响应面试验优化藜麦种子多酚提取工艺及其品种差异

阙淼琳，蒋玉蓉*，曹美丽，陈 琪，魏述英，陆国权*

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

摘 要：利用响应面分析法对藜麦种子多酚的提取工艺进行优化。在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、料液比、浸提温度进行三因素三水平的Box-Behnken研究，并运用Design-Expect 8.0软件对试验数据进行分析，通过响应面分析法对提取条件进行了优化。结果显示，藜麦种子多酚的最佳提取条件为：料液比1∶40（g/mL）、浸提温度84 ℃、乙醇体积分数56%。在此条件下品种“PI634920”多酚提取量为2.273 mg/g。各因素对多酚提取量的影响程度依次为：乙醇体积分数＞浸提温度＞料液比。同时发现藜麦种子多酚含量存在明显的品种间差异，其中品种“PI596293”的多酚含量最高，达2.72 mg/g。

关键词：藜麦；多酚提取；响应面分析；工艺优化；品种差异

Optimization of Polyphenols Extraction from Quinoa Grains by Response Surface Methodology and Differences in Polyphenol Content among Different Varieties

QUE Miaolin, JIANG Yurong*, CAO Meili, CHEN Qi, WEI Shuying, LU Guoquan*

(School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300, China)

Abstract: The optimum extraction conditions of polyphenols from quinoa grains were investigated in this study. On the basis of single factor experiments, alcohol concentration, solid/liquid ratio and extraction temperature were selected for a three-factor, three-level Box-Behnken experimental design. In addition, Design-Expect 8.0 software was employed to analyze the experimental data and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions. The results suggested that optimal extraction conditions were determined as 56% ethanol as the extraction solvent, an extraction temperature of 84 ℃ (water-based heating) and a solid/liquid ratio of 1:40 (g/mL). Under these optimized conditions, the extraction yield of polyphenols from quinoa grains of the variety “PI634920” was 2.273 mg/g. The sequence of factors affecting the extraction yield of polyphenols was as follows: alcohol concentration > extraction temperature > solid/liquid ratio. Meanwhile, great variation in polyphenol content of quinoa grains was found among 20 different varieties, of which the variety “PI596293” had the highest polyphenol content (2.72 mg/g).

Key words: quinoa; polyphenol extraction; response surface methodology; process optimization; varietal differences

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604002

中图分类号：S56；TS218 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）04-0007-06

引文格式：

阙淼琳, 蒋玉蓉, 曹美丽, 等. 响应面试验优化藜麦种子多酚提取工艺及其品种差异[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 7-12. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604002. http://www.spkx.net.cn

QUE Miaolin, JIANG Yurong, CAO Meili, et al. Optimization of polyphenols extraction from quinoa grains by response surface methodology and differences in polyphenol content among different varieties[J]. Food Science, 2016, 37(4): 7-12. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604002. http://www.spkx.net.cn

藜麦（Chenopodium quinoa）原产于南美洲安第斯山区，是一年生的藜科草本植物，已有5 000多年种植历史[1]。藜麦种子不含胆固醇，低脂（6%），低热量，低糖，含有多种氨基酸和矿物质，其中包括人体必需从外界摄取的9 种氨基酸，比例均衡且易于吸收，是糖尿病患者、素食主义者、孕婴理想安全的碱性食品[2-4]。藜麦属于植物性食物却含有完全蛋白质且含量高达16%～22%，其品质可与奶粉、肉类相媲美[5]。联合国粮农组织认为藜麦是唯一一种可满足人体基本营养需求的单体植物，正式推荐藜麦为最适宜人类食用的完美营养食品，并列入全球十大营养品之一[6-7]。此外，藜麦能较好地适应极端气候条件，对盐碱、干旱、霜冻、病虫害等的抗性能力都很强，植株在自然肥力低的情况下仍能生长良好，是亚洲和非洲由于集约化生产而日益严重的盐渍地和干旱地的一种潜在的替代作物[8-9]。

植物多酚是广泛存在于植物体内的天然次生代谢产物，具有抑制心血管疾病、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及抗辐射等活性，研究和开发植物多酚类化合物已经成为一大热点[10-13]。研究者已用不同方法在葡萄（Vitis vinifera L.）[14-15]、桑葚（Fructus mori L.）[16]、
山核桃（Carya cathayensis Sarg.）[17]、燕麦（Avena sativa L.）[18-19]、高粱（Sorghum bicolor Pers.）[19]
等中进行了多酚提取和含量的测定。藜麦的营养和开发利用价值在最近几十年来得到了人们广泛的认识和重视[1,5]。Pasko等[20]研究发现藜麦种子及新芽中有较多的总多酚，且其含量与抗氧化能力呈正相关。Alvarez-Jubete[21]、Hirose[22]等对藜麦总多酚成分进行分析，结果表明藜麦总多酚中含有槲皮素、山奈酚、原儿茶酚、香草酸及其衍生物、咖啡酸衍生物等，其中以槲皮素和山奈酚含量最多。更值得一提的是，藜麦中大约80%的多酚化合物在体外仍具有生物活性[23]。我国自1987年由西藏自治区农牧学院和西藏农科开始引种实验研究，现在西安、山西、青海、四川等地区已有规模化种植[24]。目前藜麦的研究主要集中在生物学特性[2,25]、化学成分[5,26]、
抗逆生理特性[8,27]等方面。然而国内外关于藜麦多酚的提取研究和报道甚少。本实验以没食子酸为标准物，采用福林-酚法测定藜麦种子多酚含量，并用响应面法优化藜麦多酚的提取工艺，同时比较了20 个藜麦品种间种子多酚含量的差异，为藜麦多酚类物质的开发和高多酚含量资源的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用已本土化栽培3 a，农艺性状较好的藜麦品种“PI634920”为材料，进行多酚提取条件的优化研究。同时选取其他19 个藜麦品种：“TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL”、“QuinoaB. Rain Sow”、“Temuco”、“1591 Quinoa Cherry”、“Tomico Quinoa”、“CQ-TEMVCC（夭玛）”、“PI596293”、“#963 chenopodium quinoa‘Red’”、“PI614929”、“Vanilla”、“Tumuco(7)hybrids”、“浙藜-41”、“浙藜-42”、“浙藜-43”、“浙藜-44”、“浙藜-45”、“浙藜-46”、“浙藜-47”、“浙藜-48”。所有材料均由青海海西海杭生态农业科技有限公司和浙江农林大学提供，2014年种植于本校观塘农场。

没食子酸标准品、Folin-Ciocalteu’s显色剂 上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、无水碳酸钠（均为分析纯） 生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DHG9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海
精宏实验设备有限公司；TP-214电子天平 丹佛仪器有限公司；XMTD-6000恒温水浴锅 上海申胜生物技术有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；常规冷凝装置 杭州欧尔柏维科技有限公司；手提式高速中药粉碎机 上海新诺仪器厂；旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社。

1.3 方法

1.3.1 没食子酸工作曲线的绘制

准确称取没食子酸对照品10 mg，用60%乙醇溶液溶解并定容至10 mL，其质量浓度为1 mg/mL。精密吸取没食子酸对照液0、0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56 mL于10 mL容量瓶并用60%乙醇溶液定容，得质量浓度分别为0、4、8、16、24、32、40、48、56 mg/L
的没食子酸待测溶液。准确吸取每个质量浓度的待测液0.2 mL，分别加入3 mL饱和碳酸钠溶液和1 mL福林-酚显色剂摇匀，黑暗处理、室温条件下反应1 h，于765 nm波长处测定其吸光度。以吸光度与没食子酸质量浓度求得回归方程，绘出没食子酸对照品工作曲线。所得回归方程：Y＝0.006 4X－0.006 6，式中：Y为吸光度；X为质量浓度/（mg/L）；R2＝0.999 1。

1.3.2 藜麦多酚的提取及其含量测定

取藜麦种子，35 ℃烘干后充分粉碎成粉末过0.5 mm孔筛，密封干燥备用。精密称取“PI634920”品种的粉末样品0.2 g，按一定料液比加入乙醇溶液，采用水浴回流加热法进行提取，冷却后于3 000 r/min离心15 min，抽滤，取澄清液用60%乙醇溶液定容至10 mL（V1）得到总多酚测试样液。取样液0.2 mL，采用和标准曲线制作相同的方法测定样品中总多酚的含量，以没食子酸计。多酚提取量按下式计算：

式中：M为藜麦粉质量/g；A为所测得吸光度。

1.3.3 单因素试验

选择浸提温度（55、65、75、85、95 ℃）、乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）做单因素试验，分别考察这3 个因素对藜麦种子多酚提取的影响。

1.3.4 提取工艺响应面试验优化

根据Box-Behnken试验设计原理进行三因素三水平试验设计，利用Design-Expert 8.0软件进行数据拟合优化藜麦种子多酚提取工艺。在单因素试验的基础上，自变量的试验水平分别以－1、0、1进行编码，共设计17 个试验点，其中12 个为析因点，5 个为区域的中心零点，用来估计试验误差。试验因素和水平见表1。

表 1 响应面试验水平因素

Table 1 Factors and their coded levels used in experimental design for response surface methodology

1.3.5 藜麦种子多酚含量的品种间差异分析

采用响应面优化所得的最佳试验方案，对所选的20 个品种的种子进行多酚含量测定，以明确藜麦种子多酚含量的品种间差异。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提温度对藜麦种子多酚提取量的影响

温度是影响提取量的重要因素，在乙醇体积分数60%、料液比1∶40、浸提1 h的条件下，不同浸提温度对藜麦多酚提取效果的影响见图1。

图 1 浸提温度对多酚提取量的影响

Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols

从图1可以看出，随着温度上升，多酚提取量呈缓慢上升趋势；当提取温度达到85 ℃时，多酚提取量达到一个峰值，为2.25 mg/g。继续升高温度，多酚提取量开始下降，且下降趋势明显。因此，选择85 ℃左右的浸提温度为宜。

2.1.2 乙醇体积分数对藜麦多酚提取量的影响

乙醇价格低廉，易得，无毒，选择性好，极性较高，对酚类物质有较高的溶解度。选择乙醇溶液作为提取剂，在料液比1∶40、恒温水浴85 ℃、浸提1 h的条件下，研究其最优浸提体积分数。

图 2 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

Fig.2 Effect of alcohol concentration on the yield of polyphenols

如图2所示，随着乙醇体积分数增加，多酚提取量呈先上升后下降的趋势，而在60%处时达到2.25 mg/g，比在70%处高出0.017 mg/g。其后随着乙醇体积分数升高，多酚提取量呈下降趋势，这是因为植物体内的水溶性多酚分布在细胞的液泡中，而非水溶性的多酚物质存在于细胞壁上，且多与蛋白质或多糖类物质以氢键结合。低体积分数的乙醇溶液可以进入细胞内部，而高体积分数的乙醇会引起蛋白质变性，阻止多酚类物质的传质过程，从而降低多酚的提取量[28]；故选取浸提乙醇体积分数60%。

2.1.3 料液比对藜麦多酚提取量的影响

以60%的乙醇为提取剂，85 ℃恒温水浴60 min，研究藜麦多酚最佳提取料液比。

图 3 料液比对多酚提取量的影响

Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on the yield of polyphenols

如图3所示，开始提取时，多酚提取量随着溶剂用量的增加而直线增加，当料液比达1∶40时，多酚提取量达到最高，为2.24 mg/g。料液比在1∶40之后时，多酚提取量开始下降，所以提取最适料液比为1∶40。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验方案及结果

利用Design-Expert 8.0软件进行数据拟合，试验设计与结果见表2。

表 2 Box-Behnken试验设计及结果

Table 2 Box-Behnken design with experimental and predicted results for response surface methodology

2.2.2 模型的建立与显著性检验

利用Design-Expert 8.0软件对表2数据进行多元回归拟合，获得藜麦多酚提取量（Y）对自变量浸提温度（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C）的二元多项回归模型方程：Y=2.25－0.042A－0.076B－7.5×10－4C＋
8.5×10－3AB－2.25×10－3AC－0.054BC－0.15A2－0.11B2－0.20C2。该方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度，系数的正、负反映了影响的方向[29]。由于该方程的二次项系数均为负值，可以推断方程代表的抛物面开口向下，因而具有极大值点，可以进行优化分析。由方程的一次项系数可以得出影响藜麦多酚提取量的因素的主次顺序为乙醇体积分数＞浸提温度＞料液比。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表 3 回归模型方差分析表

Table 3 Analysis of variance of the regression model

注：*.P＜0.05，差异显著；**.P＜0.01，差异极显著。

由表3可以看出，A、B、A2、B2、C2对响应值的影响达到极显著水平，三因素两两交互中BC项P＜0.01，说明乙醇体积分数和料液比两因素的交互作用影响极显著。

从整体分析，模型P＜0.000 1，表明该二次多项回归模型极显著；失拟检验项P值不显著，表明模型与实际情况拟合较好。R2=0.995 3，说明预测值和实测值之间具有高度的相关性，CV值为0.83%，说明模型方程能够很好地反映真实的试验值（R2Adj=0.989 2）。

2.2.3 响应面优化分析

等高线图可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反[30]。根据回归方程绘制响应面见图4。

a.浸提温度与乙醇体积分数

b.浸提温度与料液比

c.乙醇体积分数与料液比

图 4 各因素交互作用对多酚提取量的等高线和响应面图

Fig.4 Contour and response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of polyphenols

图4a等高线显示，料液比处于0水平时，浸提温度和乙醇体积分数的交互作用并不强，当固定浸提温度时，随着乙醇体积分数的增加，多酚提取量也增大，但增大到一个峰值后又开始缓慢下降；响应面图显示，多酚提取量在浸提温度的－1～0水平和乙醇体积分数的－1～0水平之间有最大值。图4b显示，乙醇体积分数处于0水平时，浸提温度与料液比的交互作用较弱，由等高线图可知，料液比对多酚提取量影响相对较小，乙醇体积分数和料液比的交互作用显著。比较图4b和图4c，说明乙醇体积分数对多酚提取量影响比浸提温度要高，再比较图4a与图4c可知，浸提温度对多酚提取量的影响较料液比显著，这与方差分析的结果一致。且多酚提取量在料液比0～1水平之间有最大值。如图4c所示，浸提温度处于0水平，当固定乙醇体积分数时，多酚提取量随溶剂用量的增加先增大后降低；当固定料液比时，多酚提取量随乙醇体积分数也呈先增后降的趋势，但后者幅度明显大于前者。这也与单因素分析结果一致。

由Design-Expert 8.0软件得出的多酚的最佳提取条件为：料液比1∶40.48、浸提温度83.51 ℃、乙醇体积分数56.36%。此条件下模型预测的最大提取量为2.271 mg/g。
考虑到实际操作的局限性，将理论值修正为料液比1∶40、浸提温度84 ℃、乙醇体积分数56%。此条件下做验证实验，所得的多酚提取量为2.273 mg/g，与理论值2.271 mg/g接近，说明该模型能较好地预测实际提取量。

2.3 藜麦种子多酚含量的品种间差异

采用上述优化后的最佳方案，于84 ℃条件下，用体积分数为56%的乙醇溶液以料液比1∶40对供试的20 个品种进行多酚含量测定，品种信息和测得结果如表4所示。

表 4 20个藜麦品种的种子多酚含量

Table 4 Polyphenol contents of 20 quinoa varieties

注：肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

由表4可知，藜麦种子多酚含量在不同品种间存在较大差异，变异幅度为1.89～2.72 mg/g，平均含量为2.30 mg/g，变异系数为10.9%。Hirose等[22]研究的日本栽培的藜麦种子的多酚含量约在1.5～2.5 mg/g之间，与本研究所测得的多酚含量接近。在20 个藜麦引种品种中，品种“PI596293”的种子多酚含量最高，其次依次是品种“TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL”、“Temuco”、“CQ-TEMVCC（夭玛）”和“浙藜-45”，上述品种与苹果渣的多酚含量相近[31]。而种子多酚含量最低的是品种“浙藜-43”和“浙藜-44”，分别为1.96 mg/g和1.89 mg/g。
由实验数据得知，通过适当的育种改良途径和方法，可以筛选到多酚含量较高的藜麦品种。

3 结 论

响应面分析结果表明，提取藜麦种子多酚的最佳组合为：乙醇体积分数56%、浸提温度84 ℃、料液比1∶40。各因素对多酚提取量的影响程度依次为：乙醇体积分数＞浸提温度＞料液比。此提取条件下实测多酚提取量为2.273 mg/g，与理论值相差0.002 mg/g。回归分析和验证实验表明该响应面法合理、可行。研究结果表明，藜麦种子多酚的含量存在明显的品种间差异，其中品种“PI596293”的多酚含量最高，达到2.72 mg/g，而品种“浙藜-44”多酚含量最低，仅为1.89 mg/g。从产地而言，南美品种藜麦的种子多酚含量较浙藜系列品种平均高出0.22 mg/g。不同品种藜麦种子的多酚含量差异是否与其产地或者种皮色泽有关还尚待研究。

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