聚合酶链式反应检测酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因

朱成龙1，李 凯1，杨 芮1，吕 珍1，刘树文1,2,*

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

摘 要：利用聚合酶链式反应(PCR)和多重PCR方法，采用3对特异性引物，检测40株酒酒球菌基因组中是否含有组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)、酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)和鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因)。结果表明：40株酒酒球菌基因组中有33株酒酒球菌含有组氨酸脱羧酶，22株酒酒球菌含有酪氨酸脱羧酶，16菌株含有鸟氨酸脱羧酶。建立的PCR法可快捷、高度特异地检测酒酒球菌中含有的hdc基因、tdc基因和odc基因。

关键词：聚合酶链式反应；乳酸菌；氨基酸脱羧酶基因；生物胺；多重聚合酶链式反应

PCR Method for the Detection of Amino Acid Decarboxylase Gene of Oenococcus oeni

ZHU Cheng-long1，LI Kai1，YANG Rui1，LÜ Zhen1，LIU Shu-wen1,2,*

(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；

2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

Abstract：Biogenic amines are small nitrogenous molecules frequently found in fermented foods. Excessive intakes of biogenic amines have undesirable physiological effect on human bodies. The main biogenic amines in wine are formed through decarboxylation of free amino acids by specific amine acid decarboxylases. polymerase chain reaction (PCR) technique can be used to detect the presence of amine acid decarboxylase gene, and excellent strains without the potential to produce biogenic amines can be screened. We detected the genes responsible for encoding amino acid decarboxylases, including histidine decarboxylase, tyrosine decarboxylase and ornithine decarboxylase, through single and multiplex PCR assays in 40 strains of Oenococcus oeni. The results showed that 33 strains possessed histidine decarboxylase gene, 22 strains possessed tyrosine decarboxylase gene and 16 strains possessed ornithine decarboxylase gene among the 40 tested strains. The PCR method described in this study is a simple and rapid way to detect bacteria with amine acid decarboxylase genes.

Key words：polymerase chain reaction (PCR)；lactic acid bacteria；amine acid decarboxylase gene；biogenic amines；multiplex PCR

中图分类号：Q93.3；Q78 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0110-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324023

生物胺是一类含氮的低分子质量化合物的总称，普遍存在于多种食品中，如葡萄酒、奶酪、发酵肉制品、海鲜等[1-4]。某些生物胺对人和动物的一些生理学功能起着重要的作用，例如体温、胃的蠕动、大脑活动等的控制[5]。但是当人体摄入过量的生物胺时，就会产生一些中毒反应，如头疼、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱、皮肤发红、水肿、腹泻、呕吐等[5-7]。经加热处理，食品中的腐胺可以和亚硝酸盐结合形成具有致癌、致突变、致畸形活性的亚硝胺[8]。因此，控制生物胺在食品中的积累对人体健康非常重要。

生物胺主要是由微生物对氨基酸的脱羧作用产生，包括组氨酸在组氨酸脱羧酶作用下转化成组胺，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶作用下转化成酪胺，鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶作用下转化成腐胺。通过微生物产生生物胺需要具备3个基本条件：1)有足够的游离氨基酸；2)具有氨基酸脱羧酶活性的微生物；3)具有适合微生物生长和氨基酸脱羧酶合成的条件[5]。因此，基因组中具有氨基酸脱羧酶基因的微生物，具有潜在的产生生物胺的能力，在适宜的条件下就可以产生生物胺。

葡萄酒是破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或者葡萄汁经完全或部分酒精发酵后获得的饮料[9]。酒精发酵结束后，几乎所有的红葡萄酒和部分白葡萄酒都需要进行苹果酸-乳酸发酵。Soufleros等[10]对葡萄酒中的生物胺的主成分分析表明，组胺、酪胺和腐胺为葡萄酒中的主要生物胺，它们的含量在酒精发酵之后比较低，而经过苹果酸-乳酸发酵后会有不同程度的升高。酒酒球菌是目前启动葡萄酒苹果酸-乳酸发酵最重要、应用最广泛的乳酸菌。为了保证葡萄酒的食品安全性，必须对产生物胺的酒酒球菌进行检测。

检测产生物胺乳酸菌的方法有很多。传统微生物学方法检测生物胺产生菌是繁琐而不准确，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)作为分子生物学中常用的方法，具有简便、快速、准确等特点，利用特殊的引物，可以检测编码产生氨基酸脱羧酶的基因[11-14]。普通PCR可以在1个PCR反应中检测1个基因，多重PCR可以在同1个PCR反应中同时检测多个基因[11]。

本研究利用PCR和多重PCR的方法，检测实验室保藏的40株酒酒球菌是否含有组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)、酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)和鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因)，以确定这40株酒酒球菌是否具有产生组胺、酪胺和腐胺的潜在特性，以期筛选出不具有3种氨基酸脱羧酶基因的优良酒酒球菌，从而用于启动苹果酸-乳酸发酵。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

标准菌株ATCC 33222(乳酸杆菌(Lactobacillus sp.))、ATCC 367(短乳杆菌(Lactobacillus brevis)) 美国典型菌种保藏中心。其中ATCC 33222为组氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶的产生菌株，ATCC 367为酪氨酸脱羧酶的产生菌株。ATCC 33222作为组胺和腐胺阳性对照菌株，ATCC 367作为酪胺阳性对照菌株。

供试菌株：40株酒酒球菌(Oenococcus oeni)均为西北农林科技大学葡萄酒学院微生物实验室保存。

1.2 培养基

玫瑰红钠琼脂培养基：酵母浸膏20.0g、蔗糖20.0g、水解酪蛋白15.0g、醋酸钾1.0g、VC 1.0g、吡多胺(VB6)33.0μg、混合盐A 20.0mL、混合盐B 5.0mL、蒸馏水1.0L，醋酸调整pH值到5.4。121℃灭菌15min。

混合盐A：KH2PO4•H2O 16.5g、K2HPO3•3H2O 16.5g、蒸馏水100.0mL。

混合盐B：MgSO4•7H2O 8.0g、NaCl 0.4g、FeSO4•7H2O 0.4g、MnSO4•H2O 0.4g、浓盐酸0.1mL、蒸馏水100.0mL。

ATB培养基：蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g、硫酸0.2g、硫酸锰0.05g、盐酸半胱氨酸0.5g、番茄汁250mL、蒸馏水补至1L，pH4.8，121℃高压蒸汽灭菌21min。番茄汁：新鲜成熟番茄在沸水中浸泡去皮，取出压碎后用纱布过滤，将汁液在沸水中煮2h，冷却至室温，然后在10000r/min条件下离心5～10min，取上清液，4℃保存。

改良MRS培养基：胰蛋白胨1%、蛋白胨0.5%、
酵母粉0.5%、牛肉膏0.5%、葡萄糖2.2%、硫酸镁10mL(5.8g/100mL)、硫酸锰10mL(2.5g/100mL)、醋酸钠10mL(50g/100mL)、磷酸氢二钾(K2HPO4)10mL(20g/100mL)、柠檬酸氢二氨10mL(20g/100mL)、吐温80 1g，加蒸馏水至1000mL，pH 6.5～6.6，121℃高压灭菌20min。

1.3 试剂

Taq酶、10×PCR buffer、MgCl2 加拿大Fermentas公司；dNTP mixture 威格拉斯生物技术(北京)有限公司；琼脂糖 西班牙Pharmacia公司；蛋白酶K 德国Roche Diagnostics GmbH公司；RNase A 天根生化科技(北京)有限公司；引物：JVl6HC(5’-AGATGGTAT-TGTTTCTTATG-3’)、JVl7HC(5’-AGACCATACACCATAACCTTG-3’)、TD2(5’-ACTTAGTCAACCATRTTGAA-3’)、TD5(5’-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3’)、AODC1(5’-GMTCGTGAAATYGAARCKG-3’)、16(5’-TACRCARAATACTCCNGGNG-GRTANGG-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂均为分析纯。

1.4 仪器与设备

S1000型梯度PCR仪 美国Bio-Rad公司；Nanodrop1000微量紫外分光光度计 美国Thermo Scientific公司；5417R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；电泳设备、凝胶成像系统 北京科普仪器厂。

1.5 方法

1.5.1 引物的选择

文献[15-19]中利用引物对JV16HC和JV17HC、TD2和TD5、AODC1和16分别作为检测组胺、酪胺和腐胺产生菌的特异引物，均能扩增出特异性的条带，且扩增效率都较高。因此，本研究根据文献[15-19]描述，设计引物并合成，作为检测生物胺产生菌的特异引物。

1.5.2 菌株的活化

酒酒球菌用ATB培养基于26℃条件下活化培养，连续转接两代进行复壮。ATCC 33222用玫瑰红钠琼脂培养基于37℃有氧条件下活化培养，连续转接两代进行复壮。ATCC 367用改良MRS培养基于30℃有氧条件下活化培养，连续转接两代进行复壮。

1.5.3 基因组DNA的提取

采用酚、氯仿提取少量基因组DNA的方法[20]，并在酚、氯仿抽提之前加入3.5μL 10mg/mL的RNase，于37℃温浴1h，可以有效避免RNA污染。取5µL DNA溶液，与2µL 6×Loading buffer混合后上样到1.0%的琼脂糖凝胶上，110V电压条件下电泳40min，用凝胶成像系统观察并记录结果。

1.5.4 基因组DNA质量浓度的测定

采用微量紫外分光光度计测定。以溶解基因组DNA的TE缓冲液为空白校正仪器，取1µL DNA溶液进行质量浓度测定，单位为ng/µL。

1.5.5 PCR扩增反应

PCR反应体系(20µL)：10×PCR buffer 2µL；2.5mol/L
dNTPs 1.6µL；15mmol/L MgCl2 1.2µL；Taq酶0.5U；10mmol/L上、下游引物各0.5µL；模板DNA 10ng；无菌ddH2O补充至20µL。充分混匀后，进行PCR扩增反应。

检测组胺、酪胺产生菌PCR扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性45s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

检测腐胺产生菌PCR扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性45s，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。

1.5.6 双重PCR扩增反应

1.5.6.1 同时检测组胺和酪胺产生菌

双重PCR扩增反应体系(20µL)：10×PCR buffer 2µL；2.5mol/L dNTPs 1.6µL；15mmol/L MgCl2 1.2µL；Taq酶0.5U；JV16HC、JV17HC各0.5µL；TD2、TD5各1µL；模板DNA 10ng；无菌ddH2O补充至20µL。

扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

1.5.6.2 同时检测组胺和腐胺产生菌

双重PCR扩增反应体系(20µL)：10×PCR buffer 2µL；2.5mol/L dNTPs 1.6µL；15mmol/L MgCl2 1.2µL；Taq酶0.5U；JV16HC、JV17HC各1µL；AODC1、16各2.5µL；模板DNA 10ng；无菌ddH2O补充至20µL。

扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

1.5.6.3 同时检测酪胺和腐胺产生菌

双重PCR扩增反应体系(20µL)：10×PCR buffer 2µL；2.5mol/L dNTPs 1.6µL；15mmol/L MgCl2 1.2µL；Taq酶0.5U；TD2、TD5各1µL；AODC1、16各1.5µL；模板DNA 10ng；无菌ddH2O补充至20µL。

扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

1.5.7 三重PCR扩增反应

三重PCR扩增反应体系(20µL)：10×PCR buffer 2µL；2.5mol/L dNTPs 1.6µL；15mmol/L MgCl2 1.2µL；Taq酶0.5U；JV16HC、JV17HC各0.5µL；TD2、TD5各1µL；AODC1、16各1.5µL；模板DNA 10ng；无菌ddH2O补充至20µL。

扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

1.5.8 PCR产物检测

扩增完毕后，取4µL反应液与1µL 6×Loading buffer混合，在2%琼脂糖凝胶中电泳，电压110V。用凝胶成像系统观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的检测

1～15为实验室保藏的15株酒酒球菌。

图 1 部分测试酒酒球菌基因组DNA电泳图

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of some Oenococcus oeni

提取的基因组DNA的A260nm/A280nm值在1.86～2.07之间，DNA质量浓度范围在130～210ng/µL之间，说明提取得到的DNA较纯；如图1所示，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的PCR扩增结果，各样品均在点样孔附近有1条清晰明亮的条带，DNA没有出现降解现象。

2.2 退火温度对PCR扩增结果的影响

2.2.1 退火温度对引物对JV16HC、JV17HC扩增结果的影响

M. 100bp plus DNA Ladder；1～8分别为退火温度44、46、48、50、52、54、56、58℃。图3、4同。

图 2 退火温度对引物对JV16HC、JV17HC PCR扩增结果的影响

Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification by using primer set JVl6HC and JVl7HC

利用阳性对照菌株基因组DNA作为扩增模板，对引物对JV16HC、JV17HC在44、46、48、50、52、54、56、58℃ 8个不同退火温度条件下进行PCR扩增，每个温度两个平行，结果见图2。从图2可以看出，在44～58℃温度范围内，均扩增出1条明亮的特异性条带。因此，引物对JV16HC、JV17HC在44～58℃范围内，扩增效果良好。本实验选择50℃作为检测组胺产生菌的退火温度。

2.2.2 退火温度对引物对TD2、TD5扩增结果的影响

利用阳性对照菌株基因组DNA作为扩增模板，对引物对TD2、TD5在44、46、48、50、52、54、56、58℃ 8个不同退火温度条件下进行扩增，每个温度两个平行，结果见图3。从图3可以看出，在44～58℃温度范围内，均扩增出1条明亮的特异性条带。因此，引物对TD2、TD5在44～58℃范围内，扩增效果良好。本实验选择50℃作为检测酪胺产生菌的退火温度。

图 3 退火温度对引物对TD2、TD5 PCR扩增结果的影响

Fig.3 Effect of annealing temperature on PCR amplification by using primer set TD2 and TD5

2.2.3 退火温度对引物对AODC1、16扩增结果的影响

利用阳性对照菌株基因组DNA作为扩增模板，对引物对AODC1、16在44、46、48、50、52、54、56、58℃ 8个不同退火温度条件下进行扩增，每个温度两个平行，结果见图4。从图4可以看出，在44～58℃温度范围内，均扩增出1条明亮的特异性条带。因此，引物对AODC1、16在44～58℃温度范围内，扩增效果良好。本实验选择50℃作为检测腐胺产生菌的退火温度。

图 4 退火温度对引物对AODC1、16 PCR扩增结果的影响

Fig.4 Effect of annealing temperature on PCR amplification by primer set AODC1 and 16

2.2.4 退火温度对三重PCR扩增结果的影响

利用阳性对照菌株基因组DNA作为扩增模板，在48、50、52、54、56、58℃ 6个不同退火温度条件下进行PCR扩增，每个温度两个平行，结果见图5。从图5可以看出，在54℃和56℃这两个退火温度条件下，扩增出3条明亮的特异性条带，并且后者的条带更清晰明亮。48～52℃温度范围内只扩增出两条条带，AODC1、16的扩增条带消失。退火温度为58℃时，只有引物对AODC1、16扩增出了条带。因此，以56℃作为三重PCR的退火温度。

M. 100bp plus DNA Ladder；1～6分别为退火温度48、50、52、54、56、58℃。

图 5 退火温度对三重PCR扩增结果的影响

Fig.5 Effect of annealing temperature on multiplex PCR amplification

2.3 酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因检测

2.3.1 酒酒球菌组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)的检测

M1. DL2000 DNA Ladder；M2. 100bp plus DNA Ladder；1～40为实验室保藏的40株酒酒球菌；＋. 阳性对照菌株ATCC 33222。

图 6 40株酒酒球菌组氨酸脱羧酶基因检测电泳图

Fig.6 PCR assay of 40 Oenococcus oeni strains for detecting histidine decarboxylase gene

以40株酒酒球菌DNA为模板，JV16HC、JV17HC为引物，进行PCR扩增，检测40株酒酒球菌中的hdc基因，结果如图6所示。从图6可以看出，有33株酒酒球菌含有hdc基因，占40株酒酒球菌的82.5%。

2.3.2 酒酒球菌酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)的检测

以40株酒酒球菌DNA为模板，TD2、TD5为引物，进行PCR扩增，检测tdc基因，结果如图7所示。从图7可以看出，22株酒酒球菌含有tdc基因，占55%。

M. 100bp plus DNA Ladder；＋.阳性对照菌株ATCC 367；1～40为实验室保藏的40株酒酒球菌。

图 7 40株酒酒球菌酪氨酸脱羧酶基因检测电泳图

Fig.7 PCR assay of 40 Oenococcus oeni strains for detecting tyrosine decarboxylase gene

2.3.3 酒酒球菌中鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因)的检测

M. DL2000 DNA Ladder；＋.阳性对照菌株ATCC 33222；1～40为实验室保藏的40株酒酒球菌。

图 8 40株酒酒球菌鸟氨酸脱羧酶基因检测电泳图

Fig.8 PCR assay of 40 Oenococcus oeni strains for detecting ornithine decarboxylase gene

以40株酒酒球菌DNA为模板，AODC1、16为引物，进行PCR扩增，检测odc基因，结果如图8所示。从图8可以看出，有16株酒酒球菌含有odc基因，占40%。

2.4 酒酒球菌代谢的安全性

分别对40株酒酒球菌的组氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶用PCR方法进行检测。其中有33株酒酒球菌含有hdc基因，22株酒酒球菌含有tdc基因，16株酒酒球菌含有odc基因，如表1所示。可以看出，40株酒酒球菌都至少含有1种氨基酸脱羧酶基因，其中19株酒酒球菌含有1种氨基酸脱羧酶基因，11株酒酒球菌含有2种氨基酸脱羧酶基因，10株酒酒球菌含有3种氨基酸脱羧酶基因。40株酒酒球菌全部含有氨基酸脱羧酶基因，都具有产生氨基酸脱羧酶、生成生物胺的潜力，因此不建议用作葡萄酒中苹果酸-乳酸发酵的起始菌株。

表 1 40株酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因测定结果

Table 1 Amino acid decarboxylase genes detected in 40
Oenococcus oeni strains

注：＋.测定结果为阳性；—.测定结果为阴性。

3 结 论

本实验利用特异性引物JV16HC、JV17HC，TD2、TD5和AODC1、16，设计了检测hdc基因、tdc基因和odc基因的PCR，双重PCR和三重PCR方法。通过对PCR退火温度的优化，优化了PCR的反应条件。40株酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因检测结果表明：33株酒酒球菌含有hdc基因，22株酒酒球菌含有tdc基因，16株酒酒球菌含有odc基因，没有检测出不含氨基酸脱羧酶基因的酒酒球菌。实验室保藏的40株酒酒球菌都具有潜在的产生生物胺的能力，不建议用于葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵。

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