微生物合成共轭亚油酸机理和方法的研究进展

李 垚,徐尔尼*,杨 欣,胡冰彬

(南昌大学生命科学与食品工程学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

 

摘 要:共轭亚油酸是人类近年来发现的最重要的功能性脂肪酸之一,作为一种新发现的营养素,已被广泛的应用到药品和食品中,应用范围正不断扩大。本文系统地总结目前微生物合成共轭亚油酸的研究现状,阐述生物合成共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的重要性,列举一些合成CLA的重要菌种,总结不同微生物合成CLA的机制,对比4种微生物合成方法的特点,展望微生物合成CLA的未来研究方向。

关键词:微生物;共轭亚油酸;机理;方法

 

Progress in Mechanism and Methods for Microbial Synthesis of Conjugated Linoleic Acid

 

LI Yao, XU Er-ni*, YANG Xin, HU Bing-bin

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University,
Nanchang 330047, China)

 

Abstract: Conjugated linoleic acid (CLA) is one of the most important functional lipids found in recent years. As a newly-found nutrient, CLA has been widely applied to medicine and food and its applications are currently extended in other fields as well. This review systematically summarizes the recent studies on microbial production of CLA, expoundes the significance of CLA biosynthesis, enumerates the important strains to synthetize CLA, summarizesthe different mechanisms for the synthesis of CLA by different microorganisms, compares the features of four methods for its microbial synthesis, and finally presumes the potential trends to synthesize CLA by microorganisms in the future.

Key words: microorganism; conjugated linoleic acid; mechanism; method

中图分类号:Q939.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)01-0271-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401054

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是指一系列含有共轭双键、具有不同位置和空间构型的十八碳二烯酸同分异构体的混合物,其中最具有生理活性的异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。CLA是人类近年来发现的最重要的功能性脂肪酸之一,从抗癌到预防心血管疾病、糖尿病,甚至体质量的控制等[1],现已成为生活在21世纪现代人不可或缺的健康食品。由于CLA是被应用到药品和食品中,因此一种安全且活性异构体含量高的合成方法是迫切需要的,而利用微生物合成CLA可以很好的解决这个难题。研究发现,乳酸菌利用亚油酸合成CLA,只有几个单一的反应,合成的CLA主要是c9,t11和t9,t11-十八碳二烯酸,而且乳酸菌细胞膜上存在的亚油酸异构酶,可以细胞形式反应,也可以游离酶的形式进行反应生产CLA。

1 有合成CLA能力的微生物菌种

目前人们已经检测发现了14个属250多株菌具有合成CLA的能力,这些菌属于肠球菌属、片球菌属、丙酸菌属、乳杆菌属等[2],合成CLA转化率高的微生物分别是瘤胃细菌,丙酸菌和乳酸菌等[3]。乳制品是CLA最主要的天然来源,c9,t11-CLA是其主要异构体[4],这与瘤胃细菌合成有关,例如反刍动物瘤胃中厌氧溶纤维丁酸弧菌属合成的c9,t11-CLA可能是亚油酸生物氢化合成硬脂酸过程中的一个中间产物[5]。Jiang等[6]研究发现费氏丙酸杆菌可以转化亚油酸合成CLA。Rainio等[7]研究表明费氏丙酸杆菌在对数期合成CLA的量很多,其中c9,t11占85%~95%。表1总结了目前发现的可以转化亚油酸合成CLA的微生物菌种,它们大都是厌氧或者兼性厌氧菌,在含有亚油酸的培养基中生长合成CLA,一些菌的静息细胞也可以催化亚油酸合成CLA,其中植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌是最有潜力的两个菌种。静息细胞转化法是指将微生物培养至一定阶段后分离出菌丝体,将其重新悬浮于不完全培养基(缺少某种营养物质,如氮源等)中,使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态,再加入底物,在适当的温度、pH值和振荡条件下进行转化的方法,它是一种将生长影响减至最小的生物转化方法。

表 1 不同微生物菌种合成CLA特点的比较

Table 1 Comparison of CLA produced by different microorganisms

菌种

方法/底物

CLA异构体类型(百分含量)

产量/(μg/mL)

参考文献

溶纤维丁酸弧菌

r/LA

cis-9, trans-11 (95%)

220

[8]

埃氏巨球形菌

c/LA

cis-9,trans-11(15%),trans-10,cis-12 (85%)

7*

[9]

费氏丙酸杆菌

c/LA

cis-9,trans-11 (93%)

265

[6]

罗伊氏乳杆菌

r/LA

cis-9,trans-11 (59%), trans-10,cis-12 (41%)

300

[10]

德氏乳杆菌

r/LA

cis-9,trans-11 (31%), trans-10,cis-12 (57%)

209

[11]

瑞士乳杆菌

c/LA

cis-9,trans-11

572

[12]

嗜酸乳杆菌

r/LA

cis-9,trans-11 (67%), trans-9,trans-11 (33%)

4900

[13]

植物乳杆菌

r/LA

cis-9,trans-11 (38%), trans-9,trans-11 (62%)

40000

[14]

植物乳杆菌

r/RA

cis-9,trans-11 (21%), trans-9,trans-11 (79%)

2400

[15]

植物乳杆菌

r/CO

cis-9,trans-11(26%), trans-9,trans-11(74%)

2700

[16]

短双岐杆菌

c/LA

cis-9,trans-11(91%), trans-9,trans-11(9%)

398

[17]

齿双歧杆菌

c/LA

cis-9,trans-11(78%), trans-9, trans-11(21%), trans-10,cis-12(1%)

160

[17]

乳双歧杆菌

c/LA

cis-9,trans-11(90%), trans-9, trans-11(8%), trans-10,cis-12 (2%)

170

[17]

婴儿双歧杆菌

c/LA

cis-9,trans-11(74%), trans-9, trans-11(19%), trans-10,cis-12(7%)

24.6

[17]

 

注:c. 活细胞发酵;r.静息细胞转化;LA.亚油酸;RA.蓖麻油酸;CO.蓖麻油;*.产量单位为μg/mg。

 

2 微生物合成CLA机理

CLA是亚油酸生物氢化过程中的中间产物,此过程主要由厌氧菌来完成,由于游离多不饱和脂肪酸能抑制厌氧菌的生长,因此,推测这个饱和反应可能是这类细菌自发的一个解毒作用[3]。由表1可知,几乎所有菌种都能生产c9,t11和t9,t11两种异构体,但是,控制异构体的比例仍旧显得很重要,研究发现改变反应条件可以控制异构体的比例。例如,添加丝氨酸、葡萄糖、硝酸银、氯化钠,可以减少t9,t11产生,导致选择性的合成c9,t11[18]。如果这个反应体系中亚油酸浓度很低,持续反应一段时间后,97%以上都是t9,t11[14]。在此我们综述了不同微生物合成CLA的作用机理。

2.1 丁酸弧菌在哺乳动物体内合成CLA机理

乳制品之所以含有较多的c9,t11-CLA,是因为牛、羊等哺乳动物体内一些瘤胃细菌的作用。Kepler等[19]在1967年发现瘤胃中溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)细胞膜上有亚油酸异构酶,即使在有氧条件下也能继续合成c9,t11-CLA,酶催化速率较快,可适应较宽的pH值范围。c9,t11-CLA是该菌在亚油酸生物氢化为硬脂酸过程中的一个中间产物,这个过程至少有两个反应,如图1所示。首先亚油酸异构化为c9,t11-CLA,接着共轭双键加氢成为t11-十八碳一烯酸(trans-vaccenic acid),逐渐形成了单烯酸和生物氢化产生的共轭亚油酸混合物,最后单烯酸在哺乳动物细胞内?9去饱和酶的作用下转化形成c9,t11-CLA,如图2所示。研究发现,一些霉菌细胞内也存在?9去饱和酶,可以把t11-十八碳一烯酸转化为CLA[20]。虽然多种瘤胃菌均能催化LA转化成CLA,并且是以c9,t11-CLA为主的CLA的混合物,但瘤胃菌的培养需要严格的厌氧条件,不易培养,因此限制了在生产上的应用。

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图 1 丁酸弧菌氢化亚油酸为硬脂酸的途径[3]

Fig.1 Proposed pathway of linoleic acid hydrogenation to stearic acid by Butyrivibrio fibrisolvens[3]

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图 2 Δ9去饱和酶作用于十八碳一烯酸合成CLA[3]

Fig.2 CLA production from trans-vaccenic acid through Δ9 desaturation[3]

2.2 嗜酸乳杆菌以亚油酸为底物合成CLA机理

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图 3 嗜酸乳杆菌异构化亚油酸为CLA的途径[3]

Fig.3 Proposed pathway of linoleic acid isomerization to CLA by Lactobacillus acidophilus[3]

Ogawa等[13]研究了嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AKU1137以亚油酸为底物合成CLA的反应机制。这个反应与羟基脂肪酸的形成有关,随着这个反应的持续进行,羟基脂肪酸的积累量会迅速下降,并伴随着CLA产量的增加。这个结果显示了羟基脂肪酸是嗜酸乳杆菌转化亚油酸生产CLA过程中的一个中间产物,见图3。

2.3 植物乳杆菌以蓖麻油为底物合成CLA机理

蓖麻油富含蓖麻油酸,总脂肪酸中的88%是蓖麻油酸,乳酸菌只可以利用游离蓖麻油酸合成CLA。在蓖麻油中,大部分蓖麻油酸以三酰甘油形式存在,因此,在反应体系中,脂肪酶的存在可以催化蓖麻油水解为游离的蓖麻油酸,从而被乳酸菌利用,见图4。研究发现非离子表面乳化剂,特别是多羟基乳化剂(如Lubrol PX)可以很好的分散蓖麻油,有利于CLA的生成。Ando等[16]研究了利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JCM 1551作为转化细胞酶生产CLA。在微氧、37℃的条件下,以1mol/L
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)为转化介质,以蓖麻油酸乳化剂(蓖麻油酸与Lubrol PX质量比51为底物,底物质量浓度为5mg/mL,其菌液质量浓度是12g/100mL,反应99h。CLA合成量达2mg/mL,占提取到总脂肪酸含量的46%,并由c9,t11 (26%)和t9,t11(74%)两部分组成,其中37%的CLA积累在细胞表面内外,主要以游离形式存在。没有反应的蓖麻油在上清液中被发现,也主要以游离形式存在。

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图 4 植物乳杆菌转化蓖麻油和蓖麻油酸为CLA的途径[3]

Fig.4 Proposed pathway of ricinoleic acid and castor oil transformation to CLA by Lactobacillus plantarum[3]

2.4 植物乳杆菌转化合成共轭多不饱和脂肪酸机理

各种各样带有共轭双键的脂肪酸在生物体内陆续被发现,近几年,人们发现不仅CLA,还有共轭三烯酸都有独特的生理活性,α-亚麻酸经过碱异构可以形成共轭三烯酸,它对人类癌细胞的生长有抑制作用[21]。Kishino等[22]研究了利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AKU 1009a细胞转化不同种类多不饱和脂肪酸形成共轭脂肪酸,见表2。其中α-亚麻酸(c9,c12,c15-183),γ-亚麻酸(c6,c9,c12-183),松籽油酸(c5,c9,c12-183)和十八碳四烯酸(c6,c9,c12,c15-184)都可以被转化为共轭脂肪酸。

表 2 植物乳杆菌AKU 1009a转化多不饱和脂肪酸[2]

Table 2 Transformation of polyunsaturated fatty acids by L. plantarum AKU 1009a[2]

底物脂肪酸

底物

结构

转化

181

t12-十八碳一烯酸

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t11-十八碳一烯酸

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c11-十八碳一烯酸

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t9-十八碳一烯酸

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c9-十八碳一烯酸(油酸)

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182

c9,c12-十八碳二烯酸(亚油酸)

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183

c6,c9,c12-十八碳三烯酸(γ-亚麻酸)

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c9,c12,c15-十八碳三烯酸(α-亚麻酸)

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c5,c9,c12-十八碳三烯酸(松籽油酸)

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t5,c9,c12-十八碳三烯酸

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184

c6,c9,c12,c15-十八碳四烯酸

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204

c5,c8,c11,c14-二十碳四烯酸

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205

c5,c8,c11,c14,c17-二十碳五烯酸(EPA)

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注:+.能转化形成共轭脂肪酸;-.不能转化形成共轭脂肪酸。

 

由表2可知,可以利用植物乳酸菌进行转化形成共轭双键的脂肪酸都是带有c9,c12双键的十八碳二烯酸,可利用α-亚麻酸生产共轭α-亚麻酸(conjugated alpha-linolenic acid,CALA)的3种主要脂肪酸结构分别是:c9,t11,c15-183,t9,t11,c15-183和t10,c15-182;可利用γ-亚麻酸生产共轭γ-亚麻酸(conjugated gamma-linolenic acid,CGLA)的4种主要脂肪酸结构分别是:c6,c9,t11-183,c6,t9,t11-183,c6,t10-182和t10-181。利用α-亚麻酸进行转化的过程发现在初级阶段,c9,t11,c15-183和t9,t11,c15-183共轭三烯酸(conjugate three acid,CTA)被积累,随着反应的进行,积累的共轭三烯酸逐渐减少,t10,c15-十八碳二烯酸的含量则不断增加。类似的结果也可以在利用γ-亚麻酸转化形成CGLA的过程中被发现,见图5。

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图 5 植物乳杆菌转化α-和γ-亚麻酸的途[2]

Fig.5 Proposed pathway of α- and γ-linolenic acid transformation by Lactobacillus plantarum[2]

3 微生物合成CLA的方法

目前,人们主要是研究利用乳酸菌生产共轭亚油酸,大体上有活细胞发酵法、酶法合成、静息细胞转化法与固定化细胞合成法4种方法,它们有着各自的特点,其中静息细胞转化合成是目前研究最多的方法。

3.1 活细胞发酵法

2002年,Kim等[23]研究了发酵乳中有14种乳酸菌具有利用向日葵油合成CLA的能力,其中乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)I-01表现出最高的合成能力,当向日葵油的质量浓度为0.1g/L时产生的CLA量最大,而向日葵油的质量浓度大于0.2g/L时,CLA的生成量逐渐减少。Oh等[24]研究了短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)发酵生产CLA,研究表明,培养30h细胞量达到最高,产生的异构体主要是c9,t11-CLA,并分布在上清液中,产量分别是160mg/L和135mg/L。刘晓华等[25]利用瑞士乳杆菌
L. helveticus)L7发酵生产CLA,MRS培养基中接入5%的菌种,加入亚油酸至质量浓度为0.1g/100mL,30℃发酵培养36h,发酵液萃取后,经紫外光谱、傅里叶变换红外光谱、气相色谱-质谱联用分析测试,确定了该菌生物转化形成的两种主要异构体是t9,t11-CLA和c9,t11-CLA。

3.2 酶法合成CLA

亚油酸异构酶很难分离、纯化,热稳定性差,提取过程中,酶很容易失活。Lin等[26]用MRS肉汤培养嗜酸乳杆菌,离心收集细胞后,依次用溶菌酶和超声波破壁,离心收集粗酶,再经盐析、透析,然后用孔径0.22μm的膜过滤,离心浓缩,最后用分子质量大于100kD的膜收集目的酶,达到了较好的纯化效果。Peng[27]、Rosson[28]等通过盐析,阴离子交换层析(DEAE-SPW色谱柱)、聚焦色谱、凝胶过滤层析(1.6cm×55cm,Superdex-200色谱柱)等纯化方法,分别获得了C.sporogemesL.reuteriP.acnes共3株菌的亚油酸异构酶,其酶比活力是粗酶活性的350~480倍。SDS-PAGE电泳分析表明,C.sporogemes亚油酸异构酶的分子质量大约为45kD,L.reuteri的大约是68kD、P.acnes的大约是55kD。Lin[11]研究对比了德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)洗涤细胞和粗酶转化亚油酸形成CLA的效果。结果显示,洗涤细胞转化合成CLA的产量是209μg/mL,而提取粗酶催化合成的产量是
8.5μg/mL,并且单个异构体的含量和总CLA的含量大大低于洗涤细胞的转化,这可能与游离的亚油酸异构酶稳定性较差,经提取处理后酶活力降低有关。

3.3 静息细胞转化法

由于采用提取后的亚油酸异构酶转化LA合成CLA存在酶不稳定、酶活下降等缺陷,所以利用乳酸菌静息细胞转化生产CLA成为近几年研究的热点。许多研究表明[11],利用乳酸菌洗涤细胞在微氧条件下转化合成CLA具有更好的发展前景,原因有6点:1)洗涤细胞处于休眠状态,可以作为亚油酸异构酶的天然透析袋,免去了酶提取纯化的繁琐过程;2)反应只需在适宜的介质体系条件下进行;3)生成的反应产物是具有生理活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA;4)转化产物单一,CLA能以高浓度积累;5)洗涤细胞可以达到很高的密度,比发酵法的细胞密度高出十多倍;6)产物CLA以游离形式积累在细胞外,易于提取。Raino[29]2001年利用丙酸菌(Propionibacterium freudenreichi)在加乳清的培养基培养后,经洗涤收集细胞,再放入含有4.0mg/mL亚油酸的磷酸盐缓冲液中进行静息细胞转化反应,发现转化率达到了46%,这是当时报道的利用洗涤细胞反应转化合成CLA的最高产率。许庆炎等[30]筛选了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZS2058,以磷酸钾缓冲液为转化介质,在亚油酸质量浓度为0.8mg/mL、细胞浓度为4×1010CFU/mL、37℃、pH 6.5的条件下,转化24h。c9,t11-CLA产量是374μg/mL,CLA总量为491μg/mL,转化率可达到60.54%。Zhao等[31]利用冻融法对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)A6-1F进行透性化处理,然后采用该冻融细胞转化合成CLA。在以磷酸盐缓冲溶液为转化介质,pH7.0、细胞质量浓度为15g/100mL、亚油酸质量浓度为1.5mg/mL、37℃,转化反应2h条件下,CLA最高产量可以达到275.7μg/mL,比不进行透性化处理的产量提高了将近20%,主要异构体是c9,t11-CLA。

3.4 固定化细胞合成法

Lee等[32]将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 55739固定在硅胶上,在亚油酸质量浓度为500mg/L、pH10.5、
55℃的条件下,转化反应1h,可生成175mg/L的CLA,转化率为35%。而游离洗涤细胞在最适反应条件下反应1h,仅产生32mg/mL,转化率为6.4%,固定化细胞CLA转化率是游离细胞的5.5倍。Lin等[33]分别利用壳聚糖和聚丙烯酰胺两种材料,对德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)CCRC14009和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CCRC14079进行混菌固定化。在pH7的条件下,聚丙烯酰胺固定化细胞的CLA产量是121μg,壳聚糖的是51.2μg,而游离细胞的产量只有29.4μg。王欢等[34]研究了以海藻酸钠为载体,采用包埋法制备固定化干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),在最适条件下转化培养18h,CLA积累量为62.57μg/mL。而游离乳酸菌在相同条件下转化培养18h,CLA积累量仅为50μg/mL。在固定化乳酸菌与游离乳酸菌均达到最大产量CLA时,固定化的乳酸菌比游离菌所用的转化时间短,且CLA积累量多。这说明固定化更有利于实现高产量的连续生产和菌体的重复利用,从而降低生产成本,提高经济效益。

3.5 4种转化合成CLA方法的比较

表 3 4种转化合成CLA方法的比较

Table 3 Comparison of four methods for CLA biosynthesis

方法

优点

缺点

活细胞发酵法

操作简单

易染菌,细胞量低,转化率低

酶法合成

反应快,产物易分离

操作复杂,酶易失活,成本高

静息细胞转化法

不易染菌,干扰物质少,产物易分离

成本较高

固定化细胞合成法

可批次反应,成本低,高产量

酶活逐渐降低

 

 

由表3可知,活细胞发酵法操作简单,但是易染菌,细胞量低,转化率低;酶法合成虽然反应快,产物易分离,但是操作复杂,酶易失活,成本较高;静息细胞转化法不易染菌,干扰物质少,产物易分离,同时免去了酶的提取;固定化细胞合成法可以批次连续反应,成本低,产量高,随着批次的延续酶活逐渐下降。综上所述,静息细胞转化法和固定化细胞技术结合是目前我们应该考虑的一个方向。

4 结 语

随着人们生活水平的不断提高,人们的保健意识会持续增强,因此,具有独特生理活性共轭亚油酸将会一直受到人们的青睐,其市场需求量也会不断提高。微生物合成共轭亚油酸虽然有很多优势,但是现在还远远不能满足人们的需求,所以,提高微生物合成共轭亚油酸的产量是一项任重而道远的历程。

我们应该从选育菌株,优化转化工艺,改进固定化技术,寻找亚油酸替代品等方面入手。即利用紫外诱变、基因工程等手段筛选产量更高的优良菌株;对细胞进行透性化处理,使底物与亚油酸异构酶易结合进行反应;给反应体系中添加抗氧化剂等方式减少CLA氧化;结合固定化技术使亚油酸细胞酶可以得到重复、多批次利用,从而达到高效率、低成本生产的目的。另一方面,我们应该寻找更廉价、易得的亚油酸替代品,比如红花籽油、蓖麻油、葵花籽油、海蓬籽油、苜蓿籽油等一些富含亚油酸的油脂经过水解和脂肪酶的处理都可以作为合成CLA的底物。

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