凝胶渗透色谱-固相萃取-气相色谱-质谱法测定水产品中辛基酚、壬基酚和双酚A

黄 会1,2，邓旭修3，张华威3，刘 云1,2，徐英江2,3,4，宫向红2,3，张秀珍2,3,4,*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.山东省海洋水产研究所，山东 烟台 264006；

3.山东省渔业环境监测站，山东 烟台 264006；4.山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006)

摘 要：对水产品中辛基酚(OP)、壬基酚(NP)和双酚A(BPA)测定的前处理方法进行优化，建立凝胶渗透色谱-固相萃取-气相色谱-质谱分析(GPC-SPE-GC-MS)方法。样品经乙酸乙酯超声提取，凝胶渗透-HLB固相萃取净化，七氟丁酸酐衍生化，进行GC-MS分析检测。结果表明：OP、NP、BPA在HP-5MS柱上有良好分离，方法检出限分别为0.2、0.1、0.1μg/kg，平均回收率OP不低于83.4%，NP不低于80.5%，BPA不低于81.3%，相对标准偏差范围为3.73%～9.19%。该方法应用于莱州湾部分水产品样品分析检测，简单便捷、灵敏度高，适用于水产品中OP、NP和BPA的检测。

关键词：辛基酚；壬基酚；双酚A；气相色谱-质谱；凝胶渗透过滤-固相萃取；水产品

Determination of Octylphenol, Nonylphenol and Bisphenol A in Aquatic Products by Gel Permeation Chromatography Coupled with Solid Phase Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HUANG Hui1,2，DENG Xu-xiu3，ZHANG Hua-wei3，LIU Yun1,2，XU Ying-jiang2,3,4，GONG Xiang-hong2,3，ZHANG Xiu-zhen2,3,4,*

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China；3. Shandong Fishery Environmental Monitoring Station, Yantai 264006, China；4. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China)

Abstract：On the basis of optimized sample pretreatment conditions, a method for the determination of octylphenol (OP), nonylphenol (NP) and bisphenol A (BPA) in aquatic products has been developed by gel permeation chromatography (GPC) coupled with solid phase extraction (SPE) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The analytes were extracted with ethyl acetate and purified seuquentially by gel permeation chromatography and HLB solid phase extraction cartridges. After derivatization with heptafluorobutyrican anhydride (HFBA), the derivatives were determined by GC-MS. The results showed that the derivatives of the analytes were well separated by an HP-5MS column, and the limits of detection for OP, NP and BPA were 0.2, 0.1 μg/kg and 0.1 μg/kg, respectively. The average recovery rates were more than 83.4%, 80.5% and 81.3%, respectively, with relative standard deviation (RSD) ranging from 3.73% to 9.19%. The method has been used to determine seafood samples from Laizhou Bay with high sensitivity and reliability.

Key words：octylphenol；nonylphenol；bisphenol A；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；gel permeation chromatography (GPC)；solid phase extraction (SPE)；aquatic product

中图分类号：O657.71 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0116-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324024

辛基酚(octylphenol，OP)、壬基酚(nonylphenol，NP)和双酚A(bisphenol A，BPA)是常见内分泌干扰物[1]，具有和天然雌激素相似的结构和类雌激素活性，因而被称为酚类环境雌激素[2]。这类物质理化性质稳定、可经由食物链进行传递和浓缩、易于被动物体吸收和富集、难以被排除或降解，最终都将进入海洋，污染海洋水体和水产品[3-4]。在海洋环境[5-6]、水产品[7-8]中已有检出，表明水产品质量安全已受到威胁。

目前应用于OP、NP和BPA的分析方法主要是高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法[9-10]、气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法[11-12]和液相色谱-质谱-质谱(LC-MS-MS)法[13-14]。相对于色谱法，GC-MS法定性参数增加，通过质谱图、分子离子峰的准确质量、碎片离子峰强比、同位素离子峰等使GC-MS方法定性更可靠[15]。传统的样品的预处理主要包括液-液萃取[16]、加速溶剂萃取[17]和固相萃取[18-19]等。本研究采用凝胶渗透过滤，与Oasis HLB固相萃取联用对前处理方法进行优化，达到净化分离目标化合物的目的。

本研究拟采用凝胶渗透色谱-固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定水产品中OP、NP和BPA，目的在于建立一种灵敏度高、简单便捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼来源于山东烟台主要水产品市场；小黄鱼、短吻红舌鳎、青鳞小沙丁鱼、口虾蛄、日本蟳、中国枪乌贼、马粪海胆等来源于莱州湾，鱼类去头、鳞、骨、内脏，虾类去头、壳，乌贼去内脏，蟹类、海胆去壳，分别取可食部分充分匀浆，备用。

辛基酚(4-n-OP，纯度≥99.5%)、壬基酚(NP，纯度≥99.5%)、双酚A(BPA，纯度≥98.5%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司(上述3种标准品均用甲醇配成质量浓度为100mg/L的标准贮备液，于－20℃避光保存；使用前，分别移取适量标准贮备液，配制混合标准溶液，用甲醇稀释至各组分分别为1.00mg/L)。七氟丁酸酐(纯度≥
99.0%) 瑞士Fluka公司；甲醇、环己烷、丙酮、正己烷均为色谱纯，碳酸钠为分析纯，实验用水均为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

6890N/5973i气相色谱-质谱联用分析仪(配电子电离源) 美国Agilent公司；固相萃取装置 美国Supelco公司；Oasis HLB柱(60mg，3mL) 美国Waters公司；AccuPrep MPS GPC凝胶渗透色谱(柱规格：700mm×25mm) 美国J2 Scientific公司；FA25匀浆机 上海Fluko公司；R-210旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；EOFO-944621旋涡混合器 美国Talboys公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取

准确称取匀浆后样品10.0g入离心管中，加入3.0mL 50g/L Na2CO3溶液，均质30s，加入20mL乙酸乙酯超声提取20min，4000r/min离心10min后取提取液入鸡心瓶中，残渣再加入10mL乙酸乙酯，重复提取一次，合并上清液，40℃旋转蒸发浓缩，得到样品粗提取物，备用。

1.3.2 凝胶过滤-固相萃取净化

用环己烷-乙酸乙酯(1:1，V/V)溶液10mL溶解样品粗提取物，转入凝胶渗透过滤仪进样管中，进样除杂。凝胶色谱吸入样品提取液体积为5mL，流动相为环己烷-乙酸乙酯(1:1，V/V)溶液，设定流速为4.7mL/min，弃去前9min的流出液，收集10～15min段流出液，继续淋洗凝胶色谱柱15min。

将凝胶过滤后的溶液旋转蒸发浓缩至近干，加入1mL甲醇复溶，旋涡10s后加入9mL蒸馏水，旋涡10s混匀，转移至预先用5mL甲醇和10mL超纯水活化过的HLB柱进行固相萃取，上样后用10mL甲醇-水(1:1，V/V)溶液淋洗柱子，抽干后用10mL甲醇洗脱，控制萃取液流速2～3mL/min，收集的洗脱液于40℃水浴中氮吹至0.5mL，转移至2mL样品反应瓶中40℃氮吹至干。

1.3.3 衍生化

加入70μL丙酮于反应瓶中复溶，加入30μL七氟丁酸酐后迅速盖紧塞子，旋涡混合30s混匀，室温条件下衍生30min。氮吹浓缩，正己烷定容至0.5mL，旋涡15s，待GC-MS分析。

1.3.4 气相色谱质谱分析

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm，0.25μm)；升温程序：120℃保持2min，以15℃/min升至250℃保持1min，再以5℃/min升至280℃保持2min；载气(He)流量：1.0mL/min；进样口温度：250℃；进样方式：不分流，不分流时间1min；进样量：1μL。

1.3.4.2 质谱条件

离子源：电子电离(electron ionization，EI)源；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；四极杆温度：150℃；溶剂延迟：7min；全扫描范围：m/z 70～700；测定方式：选择离子监测(selected ion monitoring，SIM)方式。OP、NP和BPA衍生物的监测离子见表1。

表 1 OP、NP和BPA衍生物的监测离子

Table 1 Monitoring ions for the derivatives of OP, NP and BPA

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

OP、NP和BPA在弱极性或中等极性的有机溶剂中有较高的溶解性，根据样品的不同性质，选择不同的提取溶剂。水产品样品目标化合物提取实验中，分别用乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷等溶剂提取，结果表明用乙酸乙酯提取5～15min时回收率能够大于70%，同时实验发现在样品中加入50g/L碳酸钠溶液能够有效降低干扰，并且重复提取两次，可将回收率提高到大于85%。

2.2 样品净化方法优化

通过初步萃取后得到的粗提取物中过多的杂质不仅对OP、NP和BPA的测定造成干扰，而且严重污染色谱质谱分析系统，因此不能直接进行GC-MS的分析检测，必须对提取液进行净化处理。主要除去生物基质中的脂肪、蛋白、色素等杂质，降低干扰、提高分析的灵敏度，因此选择一种科学合理、回收率高的除杂方法，是本研究的重要步骤。经分析比较发现，采用凝胶渗透过滤-Oasis HLB固相萃取联用方法，能对水产品样品粗提物的净化达到较好的效果。

水产品样品含有大量的脂肪、蛋白等大分子杂质，直接用HLB柱进行固相萃取容易造成柱子的堵塞，且不能有效去除脂肪等大分子杂质。凝胶渗透过滤是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用去脂和除杂，当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，凝胶对样品组分没有吸附作用，各物质按照分子质量的不同达到分离目的，分子质量大的先流出。由于待测组分的分子质量与蛋白、脂肪等生物大分子差别极大，因而采用凝胶渗透过滤净化方法，不仅可以有效地去除粗提取物中的这类大分子杂质，起到保护分析系统的作用，而且待测组分没有损失，保证了检测结果的准确性。以OP、NP和BPA混合标准溶液进样到凝胶渗透色谱，流出液于254nm波长处进行检测，在10～15min时间段有吸收峰，据此设定收集目标化合物的时间段为10～15min。

凝胶渗透净化后的样品提取液中还有部分小分子的杂质，可利用固相萃取柱进一步去除这些杂质，获得更加纯化的前处理样品，以提高仪器分析的信噪比，从而提高方法的灵敏度。固相萃取是一个成本较低、可操作性强的净化技术[20]，样品的均一化、分离和提纯在此步骤中同时完成，比较适于生物组织样品，是残留分析中最常用的净化方法。

本研究比较了SLH柱、Florisil柱和HLB柱的分离效果
(图1)，SLH柱、Florisil柱分别用5mL乙酸乙酯、5mL正己烷活化，HLB柱用5mL甲醇、10mL Milli-Q水活化，加样后用不同的溶剂淋洗、洗脱，氮吹浓缩衍生后，上机检测，结果表明SLH柱对双酚A有回收但较低，对辛基酚和壬基酚几乎无回收；Florisil柱对3种物质的回收率均低于10%，HLB柱对3种组分净化效果较好，回收率达到80%。因此本研究采用HLB柱对样品提取液做进一步的净化。

本研究还比较了淋洗液配比V(甲醇):V(水)对回收率的影响，配制V(甲醇):V(水)分别为3:7、2:3、1:1、3:2、7:3的淋洗液，结果表明V(甲醇):V(水)=1:1时效果最好(图2)，在保证回收率的前提下最大限度地去除了杂质，故采用V(甲醇):V(水)=1:1作为淋洗液。

图 1 SLH柱(a)、Florisil柱(b)和HLB柱(c)回收率比较

Fig.1 Comparative recovery rates of OP, NP and BPA by SLH (a), Florisil (b) and HLB (c) cartridges

图 2 使用不同比例甲醇-水溶液淋洗的回收率

Fig.2 Comparative recovery rates of OP, NP and BPA eluted with various methanol and water mixtures

采用乙酸乙酯和甲醇作为洗脱液进行比较，乙酸乙酯脂溶性较强，洗脱范围较广，洗脱液中混有较多杂质，因而采用甲醇洗脱。经实验发现，用10mL甲醇洗脱时，回收率可达80%以上，能满足检测要求，因此采用10mL甲醇洗脱。

2.3 衍生方法的选择

OP、NP和BPA沸点均高于170℃，挥发性较差，不易气化，所以必须先将其衍生成为易挥发化合物，再用GC-MS进行分析测定。常用的衍生方法主要包括硅烷化(BSTFA衍生)、酰化(含氟酰化试剂七氟丁酸酐等)、苄基化(五氟苄基溴或五氟苄基氯)反应等。本研究主要对BSTFA和七氟丁酸酐两种衍生试剂的衍生效果进行比较，均能与OP、NP和BPA发生衍生化反应，但BSTFA的硅烷化反应需要在60～80℃条件下进行且谱图杂峰较多，响应值低，而七氟丁酸酐的酰化反应可以在室温条件下进行，谱图杂峰较少，响应值高。相比较七氟丁酸酐衍生法操作方便、精密度高，因此采用此法衍生法。

2.4 OP、NP和BPA在HP-5MS柱上的色谱分离

本研究中OP、NP和BPA在HP-5MS柱上有良好的分离(图3)，保留时间分别为7.63、8.39、9.59min。

图 3 OP、NP和BPA衍生物在HP-5MS柱上的总离子流图

Fig.3 Total ion current chromatograms of the derivatives of OP, NP and BPA on HP-5MS cartridge

2.5 方法的线性范围与检出限

配制质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L OP、NP和BPA的混合标准溶液，取100μL此不同质量浓度的该标准溶液，40℃氮气吹干，按1.3.3节方法衍生化后GC-MS定量检测。每一质量浓度平行3次测定，以标准溶液质量浓度(μg/L)为横坐标、平均峰面积为纵坐标作图，绘制标准工作曲线，得线性回归方程和相关系数，结果见表2，结果表明各组分呈良好的线性关系。

表 2 OP、NP和BPA衍生物的回归方程和相关系数

Table 2 Regression equations and correlation coefficients for
OP, NP and BPA

2.6 回收实验和精密度

本研究分别在OP、NP和BPA定量限的1、2、10倍水平，于空白草鱼中添加混合标样每个质量浓度的样品平行测定6次，测定3个添加水平，进行回收率和精密度实验。结果表明，目标化合物平均回收率：OP不低于83.4%，NP不低于80.5%，BPA不低于81.3%，相对标准偏差(RSD)范围为3.73%～9.19%；说明方法精密度良好，处于可信范围。以RSN≥3所对应的被测化合物含量作为检出限(LOD)，以RSN≥10所对应的被测化合物的含量作为方法的定量限(LOQ)。加标回收率、检出限和定量限见表3；草鱼样品空白和加标谱图见图4。

表 3 方法回收率、检出限和定量限

Table 3 Recovery rates, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of the method

图 4 草鱼样品空白(a)和加标(b)谱图

Fig.4 Chromatograms of blank sample (a) and spiked sample (b) of grass carp

2.7 实际样品测定

应用本方法对莱州湾采集的部分水产品进行了OP、NP和BPA检测，样品检测结果均值如表4所示。BPA在水产品中均有检出，NP仅部分检出，OP未检出。

表 4 部分水产品样品中OP、NP和BPA含量

Table 4 contents of OP, NP and BPA in aquatic products

µg/kg

注：ND.未检出。

3 结 论

本研究建立了水产品中OP、NP和BPA分离净化和检测的凝胶渗透色谱-固相萃取净化-气相色谱-质谱法方法，精密度和准确度良好，能满足对目标化合物的分析要求。该方法已用于在莱州湾采集的部分水产品样品分析检测，适用于水产品中OP、NP和BPA的分析检测。

参考文献：

[1] 彭俊华. 环境雌激素辛基酚检测的研究进展[J]. 国外医学: 卫生学分册, 2004, 31(3): 143-148.

[2] 李瑞霞. 环境雌激素对动物的影响与对策[J]. 四川动物, 2006(3): 126-129.

[3] BIAN Haiyan, LI Zhengyuan, LIU Ping, et al. Spatial distribution and deposition history of nonylphenol and bisphenol A in sediments from the Changjiang River (Yangtze River) Estuary and its adjacent East China Sea[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2010, 29(5): 44-51.

[4] Naylor C G, Mieure J P, Adams W J, et al. Alkylphenol ethoxylates in the environment[J]. American Oil Chemists Society, 1992, 69(3): 695-703.

[5] 李正炎, 傅明珠, 王馨平, 等. 冬季胶州湾及其周边河流中酚类环境激素的分布特征[J]. 中国海洋大学学报, 2006, 36(3): 451-455.

[6] 刘慧慧, 徐英江, 邓旭修, 等. 莱州湾海域表层沉积物中双酚A的分布特征[J]. 环境化学, 2012, 31(10): 1654-1655.

[7] 高智席, 吴艳红, 黎司. 赤水河下游水产品中辛基酚和壬基酚的测定[J]. 湖北农业科学, 2012, 50(5): 999-1001.

[8] 邵泽伟. 黄海沿岸生物和沉积物中酚类检测及分布特征[D]. 大连: 大连海事大学, 2011.

[9] 张丽, 李楠, 万延延. 固相萃取-高效液相色谱法测定饮用水中酚类化合物[J]. 环境监测管理与技术, 2010, 22(1): 49-51.

[10] Watabe Y, Kondo T, Morita M, et al. Determination of bisphenol A in environmental water at ultra-low level by high-performance liquid chromatography with an effective on-line pretreatment device[J]. Chromatography A, 2004, 1032(1/2): 45-49.

[11] 张奎文, 叶赛, 那广水. 高效液相色谱-串联质谱法测定环境水体中双酚A、辛基酚、壬基酚[J]. 分析试验室, 2008, 27(8): 62-66.

[12] 张秀珍, 徐英江, 宫向红, 等. 气相色谱质谱法同时测定水产品中8种雌激素类化合物[J]. 中国水产科学, 2009, 16(5): 791-796.

[13] 徐英江, 田秀慧, 张秀珍, 等. 超高效液相色谱串联质谱法对水产品中八种雌激素的测定[J]. 分析测试学报, 2010, 29(2): 152-156.

[14] 王静, 潘荷芳, 刘铮铮. 超高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中烷基酚[J]. 分析测试学报, 2007(增刊1): 210-212.

[15] 朱明华. 仪器分析[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2008: 351-372.

[16] 宋益庆. 静态液相微萃取测定水中辛基酚实验条件分析[J]. 黑龙江环境通报, 2009, 33(2): 18-20.

[17] Pedersen S N, Lindholst C. Quantification of the xenoestrogens 4-tert-octylphenol and bisphenol A in water and in fish tissue based on microwave assisted extraction, solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Chromatography A, 1999, 864(1): 17-24.

[18] Stoichev T, Baptista M S, Basto M C, et al. Application of SPME to the determination of alkylphenols and bisphenol A in cyanobacteria culture media[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 391(1): 425-432.

[19] 郝瑞霞, 梁鹏, 赵曼, 等. 固相萃取法分离富集污水样品中痕量壬基酚[J]. 环境工程, 2006, 24(3): 71-73.

[20] 王立, 汪正范. 色谱分析样品处理[M]. 北京: 化学工业出版社, 2006: 42-184.