樟芝发酵液挥发性物质提取方法及成分比较

白岩岩1,2,贾 薇1,*,张劲松1

(1.上海市农业科学院食用菌研究所,农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,
国家食用菌加工技术研发分中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海 201403;

2.河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450002)

 

要:采用4种常规萃取剂以及固相微萃取对樟芝发酵液中的非极性香气成分进行萃取分析,并对不同碳、氮源获得的挥发性物质进行比较和分析。结果发现,樟芝发酵液中含有大量的呈香物质,采用不同的萃取方法,得到的香气成分种类各不相同:用乙醚、或正戊烷-乙醚(1:1,V/V)萃取,得到的醛类成分数量最多,达到9种;正戊烷-乙醚(1:1,V/V)和正戊烷-二氯甲烷(2:1,V/V)为萃取剂,检测到的香气成分达50多种,但对醛类物质的萃取效果较差;使用乙醚萃取和SPME得到的香气种类接近,在40种左右;而石油醚萃取,效果最差。综合毒性和成本等因素,选取对醛类萃取效果较好的乙醚作为萃取剂进行分析。不同的碳、氮源获得的发酵液,挥发油中香气成分种类繁多,醛类香气成分的相对含量差别很大。以葡萄糖为碳源的发酵液中,醛类百分含量最高,约21.90%;以蛋白胨为氮源的发酵液中,醛类相对含量高达41.60%。结果表明,以葡萄糖和蛋白胨为碳、氮源的培养基有助于富集樟芝发酵液醛类香气成分。

关键词:樟芝;萃取;发酵液;香气成分;乙醚

 

Comparison of Different Extraction Methods for the Analysis of Volatile Components of the Fermentation Broth of Taiwanofungus camphoratus

 

BAI Yan-yan1,2,JIA Wei1,*,ZHANG Jin-song1

(1. Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, National R&D Center for Edible Fungi Processing, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China;

2. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

 

Abstract:Different extraction methods were comparatively evaluated for their extraction efficiencies for volatile aroma compounds in the fermentation broth of Taiwanofungus camphoratus. Changes in the composition of volatile compounds produced from different carbon and nitrogen sources in the fermentation medium were analyzed by liquid-liquid extraction and GC-MS. Results showed that there were large variations in the types and contents of volatile compounds extracted with different methods from the fermentation broth of T. camphoratust. The aldehydes extracted using diethyl ether or n-pentane-diethyl ether (1:1, V/V) had the most diverse composition, consisting of 9 compounds. Although more than 50 compounds were extracted using n-pentane-diethyl ether (1:1, V/V) or dichloromethane-n-pentane (2:1, V/V), aldehyde components were less. About 40 compounds were identified using ether extraction or solid phase microextraction (SPME). The extraction efficiency of petroleum ether was the worst. From the viewpoint of toxicity and cost, ether was chosen as the best extraction solvent. The composition of volatile compounds in the fermentation broth varied with different carbon and nitrogen sources. The relative content of aldehydes was approximately 21.90% and 41.60%, with glucose as the carbon source and peptone as the nitrogen source, respectively. These results indicate that glucose and peptone are in favor of the generation of volatile aldehydes in the fermentation broth of Taiwanofungus camphoratus.

Key words:Taiwanofungus camphoratus;extraction;fermentation broth;volatile components;ether

中图分类号:Q939.96 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)24-0163-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324034

樟芝(Taiwanofungus camphoratus)又称牛樟芝、樟生薄孔菌、牛樟菇、红樟芝、樟菇、樟菰、樟窟内菰,属于多孔菌科(Polyporaceae)、台芝属(Taiwanofungus),是原产台湾的一种珍稀药用真菌,有“台湾森林中之红宝石”的美誉[1]。具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、解毒等功效[2-6]。由于目前樟芝还无法大规模的人工栽种,且生长缓慢,而牛樟树又被列为珍稀保护树种,严禁砍伐,致使其子实体价格高涨[7]。而采用液体发酵技术来生产菌丝体和发酵液,周期短、成本低,并且药理实验证明樟芝的菌丝体及发酵液同样具有抗癌[5]、抗肝炎[3]等活性成分,且其作用效果接近于子实体,故具有很好的应用前景[8-9]。

樟芝的研究目前主要集中在人工栽培及其菌丝体生理活性物质的方面,对发酵液的香气成分研究较少。马刚等[10]发现樟芝发酵液挥发油中的活性物质对棉花枯萎病菌、沙门氏菌具有较强的抑制活性。何喆等[11]分别对采用PDA固体培养基和由葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁配比的液体培养基获得的樟芝菌丝体中的挥发性化合物进行了比较研究,证明樟芝发酵产物的总体香味主要为蘑菇香、水果香和花香,且发现蘑菇醇、3-辛酮、蘑菇醇乙酸酯、γ-十二内酯等物质是菌丝体中的主要挥发性化合物。Liu Hua等[12]对以葡萄糖和豆饼粉为碳氮源的樟芝发酵液中的香气成分进行气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术和电子鼻的分析,发现樟芝发酵液中主要的香气成分有奶香、花香和果香等,而且其中气味较浓的化合物为3-羟基-2-丁酮。但采用不同的碳、氮源发酵,并对其相应发酵液中的香气成分以及含量变化的对比研究目前未见报道。

-液萃取是广泛应用于香气物质提取的方法之一[13],大量的实验结果表明,液-液萃取具有高的分配系数[14],且能够萃取的香气物质种类范围宽、数量多。但不同的萃取剂对分析结果影响较大。本实验对4种萃取剂以及固相微萃取(solid phase microextractionSPME)的萃取方法进行了对比分析;继而采用液-液萃取同GC-MS技术相结合的分析手段,比较了不同碳、氮源培养获得的樟芝发酵液的挥发性物质的成分以及相对含量,以期为更好的利用液-液萃取的方法研究樟芝发酵液中的香气成分提供参考,也为进一步利用樟芝发酵液,富集某些具有经济价值的香气成分提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟芝菌株由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心保藏。

酵母粉 英国Oxoid公司;其他所有化学试剂均为分析纯 国药集团上海化学试剂有限公司。

不同碳源培养基[15]:2.5g/100mL的碳源(果糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、淀粉或麦芽糖),0.5%的酵母粉为氮源,0.1% K2HPO4,0.05% MgSO4,0.01% VB1,自然pH值。

不同氮源培养基[15]:0.5g/100mL的氮源(酵母粉、蛋白胨、牛肉膏或硫酸铵),2.5%葡萄糖,0.1% K2HPO4,0.05% MgSO4,0.01% VB1,自然pH值。

1.2 仪器与设备

DKY-Ⅱ回转式恒温调速摇床柜 上海杜科自动化设备有限公司;LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司;6890N气相色谱-质谱联用仪(配有GCXGC调制器)、890A气相色谱-质谱联用仪(配有电子捕获检测器及NIST 08数据库) 美国Agilent公司;PDMS/DVB (65μm)萃取头 上海洽姆仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樟芝发酵液的制备

将液体种子以接种量10%(V/V)接种到不同的碳、氮源培养基中,250mL三角瓶装液量为100mL,150r/min、26℃、恒温培养8d后,发酵液滤纸过滤,上清液于4℃保存备用。

1.3.2 芳香成分萃取方法优化

以硫酸铵为氮源、葡萄糖为碳源的发酵培养液的滤液分别以乙醚、石油醚、正戊烷-二氯甲烷(2:1,V/V)、正戊烷-乙醚(1:1,V/V)为萃取剂,以1:1(V/V)的比例连续萃取3次,合并滤液,旋转蒸发仪40℃减压浓缩,得到具有浓郁芳香气味的油状物质,-20℃保藏备用。

SPME样品处理:温度70℃,加热15min,萃取15min;振荡速率250r/min,解吸时间2min。

1.3.3 不同萃取方法芳香成分的测定

1.3.3.1 不同萃取方法的色谱条件

色谱柱:DB-5MS(30m×0.25mm,0.25μm);DB-17HT(1.5m×0.1mm,0.15μm);升温程序:60℃保持4min,以8℃/min升至290℃,保持15min;进样温度250℃;进样量1μL;分流比2:1;载气:氦气(99.999%);流速1.0mL/min;接口温度270℃。

1.3.3.2 质谱条件

电离方式EI+;电子能量70eV;采集速率10spectra/s;检测器电压1450V;扫描方式为全扫描;质量扫描范围m/z 20~500。

1.3.4 乙醚萃取芳香成分测定

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱:DB-5MS(30m×0.25mm,0.25μm);升温程序:60℃保持4min,以8℃/min升至290℃,保持17.25min;进样温度270℃;进样量1μL;分流比5:1;载气为氦气;流速1.0mL/min;接口温度280℃。

1.3.4.2 质谱条件

电离方式EI+;电子能量70eV;检测器电压1470V;扫描方式为全扫描;质量扫描范围m/z 33~500;溶剂延迟时间3min。

1.4 芳香成分分析及相对含量计算

对从不同发酵液中所有萃取得到的芳香成分进行检测,检测结果经计算机普库(NIST/Wiley)检索和分析,再结合文献进行人工谱图解析确定;运用峰面积归一法,求得各香气成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取的发酵液中的香气成分分析

表 1 不同提取方法总香气成分种类对比

Table 1 Comparison of the types of total aroma components using different extraction methods

萃取方法

种类

总香味成分

酯类

醛类

醇类

酸类

酮类

其他

乙醚

39

10

9

7

1

3

9

石油醚

4

1

1

0

0

0

2

正戊烷-二氯甲烷

51

15

3

14

0

4

15

正戊烷-乙醚

55

14

9

14

0

6

12

SPME

44

16

7

10

2

2

7

 

 

如表1所示,以正戊烷-乙醚(1:1,V/V)为萃取剂,得到的香气成分最多,检测到55种,醛类物质检测到9种;以正戊烷-二氯甲烷(2:1,V/V)为萃取剂,检测到51种,但其对醛类成分萃取较差;乙醚萃取和SPME方法得到的香气种类比较均衡,且数量接近,分别为39种和44种;石油醚萃取的效果最差,仅检测到4种成分;乙醚萃取得到的醛类物质与正戊烷-乙醚(1:1,V/V)萃取所得相同,达到9种。正戊烷、乙醚、二氯甲烷皆为有毒有机溶剂,但二氯甲烷毒性比乙醚大;正戊烷和SPME的价格比较昂贵,故本实验从醛类化合物种类的角度出发,结合毒性、价格等方面,采用乙醚作为萃取剂。

2.2 不同碳源发酵液中芳香成分分析

表 2 不同碳源发酵液中各香气成分总含量

Table 2 Concentrations of different groups of aroma components in fermentation broths of different carbon sources

%

碳源发酵液

醇类

醛类

酯类

酮类

酸类

其他

蔗糖

29.34

5.89

56.55

5.66

1.03

1.52

葡萄糖

49.05

21.90

4.30

14.32

10.43

0

果糖

34.30

5.34

1.94

33.97

24.45

0

甘露醇

82.47

3.04

0

1.48

7.67

5.34

 

 

表 3 不同的碳源发酵液中香气成分的种类及相对含量

Table 3 Aroma components and their relative concentrations in fermentation broths of different carbon sources

%

香气成分

碳源发酵液

蔗糖

葡萄糖

果糖

甘露醇

醇类

 

 

 

 

1-辛烯-3-醇

0.42

苯乙醇

5.46

22.61

12.30

10.71

4-甲基-5-噻唑乙醇

20.10

25.02

21.15

71.76

1-戊烯-3-醇

0.95

糠醇

2.61

0.42

异丙醇

0.07

苯甲醇

0.51

0.85

呋喃甲醇

0.22

酮类

 

 

 

 

菠萝酮

1.76

3.86

2.85

环己酮

0.69

麦芽酚

1.63

0.37

0.29

二羟丙酮

5.11

1.16

环戊酮

0.44

3-甲基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮

0.10

0.24

1-戊烯-3-酮

0.12

0.63

3-乙基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮

27.34

2,3-丁二酮

1.19

吡喃酮

1.58

4.69

1.38

酯类

 

 

 

 

γ-癸内酯

55.03

乙酸甲酯

0.30

0.59

糠酸甲酯

0.63

0.74

乙酸苯乙酯

0.51

α-庚基-γ-丁烯内酯

1.91

0.39

2-羟基丙酸乙酯

0.96

γ-己内酯

0.89

呋喃甲酸甲酯

0.30

γ-十一内酯

0.54

醛类

 

 

 

 

糠醛

3.36

3.67

5-甲基糠醛

0.37

1.62

0.74

苯乙醛

2.16

1.51

0.78

3.04

5-羟甲基-2-糠醛

18.77

5-甲酰糠醛

0.15

酸类

 

 

 

 

正丁酸

1.03

5.75

苯乙酸

10.43

6.95

2-甲基戊酸

1.38

2-甲基己酸

0.12

3-甲基正丁酸

1.53

2-甲基正丁酸

0.39

α-羟基苯丙酸

16.00

其他

 

 

 

 

二甲基三硫醚

0.72

2,5-二甲基吡嗪

1.27

0.97

甲基吡嗪

0.25

-—

苏合香稀

0.18

2-乙基-3,5-二甲基吡嗪

0.35

二苄基硫醚

3.12

 

注:—. 未检测到或者不存在。下同。

 

2.2.1 醛类香气组分分析

由表2、3可以看出,不同碳源的发酵液中,均有醛类香气成分,但种类各不相同,且相对含量差别明显:在葡萄糖发酵液中,检测到醛类香气成分约21.90%,蔗糖、果糖、甘露醇3种发酵液中,醛类化合物的相对含量接近,分别是5.89%、5.34%、3.04%。4种碳源发酵液中检测到的醛类成分有苯乙醛、糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基-2-糠醛、5-甲酰糠醛,其中苯乙醛在4种碳源发酵液中皆有发现,5-羟甲基-2-糠醛只在葡萄糖发酵液中检测到,5-甲酰糠醛只在果糖发酵液中检测到。

2.2.2 总香气成分对比分析

从表2、3可以看出,蔗糖发酵液中检测出香气成分18种,其中酯类占56.55%,醇类占29.34%,是两种主要的香气种类,其主要的香气成分是γ-癸内酯、4-甲基-5-噻唑乙醇;葡萄糖发酵液中检测出香气成分22种,主要香气成分是醇类,占49.05%,含量最多的是4-甲基-5-噻唑乙醇,其次是苯乙醇,此外二羟基丙酮、5-羟甲基糠醛、苯乙酸的相对含量也较多;果糖发酵液中检测出香气成分21种,醇类占34.30%,其中含量最多的香气成分是3-乙基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮,其次是4-甲基-5-噻唑乙醇,而苯乙醇、α-羟基苯丙酸相对含量也比较高;甘露醇发酵液中,共检测出香气成分13种,主要为醇类,占82.47%,含量最多的香气成分是4-甲基-5-噻唑乙醇。

不同碳源发酵液中的主要成分γ-癸内酯、苯乙醇和4-甲基-5-噻唑乙醇等,分别呈果香、花香、肉香、奶香等[16-21]。其含量和种类的区别,构成了不同发酵液特有的香气。

2.3 不同氮源发酵液中芳香成分分析

表 4 不同氮源发酵液中总香气成分统计

Table 4 Concentrations of different groups of aroma components in fermentation broths of different nitrogen sources

%

氮源发酵液

醇类

醛类

酯类

酮类

酸类

其他

酵母粉

49.05

21.90

4.30

14.32

10.43

0

蛋白胨

49.47

41.60

7.63

1.03

0

0.27

硫酸铵

5.13

0.40

12.59

75.66

0

6.22

牛肉膏

56.13

19.38

5.42

5.74

0.48

12.85

 

表 5 不同的氮源发酵液中香气成分种类和相对含量

Table 5 Aroma components and their relative concentrations in fermentation broths of different nitrogen sources

%

香气成分

氮源发酵液

蛋白胨

酵母粉

硫酸铵

牛肉膏

醇类

 

 

 

 

1-辛烯-3-醇

0.42

0.42

0.34

苯乙醇

20.58

22.61

3.47

4.81

4-甲基-5-噻唑乙醇

26.17

25.02

1.32

18.84

异丙醇

0.07

2,6-二甲基庚醇

0.11

1-辛醇

24.20

月桂醇

0.19

苯甲醇

0.51

0.54

己二醇

2.30

2.16

2-乙基-1-己醇

5.03

苯丙醇

0.25

糠醇

0.42

酮类

 

 

 

 

2-仲丁基环己酮

4.55

菠萝酮

0.40

3.86

0.75

2-庚酮

1.60

二羟基丙酮

5.11

环戊酮

0.44

2-环戊基环戊酮

71.11

3-甲基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮

0.10

2-辛烯-4-酮

0.42

吡喃酮

0.63

4.69

2.97

1-戊烯-3酮

0.12

酯类

 

 

 

 

2-甲氧基乙酸乙酯

0.38

苯乙酸甲酯

0.55

γ-丙位辛内酯

3.62

10.73

2.07

苯乙酸癸酯

3.46

乙酸甲酯

0.30

γ-癸内酯

0.63

糠酸甲酯

0.73

乙酸苯乙酯

0.51

0.67

邻苯二甲酸二丁酯

0.43

α-庚基-γ-丁烯内酯

1.91

0.90

1.07

呋喃甲酸甲酯

0.31

γ-十一内酯

0.54

γ-十二内酯

0.29

0.84

醛类

 

 

 

 

糠醛

0.78

苯甲醛

1.86

5-甲基糠醛

0.71

1.62

4-乙基苯甲醛

1.32

苯乙醛

0.12

1.51

0.11

5-羟甲基-2-糠醛

39.56

18.77

15.37

甲基壬乙醛

0.72

对羟基苯甲醛

0.43

2-甲基庚烯醛

0.40

酸类

 

 

 

 

苯乙酸

10.43

0.41

4-甲基-2-氧代戊酸

0.07

其他

 

 

 

 

丁羟甲苯

0.09

甲基吡嗪

5.78

吡嗪

0.18

11.62

1,3-二乙基苯

1.04

乙苯

0.28

邻二甲苯

0.16

2-乙基-6-甲基吡嗪

0.19

 

 

2.3.1 醛类香气组分分析

表4、5表明,4种氮源的发酵液中,在蛋白胨发酵液中,醛类含量最高,相对含量达到41.60%,酵母粉发酵液和牛肉膏发酵液中醛类的含量接近,分别是21.90%和19.38%,而其在硫酸铵发酵液中仅有0.40%。在4种不同氮源发酵液中,共检测到9种醛类物质,其中5-甲基糠醛、苯乙醛、5-羟甲基-2-糠醛至少在2种氮源的发酵液中有所发现。糠醛和对羟基苯甲醛仅存在于蛋白胨发酵液中,2-甲基庚烯醛仅存在于硫酸铵发酵液中,4-乙基苯甲醛、甲基壬乙醛仅在牛肉膏发酵液中检测到。

2.3.2 总香气成分对比分析

由表4、5可看出,蛋白胨发酵液中,共检测出香气成分16种,主要种类为醇类(49.47%)和醛类(41.60%),含量最多的香气成分是5-羟甲基-2-糠醛,其次为4-甲基-5-噻唑乙醇、苯乙醇,其中苯乙酸甲酯、苯乙酸癸酯、对羟基苯甲醛等是蛋白胨发酵液中的特有香气成分;酵母粉发酵液中检测出香气成分22种,主要香气成分是醇类(49.05%),含量最多的是4-甲基-5-噻唑乙醇,其次是苯乙醇,此外二羟基丙酮、5-羟甲基-2-糠醛、苯乙酸的相对含量也比较多;硫酸铵的发酵液中,共检测出香气成分13种,主要的香气种类为酮类(75.66%),含量最多的是2-环戊基环戊酮,其次为γ-丙位辛内酯、2-仲丁基环己酮、甲基吡嗪、4-甲基-5-噻唑乙醇也较多,其中2-仲丁基环己酮、γ-十二内酯、甲基吡嗪等是硫酸铵发酵液所特有的香气成分;牛肉膏发酵液中,检测出香气成分29种,主要的香气种类有醇类(56.13%),含量最多的的香气成分是1-辛醇,4-甲基-5-噻唑乙醇次之,5-羟甲基糠醛含量也较多,其中月桂醇、邻苯二甲酸二丁酯等是牛肉膏发酵液所特有的香气成分。这些分别呈现桃子、椰子、肉香和花香[16-21]等不同香气的成分构成了发酵液的不同香气风格。

3 结 论

-液萃取是提取挥发性成分的常用方法之一,本实验采用几种常规的萃取剂以及SPME的方法对樟芝发酵液香气萃取的结果进行了对比分析,发现不同的萃取剂所得总香气成分的数量以及种类差别明显,除了石油醚外其余的几种溶剂及方法皆能用于樟芝发酵液中香气物质的分析,但不同的萃取方法,对发酵液中不同种类香气成分的萃取效果不同。乙醚萃取和正戊烷-乙醚(1:1,V/V)萃取,对樟芝发酵液中醛类物质的萃取效果较好。正戊烷-乙醚(1:1,V/V)和正戊烷-二氯甲烷(2:1,V/V)为萃取剂,检测到香气成分达50多种,在萃取香气成分数量方面最好。乙醚萃取和SPME方法得到的香气种类均衡。

挥发油是药用真菌中的一类常见的有效成分,具有多种的生理活性,且在微生物中分布极广,大多有香气,应用广泛[22-23]。樟芝发酵液中的挥发性物质在医药、食品、香料工业、洗涤行业都具有很大的开发利用价值。对不同碳、氮源的樟芝发酵液进行GC-MS分析,发现发酵液中香气成分种类繁多,主要为醇类、醛类、酯类、酮类、酸类等,而香气成分的百分含量差别也很大。有研究表明许多高级醛和芳香醛类都具有愉悦的香气,它们是香精的重要组成成分,且在极低的浓度下就有良好的香气,在生产香精方面有着良好的前景[24]。实验通过对不同的碳源发酵液进行对比分析,发现以葡萄糖为碳源发酵液中醛类百分含量最高,约21.90%;不同氮源发酵液中,以蛋白胨为氮源的发酵液中醛类相对含量高,达41.60%,故葡萄糖和蛋白胨的培养基配比有助于富集樟芝发酵液醛类香气成分。此外,不同的碳、氮源发酵液中的主要香味化合物也不尽相同。因此在实际操作中可依据目的调配不同的培养基,从而达到富集所需香气成分的要求。此外,在本研究中还发现了具有凉香、薄荷香、留兰香,并带有樟脑底韵的2-仲丁基环己酮和具有水果香气的γ-十一内酯[25],以及具有药理作用但不属于芳香成分的烟醇,前者可以用于调配薄荷、留兰香、热带水果及辛香型的食用香精。

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收稿日期:2012-12-13

基金项目:上海市农业科学院科技发展基金项目(农科发2011(09))

作者简介:白岩岩(1987—),男,硕士研究生,研究方向为药用真菌活性成分。E-mail:lunhuixinyu@163.com

*通信作者:贾薇(1971—),女,副研究员,博士,研究方向为药用真菌活性成分。E-mail:jiawei@saas.sh.cn