响应面法优化镰刀霉菌JN158产色素培养基

王永威，廖祥儒，黎循航，蔡宇杰*

（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

摘 要：用Plackett-Burman试验设计和响应面法（response surface methodology，RSM）对镰刀霉菌JN158产色素的发酵培养基7种营养物质配比进行优化。结果表明：蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O的添加量显著影响色素产量；用最陡爬坡试验使这3个显著因素的添加量接近最大响应区域，优化后，镰刀霉菌产色素的培养基添加量分别为：蔗糖30.18g/L、花生饼粉4.86g/L、K2HPO4•3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.5g/L、CaCl2
0.5g/L、FeSO4•7H2O 0.0122g/L，预测的最大色素产量是1.268g/L，验证实验得到的色素产量为（1.252±0.011）g/L，与预测值相近，优化后色素的产量是以前的2.9倍。

关键词：镰刀霉菌；色素；Plackett-Burman设计；响应面；培养基

Optimization of Medium Composition for Pigment Production by Fusarium sp. JN158 with
Response Surface Methodology

WANG Yong-wei, LIAO Xiang-ru, LI Xun-hang, CAI Yu-jie*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,

Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract: Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM) were applied to optimize 7 components in the medium for pigment production by Fusarium sp.JN158. The results showed that the yield of pigment was mainly influenced by the concentrations of glucose, peanut meal and FeSO4•7H2O. With central composite design and RSM, the optimal medium composition and concentrations was determined to be sucrose (30.18 g/L), peanut meal (4.86 g/L), K2HPO4•3H2O(1 g/L)，NaCl (0.5 g/L), MgSO4•7H2O (0.5 g/L), CaCl2 (0.5 g/L), and FeSO4•7H2O (0.0122 g/L). The experimental yield of pigment produced by Fusarium sp. JN158 in the optimized medium was (1.252±0.011) g/L, which was close to the predicted value of 1.268 g/L.

Key words: Fusarium; pigment; Plackett-Burman design; response surface methodology; medium

中图分类号：Q81 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0120-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401023

色素在人们的生活中起着重要的作用。色素可以改善食品的颜色，是决定产品品质的关键因素之一，同时，有的色素还具有营养保健和抗肿瘤的作用[1-6]。色素一般分为天热素色和合成色素。天然色素主要来源于植物、动物和微生物等，一般具有营养保健功能，合成色素虽然有很多优点，但是合成色素一般有毒性和致癌性[7-8]，因此，合成色素逐渐被天然色素取代。微生物色素是天然色素的重要发展方向，微生物色素不仅可以一年四季连续不断的发酵生产，能满足日益增加的社会需求，而且大部分微生物色素具有活性和医疗作用[9-11]。

有许多文献报道真菌在抗肿瘤方面的研究[12]，报道做多的是真菌多糖，常见的是冬虫夏草多糖[13]和灵芝多糖[14]，关于镰刀霉菌色素抗肿瘤的研究很少。本实验室筛选到一株产色素的镰刀霉菌（Fusarium sp.）JN158，初步研究表明，该菌株产生的色素具有抗肿瘤[15]作用，且该色素的溶解性质也很少见，因为只能溶解于酸性的有机溶剂中，极有可能有是一种新的色素结构，但是，该菌株的色素产量特别低，因此，有必要对该菌株进行发酵优化，提高色素产量，为色素的结构鉴定和抗肿瘤[15]作用研究提供足量的样品。

响应面优化法试验次数少、周期短、回归方程精度高[15]，可研究因素之间的交互作用。本实验首先用Plackett-Burman试验筛选出对色素产量有显著影响作用的因素[14]，然后用最陡爬坡试验逼近最大响应区域，最后进行响应面的试验设计与数据分析，得出最佳培养基成分配比，可为后续有关此色素的结构鉴定与抗肿瘤方面的实验奠定产量基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

镰刀霉菌Fusarium sp. JN158菌株 江南大学生物工程学院筛选并保藏。

1.1.2 培养基

PDA种子斜面培养基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、琼脂20，pH值自然。种子培养基（g/L）：土豆200、葡萄糖20，pH值自然。液态发酵培养基（g/L）：蔗糖40、花生饼粉4、K2HPO4•3H2O 0.5、NaCl 0.5、CaCl2 0.5、MgSO4•7H2O 0.5、FeSO4•7H2O 0.01，pH值自然。

1.1.3 试剂与仪器

高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；ALC-210.3电子天平 德国赛多利斯公司；PB-10 pH计 赛多利斯科学仪器有限公司；EZ585Q冷冻干燥机 美国FTS公司；Agilent1200液相色谱仪 美国安捷伦公司；722分光光度计 上海第三分析仪器厂；DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏试验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种子培养

在超净台内，从种子斜面上挑取一环菌落转移至装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于30℃、
200r/min摇床中培养28h，至种子液OD560nm值为3.0。

1.2.2 发酵培养

按6%的接种量移取镰刀霉菌种子液（OD560 nm值为3.0）至装有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，在
200r/min、30℃条件下的摇床中培养3d，获得色素发酵液。

1.2.3 色素提取

色素发酵液于8000r/min、4℃条件下的冷冻离心机中离心，去除上清液，用蒸馏水洗涤菌体后再次离心，重复3次，得紫色色素菌体；色素菌体在60℃的烘箱中烘干至恒质量，得干菌体；干菌体放于装有50mL用盐酸调至pH1的无水乙醇的250mL三角瓶中，在200r/min、30℃的摇床中浸提10h，然后，8000r/min、4℃冷冻离心，得到红色色素提取液，用1mol/L的NaOH溶液中和色素浸提液至pH7，此时，色素沉淀，再次冷冻离心，得到蓝色色素粗品，色素样品在510nm波长处有最大吸收[15]。

1.2.4 Plackett-Burman设计

用Design-Expert 8.0软件进行Plackett-Burman试验设计[16-19]，对色素液态发酵培养基中的7种营养成分进行筛选：蔗糖、花生饼粉、K2HPO4•3H2O、NaCl、MgSO4•7H2O、CaCl2、FeSO4•7H2O，每个变量分别取高（＋）和低（—）两个水平，以中心点添加量的1/4为Plackett-Burman设计步长，即高水平添加量为中心点添加量的1.25倍，中心点的添加量是低水平添加量的1.25倍，中心点试验3次，共15组试验，每组3次平行，忽略各因素之间的交互作用，设计结果见表1。

表 1 Plackett-Burman试验设计因素水平

Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman design

1.2.5 最陡爬坡试验设计

由Plackett-Burman试验数据分析结果可知，蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O对色素产量有显著影响，以其试验结果数据拟合得模型方程为依据，遵循最陡爬坡试验方法设计试验[20]，设计结果见表2。

表 2 最陡爬坡试验设计

Table 2 Factors and levels for steepest ascent design

1.2.6 中心组合试验设计（central composition design，CCD）

以寻找到的中心点为出发点进行CCD试验设计[21]，每个因素取3个水平。对实验数据结果进行多项式回归分析得到一个二次多项式方程，此方程反映了响应量与自变量的关系，由此可以找出响应面最高点，就是最佳的培养基营养成分的含量。中心组合试验设计及水平取值见表3。

表 3 中心组合试验设计水平及编码

Table 3 Factor and levels for central composite design

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果与分析

通过Plackett-Burman试验，筛选出对镰刀霉菌JN158液态发酵产色素有显著影响作用的营养成分。实验结果见表4，方差及回归分析分别见表5和表6。

由表5方差分析可知，该模型在95%概率水平下是显著的（P＜0.05），失拟合也显著（P＜0.05）；由表6回归分析的结果可知，对于色素的合成，X1、X2和X7在95%概率水平上有显著影响，即蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O的添加量，其中，蔗糖表现为负效应，花生饼粉和FeSO4•7H2O表现为正效应，其余各因素均为不显著。利用Design-Expert8.0软件对色素产量回归分析得一元回归方程：

Y=0.72－0.15X1＋0.06X2－0.042X3＋0.003X4－0.014X5＋0.02X6＋0.10X7 （1）

此模型P=0.0216＜0.05，说明回归方程显著；模型的决定系数：R2=0.908，表明90%实验数据的变化可用该模型解释。

表 4 Plackett-Burman设计及结果分析

Table 4 Experimental design and results of the Plackett-Burman design

表 5 Plackett-Burman试验结果方差分析

Table 5 Analysis of variance for the results of Plackett-Burman experimental design

注：*. P＜0.05，差异显著。下同。

表 6 Plackett-Burman试验设计对色素产量回归分析

Table 6 Regression analysis for pigment production based on Plackett-Burman experimental design

注：**. P＜0.01，差异极显著。下同。

2.2 最陡爬坡试验结果与分析

由模型方程（1）和回归分析的结果可以确定最陡爬坡路径。对于色素的产量，K2HPO4•3H2O（X3）、MgSO4•7H2O（X4）、NaCl（X5）、CaCl2（X6）在95%概率水平上差异不显著，故添加量不变。蔗糖（X1）、花生饼粉（X2）、FeSO4•7H2O（X7）在95%概率水平上差异显著，改变三者的添加量对色素的产量的变化有着重要的影响。

表2列出了蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O的改变方向及变化步长。由表7可知，试验4组对应的色素产量最高，达到1.023g/L。所以，以试验4组所对应的蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O的添加量为出发点进行后面响应面优化试验设计，即蔗糖28g/L、花生饼粉4.75g/L、FeSO4•7H2O 0.0121g/L。

表 7 最陡爬坡试验设计及结果

Table 7 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 中心组合试验结果与分析

以最陡爬坡试验得到的中心点为基点，进行色素产量优化的中心组合设计。试验设计和结果见表8。

表 8 中心组合试验设计及结果

Table 8 Experimental design and results of CCD

利用Design-Expert8.0软件对CCD的试验数据回归拟合得二次多项式方程：

Y=1.19＋0.12X1＋0.2X2＋0.022X7＋0.014X1X2＋0.047X1X7＋0.03X2X7－0.12X12－0.24X22－0.31X72 （2）

由表9方差分析及表10回归分析结果可知，此模型在99%概率水平下是显著的（P＜0.05），失拟合显著
（P＜0.05），表明该模型不需要添加更多的因素；另外，此模型的决定系数R2=0.9707，则此模型可解释97%的实验数据变化，R2adj=0.9179，与0.9707相近，为色素发酵提供一个合适的方程模型。

表 9 中心组合设计方差分析

Table 9 Analysis of variance for the experimental results of CCD

表 10 中心组合试验设计回归分析结果

Table 10 Regression analysis for pigment production based on CCD

注：***. P＜0.001，差异高度显著。

由图1响应面可知，蔗糖、花生饼粉和FeSO4•3H2O这三者之间相互有交互作用，对该回归方程求导得到此模型的最大值，X1=0.545，X2=0.439，X3=0.098，对应蔗糖、花生饼粉和FeSO4•7H2O的添加量分别为30.18、4.86g/L和0.0122g/L，最大响应值为1.268g/L。优化后的培养基：蔗糖30.18g/L、花生饼粉4.86g/L、K2HPO4•3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、
MgSO4•3H2O 0.5g/L、CaCl2 0.5g/L、FeSO4•3H2O 0.0122g/L。为验证预测结果，在此条件下进行色素发酵实验，得色素产量为（1.252±0.011）g/L，预测值和实际值相近，说明拟合性较好，菌株优化后的色素产量是优化前（0.432g/L）的2.9倍。

图 1 蔗糖、花生饼粉与FeSO4•7H2O的交互作用影响色素产量的
响应面图和等高线图

Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of sucrose, peanut meal and FeSO4•7H2O on pigment production

3 结 论

用Plackett-Burman试验筛选出了对镰刀霉菌产色素有显著影响作用的3个因素：蔗糖、花生饼粉、FeSO4•7H2O；由最陡爬坡试验找到接近最大相应区域的一点：蔗糖
28g/L、花生饼粉4.75g/L、FeSO4•7H2O 0.0121g/L；由响应面试验得出最佳培养及配比：蔗糖30.18g/L、花生饼粉4.86g/L、K2HPO4•3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.5g/L、CaCl2 0.5g/L、FeSO4•7H2O 0.0122g/L，预测的最大色素产量是1.268g/L，验证实验得到的色素产量为（1.252±0.011）g/L，与预测值相近，优化后色素的产量是原来的2.9倍，初步研究表明，色素有抗氧化活性和抗癌[12]作用。因此，色素产量的提高，为下一步的色素结构鉴定和抗癌作用方面研究提供足量的色素样品。

参考文献：

[1] 陈运中. 天然色素的生产及应用[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2007: 21.

[2] 邓祥元, 王淑军, 李富超. 天然色素的资源和应用[J]. 中国调味品, 2006, 10(10): 49-53.

[3] 王薇. 食用天然色素的营养保健作用[J]. 中国食物与营养, 2005(1): 45-47.

[4] 张庆杰, 丁霄霖. 番茄红素的保健作用与开发[J]. 食品与发酵工业, 1997, 23(4): 72-75.

[5] SAVA V M, YANG S M, HONG M Y, et a1. Isolation and characterization of melanic pigments derived from tea and tea polyphenols[J]. Food Chemistry, 2001, 73(2): 177-184.

[6] 汪秋安, 聂全文. 具有生理功能的天然色素: 类胡萝卜素[J]. 北京日化, 1999, 1(1): 16-21.

[7] 于立青, 彭蜀晋. 食品色素和人体健康[J]. 化学教育, 2005, 6(1): 3-5.

[8] 潘淮. 健康的美丽杀手: 合成色素[J]. 广州食品工业科技, 2003, 19(1): 53-54.

[9] BUTLER M J, DAY A W. Fungal melanins: a review[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1998, 44(9): 1115-1136.

[10] 王君, 张宝善. 微生物生产天然色素的研究进展[J]. 微生物学通报, 2007, 34(3): 580-583.

[11] ZHANG Hechun, CHEN Liang, JI Wenming, et a1. Identification of a blue-pigment producing Streptomyces and the properties of blue pigment[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 1999, 18(3): 23-28.

[12] 陆一. 抗肿瘤真菌药物的研究进展[J]. 中国药业, 2007, 16(11): 64-66.

[13] 赵跃然, 王美岭, 徐贝力. 冬虫夏草多糖对小鼠抗肿瘤作用的实验研究[J]. 基础医学与临床, 1992, 12(4): 52-53.

[14] 逯海燕, 郭顺星, 林晨. 真菌多糖等代谢产物的抗肿瘤药理研究综述[J]. 天然产物研究与开发, 2000, 12(6): 74-77.

[15] 李昌伟. Fusarium sp.jn158液态发酵产紫色素的提取及分离纯化和特性研究[D]. 无锡: 江南大学, 2012.

[16] SUMEYRA G. Optimization of culture conditions for Aspergillus sojae expressing an Aspergillus fumigatus galactosidase[J]. Bioresource Technology, 2011, 102: 4925-4929.

[17] 王维, 师俊玲, 杨保伟. Plackett-Burman设计法筛选影响茎点菌属在液体培养中生产松脂醇二葡萄糖苷的主要影响因子[J]. 食品科技, 2008, 6(2): 16-18.

[18] 李昌伟, 蔡宇杰, 廖祥儒. 镰刀霉菌(Fusarium sp.)JN158紫色素的提取及理化性质[J]. 食品与生物技术学报, 2011, 30(1): 140-142.

[19] ABDULAZIZ Q M. Application of Plackett-Burman factorial design to improve citrinin production in Monascus ruber batch cultures[J]. Botanical Studies, 2006, 47(4): 167-172.

[20] KRISHNAN S, PRAPULLA S G, RAJALAKSHMI D, et al. Screening and selection of media components for lactic acid production using Plackett-Burman design[J]. Bioprocess Engineering, 1998, 19(4): 61-65.

[21] NADIA A, MAHMOUD M. Polyglutamic acid(PGA) production by Bacillus sp. SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 69(6): 259-267.