旋涡混合辅助超声提取-气质联用法分析食品添加剂中的咪唑

廖惠云,刘献军,庄亚东,张 映,熊晓敏,朱龙杰,李朝建,王珂清

(江苏中烟工业有限责任公司,江苏 南京 210019)

 

摘 要:建立旋涡混合辅助超声提取-气质联用法测定食品添加剂中咪唑的分析方法。采用旋涡混合器混合样品,使样品基质均匀分散于萃取溶剂中,再使用超声从基质中提取目标物,探讨萃取溶剂种类及超声时间等因素对目标物萃取效率的影响;之后甄选出合适的内标物,确定较佳的特征离子及其丰度比,分析进样量及分流比对目标物分离的影响,得到了合适的色谱分析条件。在优化的实验条件下,目标物咪唑在0.1~4.0μg/mL范围内具有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.9997,平均回收率为89.82%~109.20%,相对标准偏差(RSD)为1.97%~2.28%,检出限为0.20mg/kg,定量限为0.67mg/kg。结果表明:该方法简便、快速、灵敏、准确,适合于食品添加剂中咪唑含量的测定。

关键词:旋涡混合;超声提取;气质联用;咪唑;食品添加剂

 

Determination of Imidazole in Food Additives by Using Vortex Mixing Coupled with Ultrasonic Extraction and GC-MS

 

LIAO Hui-yun,LIU Xian-jun,ZHUANG Ya-dong,ZHANG Ying,XIONG Xiao-min,ZHU Long-jie,LI Chao-jian,WANG Ke-qing

(China Tobacco Jiangsu Industry Co. Ltd., Nanjing 210019, China)

 

Abstract:A gas chromatography-mass spectrometry method by using vortex mixing coupled with ultrasonic extraction was developed for the rapid determination of imidazole (IM) in food additives. In order to disperse the sample matrix into the extraction solvent, samples were homogenized by using a vortex mixer, and then extracted on an ultrasonic generator. The effect of solvent type and extraction time on the extraction efficiency of the analyte was discussed. Then, the appropriate internal standard was selected. The characteristic ions and their abundance were determined. Chromatography conditions such as injection volume and split ratio were optimized. Under the optimal conditions established in this study, the calibration range of IM was in the range of 0.1–4.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.9997, the average recoveries were in the range of 89.82%–109.20% with relative standard deviations of 1.97%–2.28%. The detection limit and quantitation limit for IM were 0.20 mg/kg and 0.67 mg/kg, respectively. The results showed that the developed method was simple, rapid, sensitive, accurate and suitable for the rapid determination of IM in food additives.

Key words:vortex mixing;ultrasonic extraction;gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS);imidazole;food additives

中图分类号:O657.63;O625.31 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)24-0238-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324050

咪唑(imidazole),即1,3-二氮唑,在医药、工业上应用范围广泛[1-4]。咪唑是许多药品的重要组成部分,其一个主要用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化,许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑,通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌呤中也含有咪唑。此外,咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分,具有刺激中枢神经系统的作用;在工业上,咪唑被广泛用作某些过渡金属(如铜)的缓蚀剂,许多工业上的重要化合物也含有咪唑衍生物,其中耐高温的聚苯并咪唑材料(PBI)中含有苯并咪唑(咪唑与苯环稠合)和另一个苯环相连的结构,常被用作阻燃剂。毒理学数据表明咪唑有毒,对环境可能有危害,对水体尤其应给予特别注意。

一般说来,咪唑并不直接当作食品添加剂使用,很大可能是作为副产物而被引入使用。因此,为了规范其使用,有必要建立相应的检测方法。咪唑衍生物有许多相关的文献[5-21]报道,但是咪唑本身的研究报道并不多,仅有的研究报道主要是使用气相色谱的方法来测定咪唑[22-23]。为此,本实验在以往研究的基础上,针对食品添加剂基质来源不一、复杂多样的特点,以旋涡混合辅助超声提取处理样品的方式,建立了使用气相色谱-质谱内标法测定食品添加剂中咪唑的方法,为快速筛查、确认和定量测定食品添加剂中的咪唑提供科学的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙醇、环己烷、正己烷、二氯甲烷、甲醇(色谱纯) 德国Merck公司;异丙醇、甲苯、硫酸钠(均为分析纯) 南京化学试剂公司;咪唑(标样,纯度大于98%)、正十七烷(纯度大于99%)、反式茴香脑(纯度大于99%)、萘(纯度大于99%)、丙酸苯乙酯(纯度大于98%) 德国Dr Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

6890N/5975气相色谱-质谱仪 美国Agilent公司;HP-INNOWax毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm);TM-1旋涡混合器 无锡沃信仪器有限公司;KQ-500DE超声波发生器 昆山市超声仪器有限公司;振荡器 国华电器有限公司;TDZ4A-WS离心机 湘仪实验室仪器开发有限公司;电子天平(感量0.1mg) 瑞士Mettler Toledo公司;50mL离心管(PP材质) 美国Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 标准工作溶液的配制

内标储备液:准确称取0.2g(精确至0.1mg)内标丙酸苯乙酯,用乙醇溶解并定容至100mL,质量浓度约为2000μg/mL;内标溶液:准确移取0.1mL内标储备液,用乙醇定容至100mL,质量浓度约为2μg/mL。

一级标准储备液:准确称取0.1g(精确至0.1mg)咪唑,用乙醇溶解定容至100mL容量瓶中,标样质量浓度约为1000μg/mL;二级标准储备液:准确移取1mL一级标准储备液,用乙醇定容至100mL容量瓶中,标样质量浓度约为10μg/mL;标准工作溶液:分别准确移取0.1、0.2、0.5、1、2mL和4mL二级标准储备液至10mL容量瓶中,再分别准确移取内标溶液各1mL,用乙醇稀释定容、摇匀,配制系列标准工作溶液。该系列标准工作溶液质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0µg/mL和4.0µg/mL,其中内标质量浓度为0.2µg/mL。

1.3.2 样品前处理

对于能分散于乙醇的试样:准确称取0.5g(精确到0.1mg)试样于50mL离心管中,准确移入1mL内标溶液,再加入9mL乙醇溶剂,用旋涡混合器分散均匀,再置于超声波发生器内超声萃取20min,加入0.5g无水硫酸钠,摇匀后静置。试样于离心机内4000r/min离心5min,取上层清液过0.45µm有机相滤膜,然后进行GC-MS分析。

对于不分散于乙醇的试样:准确称取0.5g(精确到0.1mg)于50mL离心管中,加入1mL水,准确移入1mL内标溶液,用旋涡混合器分散均匀,再加入8mL乙醇溶剂,置于超声波发生器内超声萃取20min,加入0.5g无水硫酸钠,摇匀后静置。试样于离心机内在4000r/min离心5min,取上层清液过0.45µm有机相滤膜,然后进行GC-MS分析。

1.3.3 色谱和质谱条件

样口温度:250℃;进样量:1µL;分流方式:不分流进样;色谱柱:DB-5MS(30m×0.25mm,0.25µm);程序升温:初始温度80℃,以升温速率20℃/min,至150℃,再以升温速率5℃/min,至200℃;传输线温度:280℃;电离方式:电子电离(electron ionization,EI);电离能量70eV;离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃。

定量分析:采用选择性离子监测(selected ion monitoring,SIM)模式,以特征离子进行定量分析,目标物咪唑的特征离子为m/z 68、41(其中m/z 68为定量离子),内标丙酸苯乙酯的特征离子为m/z 104、57、91(其中m/z 104为定量离子),对每个离子的监测时间为50ms。

定性确证:试样待测液和标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处(±0.2min)出现,并且对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致,其丰度比与标准品相比应符合:相对丰度>50%时,允许±10%偏差;相对丰度20%~50%时,允许±15%偏差;相对丰度10%~20%时,允许±20%偏差;相对丰度≤10%时,允许有±50%偏差,此时可定性确证目标分析物。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 萃取溶剂的选择

表 1 萃取溶剂对加标样品中咪唑提取结果的影响

Table 1 Extraction efficiency of imidazole by using different solvents

mg/kg

样品属性

萃取溶剂

提取结果

分散于乙醇中的样品

正己烷

2.094

环己烷

2.278

甲苯

8.182

二氯甲烷

8.486

乙醇

8.671

甲醇

8.705

 

 

 

不能分散于乙醇中的样品

正己烷

2.085

环己烷

2.213

甲苯

2.395

二氯甲烷

2.509

乙醇

8.454

甲醇

7.539

 

依据有机溶剂的不同极性,选取了正己烷、环己烷、甲苯、二氯甲烷、乙醇及甲醇(极性系数分别为0.06、0.10、2.40、3.40、4.30和6.60)为萃取溶剂,以两个不同分散属性的香精样品(实测结果均未检测出目标物)加标样品为分析对象,按照上述分析方法,每个样品平行测定两次,取平均值作为提取效率的考察指标,结果见表1。从表1可以看出,不论是样品分散属性如何,弱、中极性的溶剂对咪唑的提取效率较差,而极性强的溶剂对咪唑的提取效率较好,同时综合考虑溶剂的毒性强弱,本实验选择乙醇作为萃取溶剂。

2.1.2 提取方式及条件

影响食品添加剂样品中目标物提取有一个重要因素,即样品分散的均匀性。为此,选择更为有效、简便的样品提取方式,即先采用旋涡混合方式将试样均匀分散于萃取溶剂中,再协助超声或振荡提取的方式从样品基质中提取目标物。以两个不同分散属性的香精样品(实测结果均未检测出目标物)加标样品为分析对象,按照上述分析方法,分别考察“旋涡混合+超声提取”和“旋涡混合+振荡提取”两种提取方式对目标物的提取效率,其中超声器功率为300W,振荡器频率调为160r/min,将提取时间分别设定为10、15、20、25、30min和40min,每个样品平行测定2次,取平均值作为提取效率的考察指标,检测结果见表2。

表 2 提取方式及萃取时间对加标样品中咪唑提取结果的影响

Table 2 Extraction efficiency of imidazole under different extraction methods

mg/kg

样品属性

萃取时间/min

旋涡混合+振荡
提取结果

旋涡混合+超声

提取结果

分散于乙醇中的样品

10

8.315

8.774

15

8.474

9.038

20

8.923

9.741

25

8.660

8.738

30

8.562

8.583

40

8.514

8.659

 

 

 

 

不能分散于乙醇中的
样品

10

8.030

8.577

15

8.280

8.922

20

8.469

8.736

25

8.447

8.268

30

8.424

9.010

40

8.904

8.500

 

 

从表2可以看出,不论是样品分散属性如何,总体而言,“旋涡混合+振荡提取”处理方式对样品中咪唑的提取效率不及“旋涡混合+振荡超声提取”处理方式,因此,本研究选取“旋涡混合+振荡超声提取”的样品前处理方式。进一步分析提取水平条件,对于能分散于乙醇中的样品而言,目标物的提取效率随时间延长先增加后减少,萃取时间为15~20min提取效率较好,而对于不能分散于乙醇中的样品,目标物的提取效率随时间延长的变化规律不一。综合考虑目标物在两种不同分散属性基质中的提取效率,结合操作效率因素,最后确定20min为样品的提取时间。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 内标的选择

在参考文献[24]的基础上,以质量浓度为2μg/mL的正十七烷、萘、茴香脑和丙酸苯乙酯为对象,考察其作为备选内标物对检测结果的影响,结果见图1。从图1可以看出,各备选内标物都能够与目标组分完全分离,其中,正十七烷、萘、茴香脑和丙酸苯乙酯保留时间依次渐近增大,峰宽也渐近增大;拖尾因子都接近于1,不存在脱尾或前伸现象,说明峰形对称情况良好。峰纯度分析未发现有杂质组分;从仪器定量限分析[25],萘灵敏度最高,丙酸苯乙酯次之,茴香脑和正十七烷差之。

基于内标物的峰位置应尽可能与待测组分的峰位靠近,但能与待测组分完全分开的原则,同时结合仪器定量检出限考虑[16],本实验采用丙酸苯乙酯作为首选内标物。

478905.jpg 

1.正十七烷;2.萘;3.茴香脑;4.丙酸苯乙酯;5.咪唑。

图 1 各备选内标物和目标物的色谱图

Fig.1 TIC chromatogram of imidazole and internal standard

2.2.2 特征离子的选择

478924.jpg 

478942.jpg 

图 2 内标丙酸苯乙酯(A)和咪唑(B)的质谱图

Fig.2 Mass spectra of propionic acid ethyl benzene (A) and imidazole (B)

基于食品添加剂样品来源广泛,基体背景较复杂及目标物含量较低等因素考虑,在使用GC-MS时,选择SIM模式对样品进行分析。内标丙酸苯乙酯的CAS号为122-70-3,其质谱图如图2A所示,分子离子m/z 178,但是其相对丰度太小,基峰离子m/z 104,紧随其后的特征离子m/z 57、91,三者的丰度比为100:25:9;目标物咪唑的CAS号为288-32-4,其质谱图如图2B所示,可以发现,其分子离子也是基峰离子m/z 68,相对丰度紧随其后的特征离子m/z 41,两者的相对丰度比为100:37。

2.2.3 进样量与分流比的设定

在保持其余色谱条件不变的情况下,通过调整进样量与分流比,对同一标准试样进行检测,以此考察内标物和目标物的出峰情况,具体色谱图见图3。对其进行分析,可以发现:进样量由2µL变为1µL时,内标物和各目标物的峰宽大幅减小,而在进样量不变、改变分流比时,内标物和各目标物的峰宽变化不大;减少进样量或提高分流比,内标物和各目标物的拖尾因子变化不大,但仪器的检测灵敏度下降。为此,基于优先保障内标物和目标物检测灵敏度的考量,设定仪器进样量1.0µL、分流比10:1。

478961.jpg 

图 3 不同进样量与分流比条件下目标物和内标的色谱图

Fig.3 TIC chromatograms of imidazole and propionic acid ethyl benzene under different injection volumes and split ratios

2.3 方法评价

2.3.1 线性关系、检出限和定量限

按照1.3.1节方法配制咪唑系列工作标准溶液,然后进行GC-MS分析,以目标物质量浓度与内标质量浓度之比为横坐标,以色谱图中目标物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标,进行线性回归分析,得回归方程及其相关参数。从表3可以看出,目标物在0.1~4.0μg/mL的质量浓度范围之内,工作曲线的相关系数(R2)大于0.999。用最低质量浓度标样当未知测试样品,重复进样10次,由测得的质量浓度值统计出标准当测试样品偏差,方法的检出限(LOD)以3倍标准偏差换算求得,方法的定量限(LOQ)以10倍的标准偏差换算求得。

表 3 方法的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 3 Linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit

线性方程

线性范围/(μg/mL)

R2

检出限/(mg/kg)

定量限/(mg/kg)

Y=0.392X-0.0356

0.1~4.0

0.9997

0.20

0.67

 

 

2.3.2 精密度实验

以一加标样品为分析对象,分别进行了日内精密度实验和日间精密度实验,日内精密度实验为相同样品在同一条件下平行测定6次(同一批次处理);日间精密度实验为相同样品在同一条件下测定,每隔1d测定1次,共测定6次,分别计算6次平行测定结果的相对标准偏差(RSD),测定结果见表4。表4显示,本实验方法的日内重复性的RSD<2%,日间重复性的RSD<4%,表明方法具有良好的精密度。

表 4 方法的精密度

Table 4 Precision of the method

编号

日内检测结果/(mg/kg)

日间检测结果/(mg/kg)

1

8.561

8.458

2

8.712

8.657

3

8.683

9.000

4

8.484

8.554

5

8.594

8.619

6

8.247

8.840

RSD/%

1.97

2.28

 

 

2.3.3 回收率实验

分别以不同基质的两个食品添加剂为对象,进行低、中、高3个不同水平的加标处理,然后按照上述标准前处理步骤进行处理,再进行GC-MS分析,计算其加标回收率,结果见表5。从表5可以看出,在低水平加标时,目标物的回收率在92.97%~96.60%之间;在中水平加标时,标物的回收率在89.82%~98.76%之间;在高水平加标时,标物的回收率在100.99%~109.20%之间。总体而言,该方法具有较好的回收率。

表 5 方法的回收率

Table 5 Recoveries of the method

样品属性

加标量/µg

检测量/µg

回收率/%

分散于乙醇
中的样品

4.394

4.245

96.60

12.850

12.691

98.76

25.013

27.313

109.20

 

 

 

 

不能分散于乙醇中的样品

4.394

4.085

92.97

12.853

11.544

89.82

25.150

25.400

100.99

 

注:—.样品基质中没检测出目标物。

 

2.4 样品测定

依据本实验建立的测定方法,对从南京食品添加剂市场采购的128份食品添加剂进行分析测定,所有样品的检测结果均低于方法的检出限,即未检测出样品中含有咪唑。

3 结 论

本实验采用旋涡混合辅助超声波提取的样品处理方式,系统探索样品前处理条件,优化色谱分析条件,建立使用气相色谱-质谱内标法测定食品添加剂中咪唑含量的方法。通过旋涡混合辅助超声波的方式,能针对不同溶解属性的样品有效地进行目标物的提取,此外色谱检测所用的SIM扫描方式能有效地消除复杂基体干扰。结果表明,本方法具有前处理效率佳、操作简便,选择性好、重复性高、定量准确等特点,适合于食品添加剂中咪唑的定性确证和定量测定。

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收稿日期:2013-01-05

基金项目:国家烟草专卖局资助项目(2012B046)

作者简介:廖惠云(1979—),男,工程师,硕士,主要从事卷烟产品分析检测及应用研究。E-mail:liaohy@jszygs.com