LAMP法检测转基因大豆A2704-12品系

邵碧英1，陈文炳1，曾 莹1,2，陈 彬1，郑 晶1，缪婷玉1，彭 娟1

(1.福建出入境检验检疫局，福建 福州 350001；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

摘 要：根据转基因大豆A2704-12品系的特异序列设计了4套环介导等温扩增(LAMP)引物。通过反应温度优化、特异性测定，筛选出1套特异性强的LAMP引物。对筛选到的LAMP引物进行反应条件、反应体系的优化，建立了转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测方法。结果表明：建立的LAMP检测方法能特异、稳定地检测转基因大豆A2704-12品系，检测限达到0.1%(m/m)。应用建立的LAMP方法检测大豆及其制品中转基因大豆A2704-12品系，检测结果与实时荧光聚合酶链式反应(PCR)结果完全一致。

关键词：环介导等温扩增；转基因大豆A2704-12品系；特异性检测

Detection of Genetically Modified Soybean Line A2704-12 in Soybean and Its Products by LAMP Method

SHAO Bi-ying1，CHEN Wen-bing1，ZENG Ying1,2，CHEN Bin1，ZHENG Jing1，MIAO Ting-yu1，PENG Juan1

(1. Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China；

2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Abstract：According to the specific sequence of genetically modified soybean line A2704-12, four sets of primers for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) were designed. One set of highly specific primers was screened through optimizing the reaction temperature and determining the specificity. An LAMP method for the detection of genetically modified soybean line A2704-12 was developed after optimizing the reaction conditions and system. The specificity, sensitivity and stability of the LAMP method were evaluated. The results showed that the LAMP method could detect specifically and stably transgenic soybean A2704-12 strain with a low detection limit of 0.1%. The results of detection the A2704-12 strain in soybean and its products by the LAMP method were same as those from the real-time fluorescent PCR method.

Key words：loop-mediated isothermal amplification (LAMP)；genetically modified soybean line A2704-12；specific detection

中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0202-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324042

转基因大豆A2704-12品系具有抗草丁磷除草剂的特性，是农业部允许进口的转基因大豆品系之一，大豆及其制品进口时都要进行此品系的符合性验证。目前，检测A2704-12品系的方法包括普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法[1-2]和实时荧光PCR法[3-4]，其中实时荧光PCR法最为常用，而文献[3]与文献[4]中所有的引物、探针相同。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是在PCR基础上创建的一种新型核酸扩增技术，具有简便、高效、特异、快速等优点，在食源性致病菌[5-12]、转基因成分[13-19]筛选检测上已得到较广泛的应用，但在转基因特异品系[20-25]检测上的应用研究还很少。目前尚未见转基因大豆A2704-12品系LAMP检测方法的研究报道。本实验拟建立转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测方法，旨在用于大豆及其制品中转基因大豆A2704-12品系的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

转基因大豆A2704-12标准品DNA 北京世纪奥科生物技术有限公司。样品用TE缓冲液(pH8.0)溶解，稀释至100ng/μL。转基因大豆其他品系的标准品，转基因、非转基因实验材料由本实验室保存，参照文献[26]提取DNA，调整质量浓度至100ng/µL。所有DNA置于－20℃保存备用。

dNTPs溶液(每种核苷酸浓度为10mmol/L) 厦门泰京公司；Bst DNA聚合酶(8U/µL)、10×ThermolPol缓冲液 纽英伦生物技术(北京)有限公司；甜菜碱(5mol/L)、硫酸镁溶液(1mol/L) 美国Sigma公司；SYBR GreenⅠ荧光染料(10000×) 厦门百维信生物科技有限公司；FastStart Universal Probe Master 瑞士罗氏公司；LAMP专用薄壁管、稳定液 广州华峰生物科技有限公司。

用ddH2O将1mol/L硫酸镁溶液分别稀释至100、150mmol/L，置于4℃保存备用。用ddH2O将SYBR GreenⅠ荧光染料(10000×)分别稀释至1000×、10×，置于－20℃避光保存备用。

1.2 仪器与设备

Tgradient 梯度PCR仪 德国Biometra公司；7500实时荧光定量PCR仪 美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物的设计与配制

根据转基因大豆A2704-12品系的特异序列，委托广州迪澳生物科技有限公司设计，获得4套转基因大豆A2704-12品系的LAMP引物，分别标记为set1、set2、set3和set4(表1)。所有引物由上海生工公司合成。用ddH2O将外引物稀释至10µmol/L，环引物、内引物稀释至40µmol/L，按外引物、环引物、内引物体积比1:1:2的比例混匀，作为引物混合液。

表 1 4套LAMP引物序列

Table 1 Four sets of primers for LAMP

1.3.2 模拟阳性样品DNA的制备

取非转基因大豆的DNA溶液(100ng/µL)，将A2704-12标准品DNA配制成质量分数分别为5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的模拟阳性样品DNA。

1.3.3 LAMP引物的筛选

以5% A2704-12模拟阳性样品DNA为模板，置梯度PCR仪上进行4套LAMP引物扩增效果的测试。反应体系为：甜菜碱4µL、dNTPs 3.5µL、引物混合液2µL、10×缓冲液2.5µL、硫酸镁(100mmol/L)1µL、Bst DNA聚合酶1µL、DNA模板2µL，ddH2O调节总体积至25µL。在LAMP专用薄壁管的一侧加20µL稳定液和1µL SYBR GreenⅠ(1000×)，另一侧加反应混合液。反应条件：60～65℃，1h；80℃，5min。反应完成后，颠倒管子，将两侧的液体混匀、显色，立即在黑色背景下观察结果，呈橘色的即为阴性结果，呈绿色的即为阳性结果。

分别以ddH2O、非转基因大米、非转基因小麦、非转基因玉米、非转基因大豆、转基因大豆GTS-40-3-2品系、转基因大豆Mon89788品系和5% A2704-12品系的DNA为模板，根据温度筛选结果选定反应温度，测定特异性，筛选特异性好的LAMP引物。

1.3.4 LAMP反应温度的优化

在LAMP反应体系中加入荧光染料，在实时荧光定量PCR仪上进行实时监控。反应条件同1.3.3节。反应体系中除了SYBR GreenⅠ(10×)0.5µL、ddH2O 8.5µL外，其他成分同1.3.3节。重复2管。反应结束后，点击运行软件中的Multicomponent Plot观察、分析结果，以反应曲线的出峰时间为主，结合出峰高度、重复性作为评价指标，选取适宜的反应温度。

1.3.5 LAMP反应体系的优化

参照1.3.4节的方法，用1.3.3节筛选到的引物、1.3.4节优化的反应温度，选取Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度4个变量参数，进行单因素试验，对LAMP反应体系进行优化。其中Mg2+浓度分别为4、6、8、10mmol/L；甜菜碱浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2mol/L；dNTPs浓度分别为1.2、1.4、1.6、1.8mmol/L；引物混合液分别取1、2、4µL。以反应曲线的出峰时间为主，结合出峰高度作为评价指标，选取适宜的反应参数。

1.3.6 LAMP法的特异性、灵敏度、稳定性测定

选择不同转基因大豆品系和不同植物的DNA，按照优化好的LAMP反应条件和反应体系进行LAMP检测，从而验证建立的LAMP方法的特异性。各取2µL 按1.3.2节配制的模拟阳性样品DNA分别进行LAMP反应和实时荧光PCR反应，比较2种方法的灵敏度，实时荧光PCR法参照文献[3]进行。分别取2µL 5% A2704-12、非转基因大豆的DNA进行LAMP扩增，重复20管，以测定LAMP方法的稳定性。

1.3.7 大豆及其制品中转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测

各取2µL大豆及其制品的DNA，分别用LAMP方法、实时荧光PCR法检测是否含有转基因大豆A2704-12品系，比较两者结果。实时荧光PCR法参照文献[3]进行。

2 结果与分析

2.1 LAMP引物的筛选

Bst DNA聚合酶的适宜反应温度为60～65℃，因此选择60～65℃对4套引物进行测试，结果如图1所示。可知set1、set4引物在所选的6个温度条件下反应均出现阳性结果，set3引物在63.3℃时为阴性结果，而set2引物在所选的6个温度条件下反应均出现阴性结果，因而放弃set2引物进行下一步测试。

set1、set3、set4引物在60℃条件下进行LAMP反应均可出现阳性结果，因此选取60℃为反应温度，进行这3套引物的特异性测试，结果如图2所示。set1引物扩增非转基因大豆时得到阳性结果，set3引物反应后得到的均为阴性结果，而只有set4引物反应后得到的结果与预期一致，表明set4引物的稳定性、特异性最好。因此，选定set4引物作为转基因大豆A2704-12品系的LAMP引物。

A. set1引物；B. set2引物；C. set3引物；D. set4引物；1～6.反应温度分别为60.0、61.2、61.9、63.3、64.1、64.8℃。

图 1 4套引物在不同反应温度条件下的LAMP反应结果

Fig.1 LAMP results obtained with the four sets of primers at different reaction conditions

A. set1引物；B. set3引物；C. set4引物；1. ddH2O；2.非转基因大米；3.非转基因小麦；4.非转基因玉米；5.非转基因大豆；6.转基因大豆GTS-40-3-2品系；7.转基因大豆Mon89788品系；8.5% A2704-12品系。

图 2 3套引物在反应温度为60℃时的LAMP特异性反应结果

Fig.2 The specificity of LAMP with three of the four sets of primers at 60 ℃

set4引物包括内、外、环引物各1对，引物在转基因大豆A2704-12品系特异序列的位置如图3所示。外引物(F3、B3)扩增片段长度为266bp，包括了大豆基因组序列、外源大肠杆菌lacZ基因和CaMV 35S启动子序列，为转基因大豆A2704-12品系的特异序列，表明筛选到的这套引物的特异性在理论上也是有保证的。

加框部分为大豆基因组内含子；阴影部分为大肠杆菌lacZ基因；加下划线部分为CaMV 35S启动子。

图 3 筛选到的LAMP引物在DNA序列中的位置

Fig.3 The sites of the primers screened for LAMP method in the DNA sequence

2.2 LAMP反应温度的优化

由图4可知，反应温度为61、62℃时，两个重复的出峰时间差距较大，表明稳定性不好；反应温度为60、63、64℃和65℃时，两个重复的出峰时间均较一致，其中63℃时的出峰高度最高。因此，选用63℃作为A2704-12品系LAMP检测的最适宜反应温度。

a. 60℃

b. 61℃

c. 62℃

d. 63℃

e. 64℃

f. 65℃

图 4 LAMP反应温度的优化结果

Fig.4 Optimization of the LAMP reaction temperature

2.3 LAMP反应体系的优化

采用set4引物，在63℃条件下进行LAMP反应体系的优化，得出最佳参数为：Mg2+浓度6mmol/L、甜菜碱1.2mol/L、dNTPs 1.6mmol/L、引物混合液4µL(图5)。建立最佳反应体系：10×ThermoPol缓冲液2.5µL，外引物(10µmol/L)各0.5µL，环引物(40µmol/L)各0.5µL，内引物(40µmol/L)各1.0µL，dNTPs(10mmol/L)4.0µL，甜菜碱(5mol/L)6.0µL，硫酸镁(150mmol/L)1.0µL，Bst DNA聚合酶(8U/µL)1.0µL，DNA模板(100ng/µL)2.0µL，ddH2O 4.5µL。

1～4. Mg2+浓度分别为10、8、6、4mmol/L。

a. Mg2+浓度条件优化

1～4.甜菜碱浓度分别为1.2、1.0、0.8、0.6mol/L。

b.甜菜碱混合液用量条件优化

1～4. dNTPs浓度分别为1.8、1.6、1.4、1.2mmol/L。

c. dNTPs浓度条件优化

1～3.引物混合液用量分别为4、2、1µL。

d. 引物混合液用量条件优化

图 5 LAMP反应体系的优化

Fig.5 Optimization of the LAMP reaction system

2.4 LAMP法的特异性、灵敏度、稳定性

1. ddH2O；2.非转基因大米；3.非转基因小麦；4.非转基因玉米；5.非转基因大豆；6.转基因大豆DP-305423-1品系；7.转基因大豆DP356043品系；8.转基因大豆GTS-40-3-2品系；9.转基因大豆Mon89788品系；
10. 5%转基因玉米GA21品系；11. 5% A2704-12品系；12. A2704-12标准品。

图 6 LAMP法的特异性

Fig.6 The specificity of LAMP

如图6所示，仅5% A2704-12、A2704-12标准品的LAMP反应结果呈阳性，其他均为阴性，表明建立的转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测方法特异性很好，没有出现假阳性结果。

1.非转基因大豆；2～7分别为0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5% A2704-12品系。

图 7 LAMP法的灵敏度

Fig. 7 The sensitivityof LAMP

1～4分别为5%、1%、0.5%、0.1% A2704-12品系；5. 0.05% A2704-12品系、0.01% A2704-12品系、非转基因大豆。

图 8 实时荧光PCR法的灵敏度

Fig.8 The sensitivity of real-time fluorescent PCR method

由图7、8可知，建立的LAMP法与实时荧光PCR法的灵敏度一致，对转基因大豆A2704-12品系的检测限均可达到0.1%(m/m)。

稳定性测定结果表明，非转基因大豆均为阴性结果，而5% A2704-12品系均为阳性结果(图略)，表明建立的LAMP方法的稳定性很好。

2.5 大豆及其制品中转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测

用建立的LAMP方法检测大豆及其制品中是否含有A2704-12品系，结果如图9所示。除阳性对照外，仅进口转基因非种用黄大豆、美国进口转基因大豆、巴西进口转基因大豆、阿根廷进口转基因大豆中检出A2704-12品系，而市场流通的黄大豆及豆制品中均未检出A2704-12品系，这与实时荧光PCR法的检测结果(图10)完全一致。

A. 1～7分别为ddH2O、非转基因大豆、黄大豆、油豆腐、脱脂大豆、香干、正康鸡蛋豆奶；B. 1～7分别为正康草莓豆奶、进口转基因非种用黄大豆、美国进口转基因大豆、巴西进口转基因大豆、阿根廷进口转基因大豆、0.1% A2704-12品系、5% A2704-12品系。

图 9 大豆及其制品中A2704-12品系的LAMP检测

Fig.9 Results obtained for the detection of the A2704-12 strain in soybean and its products by LAMP

1. 巴西进口转基因大豆；2. 美国进口转基因大豆；3. 进口转基因非种用黄大豆；4. 5% A2704-12品系；5. 阿根廷进口转基因大豆；6. 0.1% A2704-12品系；7. 其他样品。

图 10 大豆及其制品中A2704-12品系的实时荧光PCR检测结果

Fig.10 Results obtained for the detection of the A2704-12 strain in soybean and its products by real-time fluorescent PCR method

3 结 论

本实验建立的转基因大豆A2704-12品系LAMP检测方法的特异性、稳定性好，对A2704-12品系的检测限达到0.1%(m/m)，与实时荧光PCR法一致，也与欧盟标准中的实时荧光PCR方法的检测低限一致[4]。由于转基因大豆A2704-12品系是允许商品化生产的、我国农业部允许进口的转基因品系，目前各国对允许商品化生产的转基因品系普遍采用标识管理，而对转基因产品管理最严的欧盟将标识的最低限量定为0.9%，因此本实验建立的转基因大豆A2704-12品系LAMP检测方法的灵敏度已达到目前对转基因产品进行标识的限量要求，可适用于大豆及其制品中转基因大豆A2704-12品系的检测。

参考文献：

[1] 杨剑波, 沈平, 王秀峰, 等. 农业部1485号公告-7—2010 转基因植物及其产品成分检测: 耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法[EB].

[2] 马卉, 王秀峰, 李莉, 等. 转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究[J]. 分子植物育种, 2011, 9(3): 376-380.

[3] 陈红运, 梁新苗, 陈双雅, 等. SN/T 2668—2010 转基因植物品系特异性检测方法[S].

[4] CRLVL13/05VP. Event-specific method for the quantification of soybean line A2704-12 using real-time PCR[S].

[5] 张体银, 郑晶, 黄晓蓉, 等. 环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌[J]. 中国食品学报, 2010, 10(3):  206-210.

[6] 罗海, 郑春亮, 万红梅, 等. 环介导等温扩增法快速检测产肠毒素大肠杆菌的研究[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(7): 127-130.

[7] 王羽, 王贞强, 张伟. 环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中的沙门氏菌[J]. 食品科学, 2010, 31(16): 277-280.

[8] 马寅众, 陈江源, 房国梁, 等. 环介导等温扩增法快速检测阪崎肠杆菌[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 329-332.

[9] 刘哲, 马晓燕, 张会彦, 等. 环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究[J]. 中国食品学报, 2012, 12(4): 174-180.

[10] 胡连霞. 应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌[J]. 食品工程, 2011(2): 36-39; 56.

[11] 蔡克周, 薛崇浪, 张昱, 等. 环介导等温扩增检测猪血中金黄色葡萄球菌[J]. 肉类研究, 2012, 26(11): 27-30.

[12] 刘伟, 侯丽萍, 赵良娟, 等. 环介导等温扩增技术检测食品中铜绿假单胞菌[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(5): 140-142.

[13] 王永, 兰青阔, 赵新, 等. 转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J]. 中国农业科学, 2009, 42(4): 1473-1477.

[14] 柳毅, 张军方, 张会彦, 等. 改良环介导等温扩增技术快速检测转基因大豆[J]. 大豆科学, 2009, 28(4): 706-710.

[15] 陈金松, 黄丛林, 张秀梅, 等. 环介导等温扩增技术检测含有CaMV 35S的转基因玉米[J]. 华北农学报, 2011(4): 11-17.

[16] 周琳华, 肖维威, 吴永彬, 等. 苏云金芽孢杆菌Cry1A(b)抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用[J]. 生物技术通报, 2012(4): 171-175.

[17] 王永, 兰青阔, 赵新, 等. 抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J]. 天津农业科学, 2012(1): 13-16.

[18] 肖维威, 周琳华, 吴永彬, 等. LAMP技术检测食品中转基因成分CaMV35S启动子的研究[J]. 中国食品学报, 2013, 13(4): 155-161.

[19] ZHANG Miao, LIU Yinan, CHEN Lili, et al. One simple DNA extraction device and its combination with modified visual loop-mediatedisothermal amplification for rapid on-field detection of genetically modified organisms[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(1): 75-82.

[20] 田芳, 王秀敏, 腾达, 等. 抗草甘膦转基因大豆及其加工产品的环介导等温扩增检测技术[J]. 动物营养学报, 2011, 23(3): 132-137.

[21] LIU Mei, LUO Yan, TAO Ran, et al. Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediatedisothermal amplification[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(11): 2365-2369.

[22] 张隽, 李志勇, 叶宇鑫, 等. 环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034[J]. 现代食品科技, 2012(4): 109-112.

[23] 吴少云, 唐大运, 李琳, 等. LAMP实时浊度法检测转基因水稻Bt63品系[J]. 食品与机械, 2012, 28(5): 79-82.

[24] 刘津, 凌莉, 吴少云, 等. 转基因大豆GTS40-3-2品系特异性环介导等温扩增法检测方法的建立与应用[J]. 粮食与饲料工业, 2012(12): 60-63.

[25] 闫兴华, 许文涛, 商颖, 等. 环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(5): 621-626.

[26] MÄDE D, DEGNER C, GROHMANN L. Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice[J]. European Food Research and Technology, 2006, 224(2): 271-278.