GUO Li-li1,2，WU Ya-jun1，LIU Ming-chang1，WANG Bin1，HAN Jian-xun1,2，GE Yi-qiang2,3，CHEN Ying1,*

(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China；

2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；

3. China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

Abstract：In order to explore the functional components in edible bird’s nest (EBN) and establish a system for the identification of EBN adulteration and quality classification, two-dimensional electrophoresis (2-DE) was adopted to separate water-soluble protein from EBN. EBN samples from the Indonesian island of Sumatra were analyzed by 2-DE and the assay was optimized with respect to extraction solvent, extraction conditions, rehydration buffer composition and resolving gel concentration. The results showed that 2-DE map of EBN protein with high resolution and good reproducibility could be obtained under the conditions: 6 h of extraction at 60 ℃ using ultrapure water as extraction solvent, , rehydration buffer composed of 8 mol/L urea, 4 g/100mL CHAPS, 65 mmol/L DTT, 0.2% Bio-Lyte 4/6 Ampholyte, 0.1% Bio-Lyte 5/8 Ampholyte and 0.001 g/100mL bromophenol blue, and separation gel concentration of 8%. Furthermore, four different EBN samples were separated successfully by the established 2-DE technology, showing the reliability of the developed method.

Key words：edible-bird’s nest；protein；extraction；SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)；two-dimensional electrophoresis (2-DE)

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0097-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324020

燕窝是由金丝燕及多种同属燕类用唾液与绒羽等混合凝结所筑成的巢窝，自古以来一直被认为是一种名贵中药和珍稀食品，大量研究证明燕窝中的蛋白质，尤其是占主成分地位的糖蛋白具有多种药理功效[1-7]。利用蛋白质组学对燕窝中蛋白质的种类及功能进行探讨对于从分子水平揭示燕窝的功效有很重要的意义。此外，针对目前燕窝可能存在的掺假掺杂现象[8-12]，通过开展燕窝蛋白质组研究，有助于建立燕窝真伪鉴别以及质量分级的方法，为监管部门整顿市场、规范行业行为提供技术支撑。Wu Yajun等[13]采用蛋白质组中的双向电泳技术，从燕窝样品中检测到含量为10%的银耳掺假物，为蛋白质组在燕窝真伪鉴别中的可应用性提供了直接证据。

双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是蛋白质组学研究的核心技术之一，而样品的制备是决定2-DE高分辨率和良好重复性的关键环节。由于燕窝是唾液腺分泌的胶质唾液，其中含有的大量糖类结合物质会严重影响燕窝蛋白质提取的效率和提取量，从而妨碍燕窝蛋白质双向电泳研究工作的有效开展。因此，建立快速、有效的燕窝蛋白质提取方法和分离度、重复性好的双向电泳技术是进行燕窝蛋白质组学研究的前提与保障。

本研究以苏门答腊岛毛燕为材料，从提取溶剂、提取条件、水化上样缓冲液和分离胶体积分数4个方面对燕窝水溶性蛋白质提取以及双向电泳条件进行优化，旨在建立一种燕窝蛋白质的双向电泳方法，为燕窝蛋白质组学研究的开展提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏门答腊岛毛燕样品由福建出入境检验检疫局提供；印尼爪哇金丝燕、印尼爪哇官燕、马来西亚屋燕样品由暨南大学白卫滨老师提供；印尼白燕样品由广东出入境检验检疫局提供；蛋白酶抑制剂混合片(EDTA-free) 瑞士Roche公司；蛋白纯化试剂盒(2-D Cleanup Kit)、预染蛋白分子质量标准(prestained SDS-PAGE standards，broad range)、非预染蛋白分子质量标准(SDS-PAGE molecular weight standards，broad range)、两性电解质(Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，Bio-Lyte 5/8 Ampholyte)、IPG胶条(7cm，pH4.7～5.9) 美国Bio-Rad公司；BCA蛋白定量试剂盒 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

舒适型恒温混匀仪、5418R小型台式冷冻离心机、Concentrator plus真空浓缩仪 德国Eppendorf公司；Protean IEF Cell等电聚焦仪、Mini Protean 3 Cell蛋白电泳仪、Versa Doc Imaging System凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Labsystems Multiskan Spectrum全波长酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 燕窝蛋白质的提取及条件优化

1.3.1.1 蛋白质的提取

取经液氮研磨后去净表面羽毛的毛燕燕窝样品粉末500mg置于50mL离心管中，加入约1/4片蛋白酶抑制剂，用10mL提取溶剂(分别为a：超纯水；b：50mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH8.0)；c：超纯水＋0.5g/100mL CHAPS＋
50mmol/L DTT；d：50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)＋0.5g/100mL CHAPS＋50mmol/L DTT)溶解，分别在4℃静置提取12h、25℃静置提取12h、60℃静置提取6h这3个提取条件下提取燕窝蛋白；12000×g离心10min后取上清液，用真空旋转浓缩仪将蛋白溶液浓缩至100μL；利用蛋白纯化试剂盒去除蛋白浓缩样品中的盐离子并将其沉淀，从而最终获得燕窝蛋白。

1.3.1.2 蛋白质含量的测定

用适量体积的SDS-PAGE上样缓冲液在20℃条件下重溶燕窝蛋白样品1～2h，12000×g离心5min后取上清液，利用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白含量进行测定。燕窝水溶性蛋白提取量按下列公式进行计算：

蛋白提取量/μg = BCA法测得的蛋白含量/(μg/μL)×重溶蛋白缓冲液体积/μL

1.3.1.3 SDS-PAGE电泳

参照文献[14]中相关内容进行。其中分离胶体积分数为10%，浓缩胶体积分数为5%；每孔上样体积20μL，上样量10μg。电泳条件：10mA 30min；20mA至溴酚蓝前沿距胶底约0.5cm。凝胶经固定后用考马斯亮蓝法染色，脱色完成后用凝胶成像系统拍照。

1.3.1.4 结果判断

选择蛋白提取量较高、电泳图谱清晰、条带分离度好、蛋白种类丰富的溶液作为最佳提取液。

1.3.2 燕窝蛋白质的双向电泳及其优化

1.3.2.1 水化上样缓冲液的优化

蛋白质的水化：按照1.3.1节建立的蛋白质提取方法提取燕窝蛋白，用3种适量体积的水化上样缓冲液(表1)分别在20℃条件下重溶1～2h后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，调整蛋白上样量为80μg。

双向电泳(2-DE)：参照文献[15]中相关内容进行。采用7cm、pH4.7～5.9的IPG胶条，等电聚焦程序为：50V水化12h；250V，线性，除盐，30min；500V，快速，除盐，30min；4000V，线性，升压，3h；4000V，快速，聚焦，16000V•h；500V，保持，20h。第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的凝胶，电泳条件为：10mA 30min；20mA电泳至溴酚蓝前沿距胶底约0.5cm。凝胶经固定后用考马斯亮蓝法染色，脱色完成后用凝胶成像成像系统拍照。

最后选择2-DE图谱清晰、分离度好的溶液作为最佳水化液。

表 1 3种水化液组成

Table 1 Composition of three different rehydration buffers for EBN

1.3.2.2 凝胶体积分数的优化

参照1.3.2.1节中蛋白质的水化方法，以优化后的上样缓冲液作为水化液，进一步对第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离胶体积分数(分别为12%、10%、8%)进行了优化；双向电泳方法及结果判断均参照1.3.2.1节。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂及提取条件对燕窝蛋白提取效果的影响

A. 4℃静置提取12h

B. 25℃静置提取12h

C. 60℃静置提取6h

M.预染蛋白分子质量标准(分子质量从上到下依次为201、114、74、48、34、27kD)；a1～a3.超纯水提取蛋白样品的3次重复；b1～b3. 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)提取蛋白样品的3次重复；c1～c3.含0.5g/100mL CHAPS、50mmol/L DTT的超纯水提取蛋白样品的3次重复；d1～d3.含0.5g/100mL CHAPS、50mmol/L DTT的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)提取蛋白样品的3次重复。

图 1 4种提取溶剂在不同提取条件下3次重复提取所得燕窝蛋白的SDS-PAGE电泳图

Fig.1 SDS-PAGE of EBN protein extracted three times with four solvents at different extraction conditions

由图1可知，在3个不同提取条件下，均以超纯水为提取溶剂所得的燕窝蛋白提取量最高(分别可达107.29、98.07、304.57μg)，且电泳图谱重复性良好；其中又以60℃静置提取6h条件下所得的蛋白条带最清晰、蛋白种类最丰富(图1C方框所示)。相比之下，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)所得的蛋白提取量则偏低(分别仅为超纯水的1/2、3/5和2/5)；其电泳图谱中条带的清晰度随提取温度的升高而减低，在4℃时条带较清晰，25℃条件下较弱，60℃时条带几乎不可见。含0.5g/100mL CHAPS、50mmol/L DTT的超纯水及含0.5g/100mL CHAPS、50mmol/L DTT的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)提取所得的蛋白提取量与50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)相当，且蛋白条带不清晰、杂质较多。

总体来说，以超纯水为提取溶剂，在3个不同的提取条件下均能得到重复性、分离度良好的燕窝蛋白，其中60℃静置提取6h可以得到更多的高分子质量蛋白；而50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)提取的重复性欠佳，且实验表明使用该缓冲液提取燕窝蛋白时适宜在低温条件下进行；其他两种提取溶剂则不适用于燕窝蛋白质的提取。综合考虑蛋白提取量和SDS-PAGE电泳图谱结果，最终选取60℃静置提取6h作为较适宜的燕窝水溶蛋白提取方法。

2.2 水化上样缓冲液对燕窝蛋白双向电泳图谱的影响

采用前期确定的燕窝蛋白的最佳提取方法，即在60℃静置提取6h获得燕窝蛋白后，采用3种不同的水化上样缓冲液重溶燕窝蛋白，并比较了不同水化缓冲液对燕窝蛋白双向电泳图谱的影响。

由图2可知，水化液Ⅱ和Ⅲ所得的2-DE图谱较为相似，酸性端均有蛋白成团集聚的现象，其中又以水化液Ⅱ所得的图谱背景低、蛋白点分离度更好；而水化液Ⅰ得到的2-DE图谱最简单，酸性端的蛋白集聚现象已经消失，背景最低，蛋白点虽然较少且集中在40kD以上，但整体分离度及图谱质量最佳。考虑到后期要进行燕窝蛋白点的质谱鉴定及不同燕窝样品之间的差异蛋白质组的研究，最终选取背景最低、蛋白点分离度最佳、图谱整体质量最好的水化液Ⅰ作为最佳的水化上样缓冲液。

A.水化液Ⅰ

B.水化液Ⅱ

C.水化液Ⅲ

M.预染蛋白分子质量标准(分子质量从上到下依次为200、116、97、66、45、31、22kD)。

图 2 水化缓冲液成分对燕窝蛋白双向电泳图谱的影响

Fig.2 Effect of rehydration buffer composition on 2-DE map of EBN protein

此外，实验也对第一向等电聚焦电泳程序进行了研究，发现增加低压除盐步骤、延长低压除盐时间、改变聚焦能量等对燕窝蛋白2-DE图谱影响不大(图略)。

2.3 凝胶体积分数对燕窝蛋白双向电泳图谱的影响

A. 12%凝胶

B. 10%凝胶

C. 8%凝胶

M.非预染蛋白分子质量标准(分子质量从上到下依次为200、116、97、66、45、31、22、14、6.5kD)。

图 3 凝胶浓度对燕窝蛋白双向电泳图谱的影响

Fig.3 Effect of gel concentration on 2-DE map of EBN protein

由图3可知，12%的凝胶体积分数几乎不能使燕窝蛋白得以分离，减小至10%时的分离效果优于12%，但分离不彻底，而8%凝胶的分离胶在垂直方向上可将燕窝蛋白分离得更好，因此选取8%作为燕窝蛋白分离的最佳凝胶体积分数。

2.4 4个不同燕窝样品的双向电泳结果

A.印尼白燕

B.印尼爪哇官燕

C.马来西亚屋燕

D.印尼爪哇金丝燕

圆圈内表示为3组成串蛋白点。

图 4 4个不同燕窝样品的双向电泳图谱

Fig.4 2-DE maps of four different EBN samples

由图4可知，所建立的燕窝蛋白双向电泳方法可以有效分离不同燕窝样品的蛋白质；同时4个不同燕窝样品的主蛋白均由相似的3组成串蛋白点组成，这说明不同地域来源或出产形态燕窝样品的主要蛋白组分基本一致，但蛋白含量有明显差异。

3 结论与讨论

由于燕窝样品本身的吸水膨胀性及其所含的高含量糖类物质，使得燕窝蛋白质的提取效率和蛋白提取量不是很理想，一些学者也开展了针对燕窝蛋白质提取方面的研究。综观这些研究报道，内容涉及对提取温度[16-18]、提取时间[16-18]、提取液组成[16-18]、蛋白纯化[19-20]等某个或某几个因素的优化。本实验在此基础上，进一步综合评价了现有燕窝蛋白提取方法中的3个典型因素——提取温度、提取时间和提取液组成。通过对不同提取条件提取效果的比较，证实60℃静置提取6h即可达到与4℃过夜静置提取12h相似的提取效果，而且大分子质量蛋白组分提取量显著增加，充分表明60℃的高温不仅不会对燕窝蛋白的结构造成破坏，反而此温度可大幅提高蛋白的提取量并缩短提取时间；林洁茹[16]、侯雁[17]等的研究也证实了适当提高水溶液浸提温度有助于缩短提取时间，提高蛋白得率。本实验组还尝试了使用缓冲液或具有轻微裂解成分的溶液提取燕窝蛋白，但发现溶液变得异常黏稠，加大了离心的难度，反而减少了蛋白提取量。

目前，关于燕窝蛋白质双向电泳技术方面的研究报道比较少。黄秀丽等[19]利用液相等电聚焦电泳对经裂解液重溶后的蛋白进行纯化，结果表明该方法可以有效减轻酸性糖蛋白对双向电泳的干扰，但是双向电泳图谱的酸性端仍然有部分集聚成团的蛋白。而本实验建立的燕窝蛋白质双向电泳方法消除了酸性端的蛋白成团集聚现象，由此得到的双向电泳图谱分离度、重复性良好。

硫脲常被用于增加疏水性蛋白的溶解性[21-23]，但在燕窝蛋白的水化过程中，相比较于不含硫脲的水化液，含有硫脲的水化液会导致酸性端蛋白成团集聚，具体原因不明。同时也可以看出，燕窝蛋白的2-DE图谱主要是由分子质量不同的几组成串蛋白点组成，这种现象主要是由于蛋白质的糖基化修饰造成的[24-25]。此外，对几个不同燕窝样品的检测发现其主蛋白成分一致，但蛋白含量有明显差异，有待进一步研究。

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