超高效液相色谱-高分辨谱法同时测定
牛肉中的苯基丁氮酮和氨基比林

张海燕1,刘 鑫2,严 华2,李建辉2,张朝晖2,卢晓宇2,张沫琦2,李 岩2,叶晓霞1,*

(1.温州医科大学药学院,浙江 温州 325035;2.北京出入境检验检疫局,北京 100026)

 

要:建立超高效液相色谱-高分辨质谱法(UPLC-HRMS)同时测定动物源食品中苯基丁氮酮和氨基比林的分析方法。样品前处理使用改进的QuEChERS方法,考察多种溶剂体系,最终选择丙酮和水作为提取溶剂,Acquity UPLC HSS T3色谱柱(150mm×2.1mm,1.8μm)分离,以乙腈和乙酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子(ESI+)模式,全扫描模式进行检测。结果表明:苯基丁氮酮在5.0~100.0μg/L范围内线性关系良好(r0.995),氨基比林在1.0~100.0μg/L范围内线性关系良好(r0.995)。牛肉中两种非甾体类阵痛药都有较好的回收率和稳定性:5.0、10.0、20.0μg/kg的添加水平的回收率为76.7%~85.9%,相对标准偏差(RSD,n=6)为5.6%~12.9%。苯基丁氮酮和氨基比林的定量限(RSN=10)分别为5.0μg/kg和1.0μg/kg。该方法简单、快速、灵敏、准确,适合于动物源食品中苯基丁氮酮和氨基比林等非甾体类镇痛剂的快速、高灵敏的分析检测。

关键词:超高效液相色谱-高分辨质谱法;苯基丁氮酮;氨基比林;牛肉

 

Determination of Phenylbutazone and Aminopyrine in Beef by Ultra High Performance Liquid
Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

 

ZHANG Hai-yan1,LIU Xin2,YAN Hua2,LI Jian-hui2,ZHANG Zhao-hui2,LU Xiao-yu2,ZHANG Mo-qi2,LI Yan2,YE Xiao-xia1,*

(1. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;

2. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

 

Abstract:A method for the determination of phenylbutazone and aminopyrine in beef has been developed by ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UHPLC-HRMS). After a modified QuEChRES sample preparation process, the samples were loaded onto an Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) and separated with a gradient elution. The electrospray process was operated in the positive ion mode, and data were acquired in the full scan mode. The calibration curves showed a good linearity in the range of 5.0–100.0 μg/kg, with correlation coefficients (r) equal to or greater than 0.995. When the spiked levels were 5, 10 μg/kg and 20 μg/kg, the recovery rates of phenylbutazone and aminopyrine in bovine ranged from 76.7% to 85.9%, with relative standard deviations (RSDs) of 5.6%–12.9%. The limits of quantification (LOQs, RSN=10) for phenylbutazone and aminopyrine were 5.0 μg/kg and 1.0 μg/kg in beef, respectively. The results indicate that the developed method is simple, rapid, sensitive and suitable for the qualitative and quantitative analysis of phenylbutazone and aminopyrine in animal-derived foodstuffs including beef.

Key words:ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS);phenylbutazone;aminopyrine;bovine

中图分类号:O657 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)24-0135-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324028

2013年2月,欧洲“马肉风波”席卷全球,欧洲多国都在牛肉制品中检出马肉成分,不仅如此,这些肉制品中还含有类镇痛药——苯基丁氮酮(phenylbutazone)。英国检测206匹被屠宰的马匹,发现8匹含苯基丁氮酮,其中6匹已运往法国,可能进入了食品产业链。苯基丁氮酮,又名保泰松,主要用于治疗人类风湿性关节炎和痛风,但由于其可能导致的严重副作用,如抑制白细胞的生长和再生障碍性贫血,在美国禁止用于人类疾病治疗,同时严令禁止其在动物体内的超标使用[1],并严禁作为食用动物的治疗药物。在英国,苯基丁氮酮被用于治疗强直性脊柱炎,但仅仅是在其他治疗方法无效的情况下使用[2]。

苯基丁氮酮属非甾体类阵痛药,同类镇痛药物有氨基比林(aminopyrine)、安替比林(antipyrine)、安乃近(analgin)、戊烯保泰松(feprazone)和羟基保泰松(oxyphenylbutzaone)等。氨基比林和安替比林早在19世纪末阿司匹林问世前就已投入使用,20世纪中叶发明了苯基丁氮酮,但因吡唑酮类药物有严重的毒副作用,该类药物一般在人类疾病治疗中应用较少,但作为兽药一直在使用[3]。

测定苯基丁氮酮在动物体内吸收和代谢的方法有多篇文献[4-13]报道,这些检测方法包括气相色谱法(gas chromatography,GC)、液相色谱-紫外检测法(liquid chromatography-ultraviolet,LC-UV)和荧光光谱法等。动物肌肉组织中该类化合物检测方法的文献较少,Peters等[10]报道了鸡蛋、鱼和肉中100种兽药的液-质联用检测方法,使用乙腈-水体系的QuEChERS提取方法,其中苯基丁氮酮的检出限为241~413μg/kg;庞国芳等[11]建立了屠宰动物肌肉组织中的保泰松残留量的LC-UV测定方法,并制定了GB/T 20754—2006《畜禽肉中保泰松残留量的测定方法液相色谱-紫外检测法》,该检测方法使用多种混合溶液作为提取溶剂,固相萃取柱净化,用混合溶液洗脱并蒸至近干,流动相定容、外标法定量,检出限为5.0mg/kg。

鉴于非甾体类镇痛药,特别是吡唑酮类镇痛药的毒副作用和安全使用限量的问题,本实验在已发表文献的基础上,对动物源食品中吡唑酮类镇痛药的方法进行了改进。建立了苯基丁氮酮和氨基比林(图1)的液相色谱-高分辨质谱检测方法,使用丙酮-水作为提取液,采用C18填料进行净化的QuEChERS方法,简化了提取方法,优化了仪器条件。该方法在牛肉基质中进行了检出限、线性范围、样品加标回收率及精密度的验证,结果满意。

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图 1 苯基丁氮酮(A)和氨基比林(B)的化学结构式

Fig.1 Chemical structures of phenylbutazone (A) and aminopyrine (B)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯基丁氮酮(CAS:50-33-9)和氨基比林(CAS:58-15-1)
标准品(纯度不小于99.8%) 百灵威J&K公司;乙腈(色谱级) 美国Tedia公司;丙酮、乙酸乙酯、乙酸铵、无水硫酸镁、氯化钠(分析纯) 北京化学试剂公司;微孔滤膜(0.20μm,GHP双性过滤膜) 美国Pall公司;实验用水均由Milli-Q超纯水系统制备;C18和PSA填料 天津博纳艾杰尔公司;无水硫酸镁使用前先用马弗炉烘干(500℃、5h),冷却备用。

1.2 仪器与设备

UHPLC-LTQ Orbitrap XL超高效液相色谱-高分辨质谱仪(配有电喷雾离子源(ESI)及Xcalibur1.2数据处理系统) 美国Thermo Fisher Scientific公司;Advantage A10 Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;KQ-250E超声波清洗器 江苏昆山超声仪器有限公司;3-18K小型高速离心机 德国Sigma公司;MS 3 basic漩涡振荡器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC HSS T3(150mm×2.1mm,1.8μm);流动相A为10mmol/L乙酸铵溶液,流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0~6.0min,80%~50% A;6.0~9.0min,50%~10% A;9.0~9.1min,10%~80% A;9.1~12.0min,80% A。流速:0.25mL/min;柱温:35℃;进样体积:10.0µL。

1.3.2 质谱条件

质量分析器:Orbitrap;离子化方式:ESI+;喷雾电压:4.5kV;管状透镜电压:115V;鞘气(氮气)流速:25arb;辅助气(氮气)流速:3.00arb;毛细管温度:350℃;扫描时间:22min;静电场轨道阱的高分辨扫描(分辨率R=30000);质量扫描范围:100~500D。使用全扫描模式定量,苯基丁氮酮和氨基比林的定量离子分别为309.15975和232.14444,误差范围为±2.5×10-6

1.3.3 标准溶液的配制

标准储备液:分别准确称取苯基丁氮酮和氨基比林标准品10mg于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得质量浓度为1000mg/L的标准储备液,于-18℃避光存储。

混合标准中间液:分别取上述标准储备液各1mL,用乙腈-水(50:50,v/v)溶液配制成质量浓度为10mg/L的标准中间溶液,于4℃避光存储。

1.3.4 样品提取和净化

称取3.00g牛肉样品于50mL离心管中;依次加入5mL去离子水和10mL丙酮,充分旋涡混匀,超声提取10min;加入3g MgSO4和1g NaCl,充分旋涡混匀,8000r/min离心10min,取丙酮层5mL,加入150mg C18填料混匀净化,14000r/min高速离心10min;取上清液4mL,氮气吹干,使用50%乙腈溶液0.8mL复溶,过0.2mm微孔滤膜,滤液供UHPLC-LCQ Orbitrap XL分析。

1.3.5 空白样品验证

空白样品首先使用1.3.4节前处理方法进行提取,并使用1.3节方法进行液-质联用分析,结果证明空白样品中苯基丁氮酮和氨基比林保留时间无对应化合物的色谱峰(图2a)。

2 结果与分析

2.1 提取和净化条件的优化

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a.空白样品色谱图

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b.丙酮-水C18体系

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c.乙腈-水C18体系

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d.乙酸乙酯-水C18体系

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e. 酸化乙腈-水C18体系

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f. 丙酮-水PSA体系

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g. 酸化乙腈-水PSA体系

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h.丙酮-水C18体系氨基比林质谱图

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i.乙腈-水C18体系氨基比林干扰峰质谱图

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j.乙腈-水C18体系氨基比林干扰峰放大图

图 2 不同提取液和净化剂体系对提取效果的影响

Fig.2 Effects of extraction solvents and clean-up systems on the extraction efficiency

本实验考察不同溶剂体系和净化条件下,对苯基丁氮酮和氨基比林的提取效率和净化能力。分析苯基丁氮酮和氨基比林的性质,二者均为中等极性化合物,根据相似相容的原理,应使用中等极性的有机溶剂进行提取。选择乙腈、酸化乙腈、丙酮和乙酸乙酯作为提取溶剂。实验结果如图2所示,使用丙酮-水体系提取的苯基丁氮酮和氨基比林色谱峰形和回收率较好(图2b);使用其他溶剂体系提取的苯基丁氮酮色谱峰相差不大,但氨基比林有明显的干扰峰存在(图2c~g)。经过分析,发现丙酮-水体系提取的氨基比林质谱图纯度很高,主峰是m/z 232.14497的氨基比林母离子(图2h);而其他提取体系提取液中氨基比林质谱图有一个明显的干扰峰(图2h~j),这些提取液质谱图中的主峰为干扰化合物m/z 232.15491,目标化合物氨基比林的质谱峰信号仅为此干扰峰的10%,严重影响色谱峰形和定量结果。

确定了丙酮-水作为提取溶剂体系后,考察净化剂对样品基质除杂和被测化合物的吸附情况。选用常用的C18和PSA填料作为净化剂对基质进行净化。结果发现,PSA能够有效去除由动物肌肉组织中存在的血液带来的红色,但同时对苯基丁氮酮有较强的吸附。如图2f和图2g所示,使用PSA净化后基本无法检测到苯基丁氮酮色谱峰,并出现了保留时间为8.61min的干扰峰。而使用C18净化后的样品中两种镇痛剂都有较好的峰形和纯度。因此,选用丙酮-水C18作为提取和净化系统。

实验发现丙酮-水体系虽然对两种镇痛剂都有较好的提取效率,但是丙酮和水两相极易互溶,因此提取时加入的分散剂MgSO4和盐NaCl的配比会对前处理过程中提取溶剂的分层产生重要影响。在提取过程中,MgSO4主要起对样品研磨和基质分散的作用,NaCl主要使水处于离子饱和状态,有助于水相和有机相的分层。实验尝试了不同比例的MgSO4和NaCl配比,发现MgSO4的使用量对溶剂分层影响较小,而NaCl的使用量是影响溶剂分层的主要因素。通过实验,作者使用了比其他溶剂体系更多的NaCl,使用1g NaCl可以使水相和丙酮相达到良好的分离。

2.2 基质效应、标准曲线和定量限

实验发现,苯基丁氮酮和氨基比林测定过程中样品的基质干扰非常明显。取空白样品按1.3.4节进行前处理,以此基质提取液作稀释液配制混合标准溶液,与直接用50%乙腈溶液配制的标准溶液对比,发现基质抑制效率约为25倍。为扣除此基质效应,本实验采用空白样品配制基质标准曲线。在空白样品中添加不同量的苯基丁氮酮和氨基比林,前处理后按质量浓度由高至低检测,直到获得信噪比等于10(RSN=10)的质量浓度,确定其为定量限。本实验中,牛肉中苯基丁氮酮和氨基比林的定量限分别为5μg/kg和1μg/kg。取空白样品进行前处理,以此基质提取液作稀释液配制混合标准曲线,以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算,苯基丁氮酮在5.0~100.0μg/L范围内线性关系良好(r≥0.995),氨基比林在1.0~100.0μg/L范围内线性关系良好(r≥0.995)。

2.3 方法的回收率和精密度

用空白牛肉试样进行添加回收率和精密度实验。牛肉样品中添加水平为5.0、10.0、20.0μg/kg,混合后静置,使标准溶液被样品充分吸收,然后按照本方法测定,每个添加水平测定6次,计算加标回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表 1 牛肉中苯基丁氮酮和氨基比林的回收率和相对标准偏差(n=6)

Table 1 Recovery rates and relative standard deviations (RSDs) of phenylbutazone and aminopyrine in beef (n = 6)

镇痛剂

添加量/(μg/kg)

平均回收率/%

RSD/%

苯基丁氮酮

5.0

10.0

20.0

78.0

82.6

76.7

7.2

12.9

9.4

氨基比林

5.0

10.0

20.0

82.8

85.9

78.2

5.6

7.4

8.1

 

3 结 论

本实验建立了一种快速有效的动物肌肉组织中苯基丁氮酮和氨基比林的超高效液相色谱-高分辨质谱检测方法,获得了满意的分离效果和检测灵敏度,回收率、精密度和定量限均满足残留分析的要求。讨论了不同提取溶剂对QuEChERS提取方法的影响,研究发现使用丙酮-水系统对苯基丁氮酮和氨基比林都有较好的提取效果,在提取时应适当增加NaCl的加入量,以促使水和丙酮的分层。本实验为QuEChERS提取技术溶剂选择拓宽了思路,为动物源食品中非甾体类镇痛剂的检测提供了快速、准确、高灵敏度的方法。

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收稿日期:2013-03-25 

基金项目:国家质检行业公益性科研专项(201210029);国家质检总局科研计划项目(2012IK145;2013IK146)

作者简介:张海燕(1986—),女,硕士研究生,研究方向为分析化学。E-mail:354751072@qq.com

*通信作者:叶晓霞(1969—),女,教授,博士,研究方向为有机化学。E-mail:yxx@wzmc.edu.cn