液相色谱-质谱联用法检测马铃薯中α-茄碱含量

伍慧敏1，曾 静2，李 美2，刘德明2，杜 宇3，熊兴耀2，曾建国1,2,3,*

(1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南农业大学 国家作物种质创新与资源利用重点实验室培育基地，
湖南 长沙 410128；3.湖南省中药提取工程研究中心，湖南 长沙 410331)

摘 要：目的：建立基于液相色谱-质谱联用法的马铃薯中低含量的α-茄碱的高灵敏检测方法。方法：马铃薯用1%甲酸-甲醇(1:1，V/V)超声提取50min。采用C18色谱柱(2.1mm×150mm，5μm)分离，流动相为乙腈-0.1%甲酸(V/V)，梯度洗脱，柱温35℃，流速0.2mL/min；采用液相色谱-电喷雾离子源单四极杆质谱检测。结果：α-茄碱在7～460μg/kg范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归系数R2=0.9991，平均加标回收率为93.6%，精密度为1.13%，重复性为2.59%。结论：该检测方法灵敏度高、重复性好，可用于马铃薯中低含量α-茄碱的含量测定。

关键词：马铃薯；龙葵素；α-茄碱；液相色谱-质谱联用法

Determination of α-solanine in Potato Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

WU Hui-min1，ZENG Jing2，LI Mei2，LIU De-ming2，DU Yu3，XIONG Xing-yao2，ZENG Jian-guo1,2,3,*

(1. College of Pharmacy, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China；

2. Pre-State Key Laboratory for Germplasm Innovation and Resource Utilization of Crops, Hunan Agricultural University,
Changsha 410128, China；3. Hunan Engineering Research Center of Botanical Extract, Changsha 410331, China)

Abstract：Objective: To establish a sensitive method to determine micro amounts of α-solanine in potato using liquid chromatograph-mass spectrometry (LC-MS). Methods: Potato samples were extracted with 1% formic acid-methanol (1:1, V/V) in combination with ultrasonic assistance for 50 min. Separation of the extracts was performed on a C18 column (2.1 mm × 150 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% formic acid. Gradient elution was performed at column temperature of 35 ℃ with a flow rate of 0.2 mL/min. The pooled eluate was detected by electrospray ionization mass spectrometry. Results: The regression coefficient of α-solanine was 0.9991 in the range of 7–460 μg/kg. The average recovery rate was 93.6%. The precision as repeatability and reproducibility were 1.13% and 2.59%, respectively. Conclusion: This method is simple, accurate, repeatable and applicable to determine micro amounts of α-solanine in potato.

Key words：potato (Solanum tuberosum L.)；solanine；α-solanine；liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)

中图分类号：S532 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0121-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324025

马铃薯(Solanum tuberosum L.)又名土豆、洋芋，是继水稻、小麦、玉米的第4大粮食作物[1]。马铃薯植株和块茎中普遍含有一类甾体糖苷生物碱，称为茄碱，又叫龙葵素(目前已知的龙葵素有α-、β-、γ-茄碱、α-、β-、γ-卡茄碱)，具有一定毒性，在马铃薯食用过程中存在一定安全隐患。马铃薯在放置一段时间后，很容易变绿发芽，绿皮与芽中的龙葵素含量会迅速上升，若100g鲜块茎中龙葵素含量超过20mg，食用后就会中毒[1]。过多摄入会引起舌头发麻、恶心呕吐、腹泻、头痛、晕眩等不良反应，甚至导致中毒者抽搐、昏迷、呼吸中枢麻痹而死亡[2-5]。马铃薯消费量巨大，但龙葵素的检测方法与技术却存在许多问题，一定程度上阻碍了马铃薯的安全预警和质量监管。

图 1 龙葵素类化合物的化学结构

Fig.1 Structure of α-solanine

α-茄碱是龙葵素类化合物中含量较高的一种，监测α-茄碱的含量基本能反映马铃薯中龙葵素类化合物的含量。马铃薯主要食部分是肉，较少食用皮和芽。马铃薯肉中α-茄碱的含量远远低于马铃薯皮和芽[1]，但目前的检测方法大多针对马铃薯皮，也就是高含量的α-茄碱检测，忽视马铃薯肉中低含量的α-茄碱检测。且已报道的针对高含量α-茄碱的前处理与检测方法也存在许多不足。首先，前处理方法繁琐、耗时较长。Sotelo等[6]用甲酸-水搅拌提取，虽然操作简单，但耗时长，需3次才提取完全；张薇等的回流提取法[7]与微波辅助提取法[8]耗时长达16h，且操作复杂。其次在检测方法上，比色法和薄层扫描法不适用于龙葵素的准确定量，只能大致确定含有相同共轭结构的马铃薯糖苷类化合物的含量[2]。高效液相色谱法适用于化合物的准确定量，但目前文献报道的基于液相色谱的检测方法分离时间较长，如肖文军等[9]建立α-茄碱的检测方法分离时间为24min。另外，虽然在前处理时可以通过富集的方法提高样品中α-茄碱的含量，但操作繁琐，还可能引入其他的干扰因素，影响结果的准确性。因此，迫切需要建立一种前处理简单、灵敏度高的方法来检测马铃薯中低含量α-茄碱。此外，测定α-茄碱需要进行前处理，文献报道的搅拌法、回流法、微波辅助提取法[7-12]等方法存在操作繁琐、时间较长等缺点，而超声波提取法可增加溶剂穿透力、提高提取效率，且不需要加热，越来越多地应用于样品的提取领域[13-16]。

本实验用简单快速的样品前处理方法，采用高灵敏的液相色谱-质谱联用技术检测马铃薯中α-茄碱，通过重复性、精密度等验证，并与液相色谱法的检测结果进行初步比较，以期为低含量α-茄碱的检测提供准确可靠的实用方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-茄碱对照品(批号为20562-02-1，纯度为99%) 美国Sigma公司；乙腈(色谱纯) 德国Merck公司；甲酸(色谱纯) 美国ROE公司；甲醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

UPLC-SQD超高效液相色谱-单四极杆质谱仪系统(配有单级杆质谱检测器和Msaalynx质谱工作站) 美国Waters公司；1260高效液相色谱仪系统(配有可变波长紫外检测器和1260 Rev.B.03.04色谱工作站) 美国Agilent公司；Unitary C18色谱柱 北京华谱新创科技有限公司；电子天平 瑞士Mettler Toledo仪器有限公司；厨房机械干磨机 广东德尔电器有限公司；KQ5200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；2323K冷冻离心机 德国Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将土豆洗净，擦干，去皮，将肉匀浆，精密称取匀浆肉1g，置于100mL容量瓶，加入1%甲酸-甲醇(1:1，V/V)，密封，超声提取50min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀后取部分提取液离心，上清液过膜，即得供试液。

1.3.2 对照品制备

精密称取α-茄碱对照品5mg，置于100mL容量瓶，加初始流动相适量，超声溶解，放至室温，再稀释到刻度，摇匀。精密吸取上述溶剂1mL，置于100mL容量瓶，加流动相稀释到刻度，摇匀，得对照品溶液。

1.3.3 液相色谱-质谱联用条件

色谱柱：Unitary C18(2.1mm×150mm，5μm)；流动相A为0.1%甲酸(V/V)，流动相B为乙腈；梯度洗脱：0～5min，5%～50%B；5～6min，50%～95%B；柱温35℃；流速0.2mL/min；进样量5μL。

电喷雾离子源(electronic spray ionization，ESI)正离子模式检测；离子监测模式(single ion monitoring，SIM)检测；毛细管电压2.8kV；锥孔电压30V；离子源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气流速600L/h；锥孔气流速50L/h。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：Unitary C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相A为0.4%磷酸(V/V)，流动相B为乙腈；A:B=76:24(V/V)等度洗脱；柱温35℃；流速0.8mL/min；进样量5μL。

1.3.5 前处理方法优化

采用超声提取法建立马铃薯肉的提取方法，并对各项参数进行优化。

1.3.5.1 超声时间

考查提取时间(10、20、30、40、50，60min)与α-茄碱提取率的关系。

1.3.5.2 提取溶剂

分别采用1%甲酸-甲醇(1:1，V/V)、1%盐酸-甲醇(1:1，V/V)、0.5%甲酸、0.5%盐酸作为提取溶剂，考查提取效果。

1.3.6 样品测定

对市场上随机购买的10批马铃薯的肉进行检测，同时再将马铃薯置于阴凉干燥的地方30d，再次检测。样品按照1.3.1节方法制备供试品溶液，按1.3.3节液-质条件进行检测。以外标法定量，α-茄碱(m/z 868.78)为目标离子。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

2.1.1 超声时间

为避免α-茄碱含量低对提取效果的影响，此处选择的是完全发绿的马铃薯进行实验，结果如图2所示，超声提取率在170μg/g左右，且提取率与提取时间的整体变化趋势大致呈正相关，但提取率的增加幅度不大，在50min时趋于稳定，提取较完全。在综合考虑提取率稳定性和提取时间的基础上，本实验选择50min为最佳提取时间。

图 2 提取时间对α-茄碱提取率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of a-solanine

2.1.2 提取溶剂

本实验对最佳提取溶剂进行考察，结果如图3所示，提取率从高到低依次为1%甲酸-甲醇、1%盐酸-甲醇、0.5%甲酸、0.5%盐酸。因此，本实验选择1%甲酸-甲醇作为提取溶剂。

图 3 提取溶剂对α-茄碱提取率的影响

Fig.3 Effect of extraction solvents on the extraction efficiency of a-solanine

2.2 质谱条件的选择

2.2.1 质谱模式的选择

图 4 马铃薯肉样品总离子流图

Fig.4 Total ion chromatogram of potato flesh tissue

超高效液相色谱串联单四极杆质谱仪除了可以提供全扫描模式(full scan)外，还可以提供选择离子监测模式。选择离子监测可以排除其他干扰离子对目标峰的影响，具有更高的灵敏度和更好的特异性。由图4可知，马铃薯提取物组成复杂，在α-茄碱出峰时间前后有干扰峰。而采用选择离子监测模式检测，可以排除α-茄碱出峰时间前后干扰峰对其定量测定的影响(图5)，且具有较高的灵敏度和特异性。

图 5 离子监测模式下马铃薯肉样品中α-茄碱质谱图

Fig.5 Chromatogram of α-solanine in potato under the SIM mode

2.2.2 质谱检测分离时间

分离时间的长短也是影响样本单位时间分析通量的重要因素。目前文献中报道的分离时间普遍较长，大多在20min以上[6-9]，如肖文军等[9]的方法中分离时间为23.67min。Jensen等[17]采用的分离方法，时间虽短，但有较大干扰峰，基线不平。本研究采用离子监测模式检测，降低了目标成分与其他干扰成分的分离度要求，并可以通过优化洗脱条件，使其快速流出，从而建立α-茄碱的快速分析方法。本实验考虑到马铃薯样品复杂性，通过优化梯度，使α-茄碱在5.5min左右出峰(图4)，降低了极性较强的化合物对α-茄碱离子化效率的影响，保证了检测灵敏度、缩短了分离时间。

2.2.3 质谱参数的优化

质谱参数的设定对检测灵敏度有直接的影响。优化质谱参数可以提高检测灵敏度，降低背景的干扰。本实验通过对质谱参数的摸索，发现锥孔电压是影响α-茄碱检测灵敏度的主要因素之一。基于此，本实验对锥孔电压进行了优化，通过仪器自动优化系统选择最佳灵敏度，在锥孔电压为30V时可以获得较高的灵敏度。

2.3 方法的验证

2.3.1 线性范围及定量限

精密吸取标准对照液逐级稀释，配制成含量为7.125、14.25、28.50、57.00、114.0、228.0、456.0μg/kg的溶液进样。以含量X(μg/kg)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=2664.1X＋6505.5，R2=0.9991，表明α-茄碱在7～460μg/kg范围内与峰面积具有较好的线性关系。本方法的定量限为0.73μg/kg。

2.3.2 重复性与精密度

精密称取同一批土豆的匀浆样品6份，按1.3.1节制备供试品溶液，按1.3.3节进行分析，计算马铃薯中α-茄碱的平均含量为30.4μg/g，RSD为2.59%，表示本方法重复性良好。取α-茄碱对照品溶液，按1.3.3节液-质条件连续进样6次，测定峰面积，计算得α-茄碱峰的平均含量为19.57μg/g，RSD为1.13%，表示仪器的精密度良好。

2.3.3 加样回收率

表 1 α-茄碱加样回收率

Table 1 Recovery rates of α-solanine in spiked samples

在马铃薯样品中添加标准溶液，按1.3.1节制备供试品溶液，按1.3.3节液-质条件进行分析，对马铃薯进行3个水平含量的加标回收实验(每个加标梯度3个平行样)，3个含量水平分别约为马铃薯肉样品中所含α-茄碱的50%、100%、150%。从表2可以看出，本方法回收率在80.8%～97.9%之间，平均回收率为93.6%，表明方法具有较好的回收率。

2.4 样品检测

表 2 马铃薯肉中α-茄碱的含量(n=2)

Table 2 α-Solanine content in fresh and stored potatoes (n = 2)

本实验对市场上随机购买的10批马铃薯的肉进行了检测，同时将马铃薯置于阴凉干燥避光的地方30d[18-19]，再次检测，初步探究α-茄碱的含量随放置时间的变化关系[18-19]。不同批次、不同放置时间马铃薯的检测结果如表2所示，从表中可以看出10批次马铃薯α-茄碱的含量均低于中毒剂量200μg/kg[1]，而9号马铃薯中α-茄碱的含量较高，推测该批马铃薯放置时间较长。3号马铃薯中α-茄碱的含量较低，推测其较为新鲜。此外，马铃薯放置30d之后，肉中α-茄碱均不同程度的升高。

2.5 液相色谱法与液-质联用法检测结果比较

本实验以同一批完全变绿的马铃薯皮和肉为样品[20]，初步比较了液相色谱法[9]和液-质联用法的α-茄碱检测结果(基于液相色谱法的马铃薯肉样品按1.3.1节制备后浓缩100倍进样)。初步比较的3组结果如表3所示，液-质联用法检测结果约为液相色谱法检测结果的63%左右，推测这可能是由于液相检测中α-茄碱色谱峰没有分离完全，还包含其他一些化合物等原因，导致结果偏高。

表 3 液相色谱和液-质联用法同时检测马铃薯中α-茄碱的含量

Table 3 Comparison of analytical results obtained for α-solanine content in potato skin and flesh using LC and LC-MS

3 结 论

本实验建立了一种基于液-质联用方法的马铃薯中低含量α-茄碱的检测方法，本方法具有前处理简单、分析速度快、检测灵敏高、特异性好等优点，线性范围、检出限、回收率、精密度、重复性均可满足实际样品的检测需求。对市售10个批次马铃薯进行检测，α-茄碱的含量在12.27～112.80μg/g之间，均在安全食用范围之内[1]。该方法可应用于马铃薯肉中低含量的α-茄碱检测。

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