纳他霉素结合柠檬酸处理对葡萄采后
灰霉菌的抑制活性

隋莎莎1，李志文2，张 平2，农绍庄1,*

(1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116000；

2.国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384)

摘 要：以灰霉菌(Botrytis cinerea)为病原菌，采用滤纸片法、生长速率法、悬滴法、活体损伤接种法，研究不同质量浓度纳他霉素与柠檬酸之间的协同抑菌作用。结果表明：纳他霉素结合柠檬酸处理对葡萄采后灰霉菌的抑制活性显著(p＜0.05)，大于2者单独处理，以0.5～1.0g/L纳他霉素与1.0g/L的柠檬酸结合使用抑菌效果最佳，菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别较单独使用柠檬酸处理提高了69.93%和65.61%，较单独使用纳他霉素处理提高了33.24%和54.40%；对灰霉菌的菌丝生长和孢子萌发的半数抑制质量浓度(EC50)值分别为435.15、491.83mg/L；显著抑制了活体损伤接种处理中葡萄果实表面的病斑增长。由此说明，适宜质量浓度的纳他霉素结合柠檬酸处理对葡萄采后灰霉菌的抑制活性起到增效作用，可作为葡萄采后绿色保鲜剂的潜在资源。

关键词：纳他霉素；葡萄灰霉菌；柠檬酸；抑菌效果

Inhibitory Activity of Natamycin Combinedwith Citric Acid on Postharvest Botrytis cinerea in Grape Berries

SUI Sha-sha 1，LI Zhi-wen2，ZHANG Ping2 ，NONG Shao-zhuang1,*

(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116000, China；

2. Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products, Tianjin 300384, China)

Abstract：The synergistic inhibitory activity of natamycin and citric acid on Botrytis cinerea was evaluated by the methods of filter paper disc, growth rate, hanging drop slide and living damage inoculation, respectively. The results indicated that the inhibitory activity of natamycin in combination with citric acid on postharvest B. cinerea was higher significantly (p ＜ 0.05) than that observed with individual treatments. The best inhibitory effect was achieved by using 0.5–1.0 g/L natamycin in combination with 1.0 g/L citric acid and under this condition, the inhibition of mycelium growth and spore germination were increased by 69.93% and 65.61% over citric acid alone and by 33.24% and 54.40% over natamycin alone. The EC50 (50% inhibition concentration) of natamycin combined with 1.0 g/L citric acid was 435.15 mg/L for mycelium growth and 491.83 mg/L for spore germination. Moreover, the growth of disease spots on grape berries artificially wounded and inoculated with B. cinerea was inhibited significantly. In summary, the combination of natamycin with citric acid at appropriate concentrations exhibits synergistic inhibitory activity on postharvest infection of B. cinerea in grape berries and can be a potential antimicrobial agent for the preservation of postharvest grape berries.

Key words：natamycin；Botrytis cinerea；citric acid；inhibitory activity

中图分类号：TS255.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0299-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201324062

由葡萄灰霉菌(B. cinerea)引起的灰霉病是葡萄生产中危害最大的病害[1-3]，平均造成减产20%～40%，严重的可达60%以上。该病菌还会引起葡萄贮藏过程中的腐烂，缩短贮藏期，降低品质，是葡萄贮藏中的重要病原菌[4-5]。葡萄灰霉菌不仅会引起田间损失，而且残存在葡萄的病原菌在贮藏期同样可以潜伏侵染，造成损失，成为葡萄贮藏的限制性障碍[4]。目前种质资源中尚无抗灰霉病的品种，生产上主要依靠多菌灵、乙霉威等化学药剂进行防治。世界各国葡萄生产者普遍使用冷藏条件下SO2熏蒸新鲜葡萄以达到防霉防腐目的，SO2气体对灰霉菌具有强烈抑制作用，但SO2气体会使葡萄表面产生肉眼看不见的裂纹，造成汁液外渗，进而容易导致贮藏过程中腐烂及病害发生[6]。随着消费者对食品安全的关注和农产品出口中技术壁垒的增多，运用SO2熏蒸不再适合应用于葡萄灰霉病的防治，灰霉病防治已经成为生产中亟待解决的难题。

纳他霉素(natamycin)也称匹马霉素(pima-ricin)，属多烯大环内酯类抗真菌剂，能够选择性地抑制酵母菌和霉菌，有良好的理化稳定性[7]。降解后的纳他霉素在急性毒性和亚慢性毒性实验中对动物无损害[8]，已成为许多国家广泛使用的一种天然生物源食品防腐剂和抗菌添加剂。目前国内有关纳他霉素的应用大多集中在饮料、加工食品及个别果蔬种类的保鲜研究方面[9-12]，在葡萄贮藏保鲜领域的研究报道较少，而有关纳他霉素结合柠檬酸处理对于离体及活体采后灰霉菌抑制活性的研究更是鲜见报道。为此，本研究以玫瑰香葡萄为实材，研究了纳他霉素与柠檬酸复配使用对离体和活体接种的葡萄采后灰霉菌的抑制活性，以期为鲜食葡萄的无硫保鲜提供有效的方法依据及科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰香葡萄采自天津汉沽茶店葡萄园；灰霉菌(Botrytis cinerea)由本实验室在采后腐烂葡萄上分离纯化得到。

纳他霉素(95%原粉) 北京东方瑞德生物技术公司；柠檬酸(99.5%) 天津市津北精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；智能型数显鼓风干燥箱 上海成顺仪器仪表有限公司；智能型生化培养箱 上海琅玕实验设备有限公司；电子显微镜 上海光学仪器厂；电热恒温水浴锅 北京科威精益科技有限公司；水浴恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 实验处理

实验处理与分组如下：CK0：蒸馏水空白对照；CK A：1.0g/L的柠檬酸溶液；CKH2O：用蒸馏水精确配制质量浓度0.5g/L的纳他霉素悬浊液；不同质量浓度的纳他霉素结合1.0g/L柠檬酸抑菌液(C1～C6)：精确配制质量浓度1g/L(C6)的纳他霉素结合1.0g/L柠檬酸抑菌液，再将其以1.0g/L的柠檬酸稀释至质量浓度0.50(C5)、0.25(C4)、0.10(C3)、0.05(C2)、0.025g/L(C1)。

1.3.2 项目测定

1.3.2.1 病原菌的纯化与鉴定

供试菌种于2011年9月23日采自天津汉沽茶店葡萄园发病的葡萄果实。病果分装于洁净纸质样品袋中，防止污染。取典型症状的病果，经酒精消毒后，于无菌条件下，用消毒解剖刀在果实病斑中部纵切1刀，用接种针挑取1小块病果果肉组织，接种于PDA平板培养基上，28℃恒温培养72h。待长出菌落后，再挑取目标菌落边沿部分接种到新的PDA平板培养基上，依此接种多次，直至培养出纯化的目标菌落。依据文献鉴定，再将分离的病原菌接种到无病的果实上，能够正常发病，将病斑按以上相同方法分离、纯化，得到相同的病原菌，挑取菌落边缘菌丝及分生孢子进行显微镜观察、照相。具体方法参照文献[13]进行。

1.3.2.2 纳他霉素和柠檬酸对灰霉菌的抑制活性鉴定

采用抑菌滤纸圆片法[14]测定。分别观察各处理对灰霉菌的抑菌情况，并测量抑菌圈直径，每个质量浓度做3组平行，求其平均值，以此评价抑菌效果。

1.3.2.3 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长的抑制活性

采用菌丝生长速率法[15]测定。分别测定各处理对灰霉菌菌丝生长的抑制作用，用十字交叉法测定菌落直径，连续测定5d，计算菌丝净生长量，并按式(1)计算抑制率，经DPS统计软件分析求出毒力回归方程及半数抑制质量浓度(EC50)值。

(1)

1.3.2.4 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌孢子萌发的抑制活性

采用悬滴法[16]测定。分别测定各处理对分生孢子萌发的抑制作用，按式(2)、(3)计算不同质量浓度药剂对分生孢子萌发的抑制率，用DPS统计软件求出毒力回归方程及EC50值[17]。

(2)

(3)

1.3.2.5 纳他霉素对活体损伤接种后葡萄病斑面积的影响

先将PDA上纯化的灰霉菌配成1×106CFU/mL的孢子悬浮液，然后用直径2mm的灭菌铁钉在经体积分数70%乙醇表面消毒的葡萄果实中部分别刺孔2个，深度为4mm，然后用微量注射器吸取10μL孢子悬浮液注入刺口处，接种后的果实经1h后放入抑菌液中浸泡30s，取出自然晾干后装入PE袋中，扎紧袋口，恒温箱(20±2)℃条件下贮藏5d，用十字交叉法测量病斑直径并计算病斑面积。每处理用果粒30个，共3次重复，以接种后不做任何处理为对照。

1.4 数据处理方法

所用数据均采用Excel 2003转化为折线图，采用DPS 7.05统计软件进行差异显著性分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

A

B

C

A.菌丝呈灰白色绒状；B.分生孢子卵圆形、无色至淡灰褐色；C.分生孢子梗，聚生大量分生孢子。

图 1 菌丝、分生孢子和分生孢子梗

Fig.1 Botrytis cinerea mycelium, conidia and conidial infarction

菌丝分生孢子和分生孢子梗的形态特征见图1。在20℃条件下用PDA培养基培养，菌丝呈灰白色绒状，后期变成深灰色，5d即可产生大量分生孢子，肉眼可见大量分生孢子聚生的灰色颗粒(图1A)。经显微镜观察，病菌分生孢子梗数根丛生，直立或稍弯曲，(100～300)μm×
(11～14)μm，淡褐色，具隔膜，顶端呈l～2次分枝，分枝的末端膨大。上密生小梗，聚生大量分生孢子(图1C)。分生孢子卵圆形、椭圆形，无色至淡灰褐色，单胞，(10～15)μm×(5～10)μm(图1B)。根据菌落外观形态及镜检结果并查阅相关文献，认为该菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)，属半知菌亚门、丝胞纲、丝胞目、淡色孢科、葡萄孢属真菌，其有性态为富氏葡萄核盘菌[18-19]。

2.2 纳他霉素和柠檬酸对灰霉菌的抑制活性鉴定

0Cd

A

B

9.99±2.533Bc

C

28.58±5.142Ab

D

33.09±5.413Aa

A. CK0；B. CKA；C. CKH2O；D. C5；左下角数字为抑菌直径/mm；肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

图 2 纳他霉素和柠檬酸对灰霉菌的抑制活性

Fig.2 Inhibitory activity of natamycin in combination with citric acid on Botrytis cinerea

由图2可知，CK0处理灰霉菌生长迅速，滤纸片周围长满灰霉菌，没有抑菌圈存在，说明CK0处理几乎对灰霉菌没有抑制活性，CKA处理滤纸片周围有很小的抑菌圈，直径大约在10mm左右，CKH2O处理滤纸片周围有明显的抑菌圈，直径大约在28mm左右，C5处理滤纸片周围几乎没有灰霉菌生长，表明纳他霉素结合柠檬酸能更好发挥抑菌效果。

2.3 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长的抑制活性

图 3 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长的抑制活性

Fig.3 Growth-inhibitory activity of natamycin in combination with citric acid on Botrytis cinerea mycelium

由图3可知，与CK0相比，纳他霉素不同质量浓度处理均可抑制灰霉菌菌丝生长的速率。灰霉菌菌丝生长量随着纳他霉素质量浓度的增大而减小，其中以C6处理对灰霉菌菌丝生长的抑制作用最明显，菌丝生长量不到10mm，抑制率为80%左右，其次为C5处理，菌丝生长量在15mm左右，抑制率为70%左右，C1处理对灰霉菌菌丝生长的抑制作用较小，菌丝生长量为60～70mm，抑制率仅为1%左右。CKH2O和CKA处理的灰霉菌菌丝生长量分别为30mm和50mm左右，抑制率分别为40%和20%左右。结果表明纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长的抑制活性较明显。

由表1可知，随着培养时间的延长，EC50值最低为412.07mg/L，最高为475.43mg/L，说明在灰霉菌生长的不同阶段，纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长均表现出较好的抑制活性，抑菌效果十分稳定。

表 1 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌菌丝生长的抑制毒力

Table 1 Linear concentration dependence and EC50 of the growth-inhibitory activity of natamycin in combination with citric acid on Botrytis cinerea mycelium

2.4 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌孢子萌发的抑制活性

表 2 纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌孢子萌发的抑制活性

Table 2 Linear concentration dependence and EC50 of the inhibitory activity of natamycin in combination with citric acid on Botrytis cinerea conidia

注：肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)；不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下同。

由表2可知，与CK0相比，纳他霉素不同质量浓度处理均可抑制灰霉菌的孢子萌发。对灰霉菌孢子萌发的抑制作用随着纳他霉素质量浓度的增大而增大，其中以C6处理对灰霉菌孢子萌发的抑制作用最明显，抑制率为80.482%，其次为C5处理，抑制率为65.613%，C1处理对灰霉菌孢子萌发的抑制作用较小，抑制率仅为1.049%。CKH2O和CKA处理对灰霉菌孢子萌发的抑制率分别为11.211%和44.556%。抑制毒力方程计算结果表明纳他霉素结合柠檬酸处理对灰霉菌孢子萌发的抑制活性较明显，EC50值为491.83mg/L，与抑制菌丝生长的EC50值较接近。

2.5 纳他霉素对活体损伤接种后葡萄病斑面积的影响

由表3可以看出，葡萄损伤接种后，果实病斑面积不断增大。与CK0相比，纳他霉素不同处理均可抑制发病果实病斑的发展速率。果实病斑面积随着纳他霉素质量浓度的增大而减小，其中以C6处理的病斑面积发展最小为16.887mm2，仅为CK0的19.07%，其次为C5处理病斑面积为26.103mm2，仅为CK0的29.36%。CKH2O和CKA处理果实病斑面积分别为50.340mm2和77.230mm2，为CK0处理的56.84%和82.96%。结果表明C5和C6处理对减小葡萄的病斑面积效果最显著。

表 3 纳他霉素对活体损伤接种后葡萄病斑面积的影响

Table 3 Effect of natamycin on the disease spot area of grape berries after living damage inoculation

3 结 论

纳他霉素可以通过有效地抑制灰霉菌的生长从而提高一些果蔬的采后品质。Oostendorp[20]报道，纳他霉素可用于水果贮藏中，可有效防止灰霉菌等真菌引起的有氧降解。Guo等[21]研究了纳他霉素对室温条件下灵武长枣采后离体病原菌的抑制活性，结果表明纳他霉素处理对黑曲霉、灰霉菌均具有较好的抑制作用。Cong Fengsong等[22]采用含有纳他霉素的塑料薄膜包装哈密瓜，结果表明可有效抑制灰霉菌生长，防止哈密瓜在贮藏过程中的霉烂。Panagou等[23]研究表明，50mg/L的纳他霉素处理可有效抑制灰霉菌生长，有效抑制25℃贮藏条件下栗子果实霉烂的发生。本研究表明，1.0g/L的柠檬酸结合0.025～0.50g/L的纳他霉素在常温条件下对灰霉菌的菌丝生长和孢子萌发的半数抑制质量浓度(EC50)值分别为435.15、491.83mg/L，可有效抑制灰霉菌菌丝生长和孢子萌发，并对活体接种的灰霉菌具有显著的抑制活性，从而控制灰霉菌的潜伏侵染和大量繁殖，这与前人的研究结论一致。但葡萄长期贮藏一般处于低温条件下，因此本实验采用的抑菌剂在低温条件下对葡萄采后灰霉菌的抑制活性还有待进一步的研究。1.0g/L的柠檬酸对孢子萌发的抑制率大于柠檬酸与低质量浓度的纳他霉素结合对孢子萌发的抑制率，可能是由于纳他霉素和柠檬酸结合对灰霉菌孢子萌发具有双重质量浓度效应，表现为“低促高抑”，低质量浓度的纳他霉素在一定程度上能够促进灰霉菌的孢子萌发，具体原因还有待进一步研究。

本实验研究结果表明，适宜质量浓度的纳他霉素结合柠檬酸处理对葡萄采后灰霉菌的抑制活性起到协同增效作用。柠檬酸属于弱酸性，其自身具有抑菌活性。本课题组前期实验结果表明，纳他霉素在柠檬酸溶液中的溶解度随酸度的增加呈先增加后减小的趋势，pH值过低会导致纳他霉素自身的降解，在1.0～5.0g/L质量浓度范围内对纳他霉素具有最佳的溶解能力，考虑到葡萄自身对酸度的耐受能力，本实验选择1.0g/L的柠檬酸与纳他霉素联合抑菌，而这也可在一定程度上解释2者协同增效抑菌作用的原因。

综上所述，以1.0g/L的柠檬酸与0.5g/L纳他霉素两种天然食品添加剂联合使用抑菌效果最佳，能够显著抑制灰霉菌的菌丝生长和孢子萌发。

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