响应面优化葛根总黄酮的钙离子沉淀分离工艺

欧阳玉祝，朱 露，李雪峰

（吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000）

摘 要：以湘西葛根为原料，以总黄酮提取率为研究对象，通过单因素试验研究了沉淀剂用量、沉淀时间和沉淀温度对葛根总黄酮提取率的影响。在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，用三因素三水平响应面分析法优化了葛根总黄酮的分离工艺条件。结果表明，在50 mL葛根提取液中，用70 mL饱和澄清石灰水作沉淀剂，60 ℃温度条件下沉淀45min，总黄酮的提取率为0.6589%。试验结果与模型预测值相符。

关键词：总黄酮；葛根；离子沉淀；响应面优化法

Optimization of Calcium Ion Precipitation for the Separation of Total Flavonoids Extracted from Kudzuvine Root by Response Surface Methodology

OUYANG Yu-zhu, ZHU Lu, LI Xue-feng

(Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province, Jishou University, Jishou 416000, China)

Abstract: The total flavonoids extracted from kudzuvine roots from western Hunan province were separated by precipitation with added calcium ion. Single-factor experiments were carried out to investigate the effects of the amount of added precipitating agent, precipitation time and temperature on the yield of total flavnoids. In further studies, according to the principle of Box-Behnken experimental design, the three variables (process conditions) at three selected levels were optimized by response surface methodology. Results showed that an extraction yield of total flavonoids of 0.6589% was obtained when 50 mL of kudzuvine root extract was precipitated for 45 min by adding 70 mL of saturated clarified limewater at 60 ℃, which was consistent with the model predicted value.

Key words: total flavonoids; kudzuvine root; ion precipitation; response surface methodology

中图分类号：TS202 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0035-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404008

葛根是豆科植物葛（Pueraria lobata（Willd.） Ohwi）的根，是药、食两用天然植物资源。葛根中除含有大量的淀粉、氨基酸和膳食纤维外，还含有丰富的葛根素、葛根素木糖苷、大豆苷、大豆苷元及谷甾醇、花生酸等[1]，葛根素是葛根总黄酮中含量最多的黄酮化合物。葛根总黄酮具有改善心脑血管循环、扩张冠脉和脑血管、改善心肌收缩能力、促进血液循环、抗氧化和清除自由基等多种药理和保健功能，广泛用于食品和药品等领域[2-5]。目前，葛根的主要研究是食品、黄酮化合物的提取和临床应用[6-20]。曲面响应法是一种新的工艺优化方法，广泛用于植物活性成分提取分离[21-22]。本实验用澄清石灰水沉淀分离葛根中的总黄酮，采用曲面优化法优化分离工艺条件，研究结果能为葛根的开发利用和葛根素的分离纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根购于吉首市农贸市场，经切片、干燥、粉碎至60 目，备用；葛根素对照品（含量＞98%） 上海融禾医药科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钙、硫酸、氢氧化钠均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；DF-101S集热式磁力搅拌器、SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；KQ-250E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JA2003N型电子天平 上海精密仪器厂；M22型中量制备仪 天津玻璃厂。

1.3 方法

1.3.1 葛根总黄酮的钙离子沉淀

取200g葛根粉按参考文献[16]用超声提取法制备葛根总黄酮提取液，滤液定容到2000 mL，得葛根总黄酮提取液。取提取液50 mL于锥形瓶中，加一定体积的饱和澄清石灰水溶液，在一定温度条件下沉淀一定时间。抽滤，滤渣用足量2%稀硫酸分解，抽滤，滤液定容到50 mL，用紫外-可见分光光度法测总黄酮含量。

1.3.2 总黄酮含量的测定

标准曲线的绘制：用葛根素作为标准物，按照参考文献[17]配制梯度质量浓度的葛根素标准溶液，用紫外-可见分光光度计测510 nm波长处吸光度，绘制标准曲线，经线性回归得回归方程及相关系数为：ρ=0.0926A，R2=0.9994。式中：ρ为标准溶液质量浓度/（mg/mL）；A为吸光度。

葛根总黄酮含量测定：取1.3.1节方法得到的溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按参考文献[17]用紫外-可见分光光度计测510 nm波长处吸光度，带入回归方程计算总黄酮质量，按下式计算提取率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 沉淀剂用量对葛根总黄酮提取率的影响

图 1 沉淀剂用量对总黄酮提取率的影响

Fig.1 Influence of precipitator dosage on extraction yield of total flavonoids

本实验利用黄酮与钙离子生成配合物沉淀来分离葛根总黄酮。为了考察沉淀剂用量对葛根总黄酮提取率的影响，取50 mL葛根提取液，按1.3.1节方法加入不同体积的饱和澄清石灰水做沉淀剂，在50 ℃条件下沉淀40 min，结果见图1。

图1表明，石灰水用量在60 mL以下时，葛根总黄酮的提取率随添加饱和澄清石灰水体积增加而增大，当石灰水用量为60 mL时提取率达到最大值0.4452%，随后基本维持不变。这是因为60 mL饱和澄清石灰水已经能够使提取液中的葛根总黄酮沉淀完全。大于60 mL后，由于碱性增强，造成黄酮氧化速度加剧，产品颜色加深。

2.1.2 沉淀温度对葛根总黄酮提取率的影响

图 2 沉淀温度对总黄酮提取率的影响

Fig.2 Influence of precipitation temperature on extraction yield of total flavonoids

槲皮素是一种多酚化合物，结构中含有酚羟基，具有很强的还原性，温度越高，越容易氧化。因此，沉淀温度对葛根总黄酮提取率有较大的影响。为了考察沉淀温度对葛根总黄酮提取率的影响，取50 mL提取液，按1.3.1节方法加入50 mL澄清石灰水，在不同温度条件下沉淀40 min，结果见图2。图2表明，随温度升高葛根总黄酮提取率不断增加，在60 ℃沉淀时，总黄酮提取率达最大值0.4709%；继续升高温度，总黄酮的提取率下降。这是因为温度过高将加速葛根黄酮的氧化。

2.1.3 沉淀时间对葛根总黄酮提取率的影响

为了考察沉淀时间对葛根总黄酮提取率的影响，取50 mL提取液，按1.3.1节方法加入50 mL澄清石灰水，50 ℃条件下进行沉淀，结果见图3。

图 3 沉淀时间对总黄酮提取率的影响

Fig.3 Influence of precipitation time on extraction yield of total flavonoids

由图3可知，40 min沉淀完全，总黄酮的提取率为0.328%，随后提取率稍有减少。因为沉淀是在碱性条件下进行，碱性条件下，葛根总黄酮容易氧化，而且随时间的增长氧化加剧，所以提取率有些下降。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计

影响分离总黄酮的各个因素不是独立的，而是相互联系的。在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选择石灰水用量（X1）、沉淀时间（X2）、沉淀温度（X3）为影响因素，以葛根总黄酮提取率为响应值。设计三因素三水平响应曲面优化试验，试验因素水平表见表1。

表 1 Box-Behnken试验因素水平表

Table 1 Coded levels for variables used in Box-Behnken experimental design

2.2.2 Box-Behnken优化试验结果

对葛根总黄酮的Box-Behnken优化沉淀分离工艺，按1.3.1节方法进行试验，试验结果如表2所示。

表 2 Box-Behnken试验结果

Table 2 Results of Box-Behnken experimental designs

2.2.3 显著性检验

表 3 回归统计分析结果

Table 3 Results of regression analyses

注：**. 差异极显著（P＜0.01），*. 差异显著（P＜0.05）。

运用Design Expert 8.0软件对表2数据进行二次线性回归拟合和显著性及方差分析。分析结果见表3。其中回归拟合数学模型为：Y＝0.60＋0.044X1＋0.031X2＋9.775×10-3X3＋0.011X1X2＋1.775×10-3X1X3 －0.015X2X3 ＋4.270×10-3X12－0.041X22－0.065X32。

由表3知，数学模型极显著（P＜0.01），因变量和所考察的自变量之间线性关系显著（R2=0.9549），说明该模型能解释95.49%的响应值变化，拟合程度较好。失拟不显著，说明其二次回归方程高度显著，能很好的对响应面进行预测[23-24]。表3中，X1、X2以及X22、X32表现为极显著。响应面优化试验得出最优条件为：在50 mL葛根提取液中，澄清石灰水用量70 mL、沉淀时间45.01 min、沉淀温度60.31 ℃，此条件下模型预测葛根总黄酮最大提取率为0.6614%。各因素的影响顺序为：石灰水用量＞沉淀时间＞沉淀温度。

2.2.4 沉淀分离响应面分析

响应面图能够直观的反映各因素之间的交互作用，将钙离子沉淀分离葛根总黄酮的试验数据，用Design Expert软件进行响应面分析得响应曲面图，如图4～6所示。

响应曲面图坡度陡峭程度和等高线形状可以反映各因素间交互作用强弱和影响程度大小。曲面坡度陡峭、等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反[25-26]。图4～6可以看出，总黄酮提取率随各两因素的增加先上升，当达到一定水平时，缓慢下降。图4、5表明，沉淀时间与石灰水用量以及沉淀温度与石灰水用量的响应曲面坡度陡峭，等高线排列紧密且趋向于椭圆，表明时间与石灰水用量、温度与沉淀剂用量的交互影响相对较大。因为过多的添加石灰水会导致碱性增强。在强碱性条件下，温度越高，时间越长，黄酮与钙生成的金属配合物越易氧化，颜色越深，因此，在强碱性条件下沉淀分离总黄酮，温度和时间选择不能过大。图6中沉淀温度和沉淀时间的响应面坡度平缓，等高线呈圆形，说明两因素的交互影响相对较小。

图 4 石灰水用量和沉淀时间交互作用对提取率影响的响应面

Fig.4 Response surface of Y = f (X1, X2)

图 5 石灰水用量和温度交互作用对提取率影响的响应面

Fig.5 Response surface of Y = f (X1，X3)

图 6 温度和沉淀时间交互作用对提取率影响的响应面

Fig.6 Response surface of Y = (X2，X3)

2.2.5 模型验证

为了检验响应曲面法优化试验结果的可靠性，并考虑试验条件的可操作性，将提取工艺参数调整为：在50 mL葛根提取液中，饱和澄清石灰水用量70 mL、沉淀温度60 ℃、沉淀时间45 min。在此条件下进行验证实验，平行实验5次取平均值，结果见表4。

表 4 最佳沉淀条件组合实验

Table 4 Experimental results under optimized precipitation conditions

表4表明：在最佳沉淀条件下，葛根总黄酮的平均提取率为0.6589%，与预测值0.6614%相差0.0025%，实验结果与模型预测值相符。表明本实验设计工艺条件准确可靠，进一步验证了数学模型的合理性。

3 结 论

3.1 本实验用超声辅助提取法制备葛根提取液，利用黄酮化合物与钙离子生成金属配合物沉淀使总黄酮从葛根提取液中分离，能显著提高黄酮的提取效率，简化分离过程。该方法采用石灰水为沉淀剂，价格低廉，具有快速、高效、操作简单等特点，对本地葛根资源的开发利用有较强的应用价值。

3.2 本实验在单因素试验基础上，利用响应曲面法优化了葛根总黄酮的钙离子沉淀分离工艺。结果表明，50 mL葛根提取液中，用70 mL饱和石灰水做沉淀剂，在温度60 ℃条件下沉淀45 min，葛根总黄酮提取率为0.6589%。

参考文献：

[1] 刘云, 张瑶, 和润喜. 葛根及葛根食品的研究与开发现状[J]. 中国林副特产, 2010(1): 94-97.

[2] 曹铭希. 葛根总黄酮的提取及其药理活性的研究进展[J]. 中国医药指南, 2012, 28(10): 48-49.

[3] 欧阳玉祝, 郑书怀, 吕程丽, 等. 天然海金砂黄酮-葛根总黄酮复合抗氧剂对芝麻油的抗氧化稳定性研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(3): 125-127.

[4] 刘晓宇, 张俊杰, 王蕊霞. 葛根总黄酮的提取及抗氧化活性评价研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 232-238.

[5] 朱红青, 唐宇宏, 沈群, 等. 葛根总黄酮体外诱导人早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的实验研究[J]. 南方医科大学学报, 2009, 29(12): 2547-2549.

[6] FAN Jieping, CAO Jing, ZHANG Xuehong, et al. Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of puerarin from Radix Puerariae Lobatae by response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2012, 135(4): 2299-2306.

[7] 欧阳玉祝, 李雪峰, 魏燕, 等. D-101大孔树脂对连翘中黄酮类成分的吸附特性研究[J]. 核农学报, 2013, 27(10): 1534-1538.

[8] LIU Chanmin, MA Jieqiong, SUN Yunzhi. Puerarin protects the rat liver against oxidative stress-mediated DNA damage and apoptosis induced by lead[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(6): 575-582.

[9] FAN Jieping, CAO Jing, ZHANG Xuehong, et al. Extraction of puerarin using ionic liquid based aqueous two-phase systems[J]. Separation Science and Technology, 2012, 47(12): 1740-1747.

[10] LIU Chanmin, MA Jieqiong, SUN Yunzhi. Protective role of puerarin on lead-induced alterations of the hepatic glutathione antioxidant system and hyperlipidemia in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(12): 3119-3127.

[11] CHI Ruan, ZHOU Fang, HUANG Kun, et al. Adsorption behaviors of puerarin on S-8 macroporous resin[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2011, 9(2): 120-125.

[12] 胡晓云, 赖艳. 葛根药食两用的开发研究[J]. 江西农业学报, 2007, 19(7): 65-67.

[13] 杨佳宇, 徐勇威, 孙亚丽, 等. 响应面法优化田基黄总黄酮的吸附工艺[J]. 吉首大学学报, 2012, 33(6): 89-94.

[14] WU Yanfang, WANG Xinsheng, FAN Enguo. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of puerarin and total isoflavones from Puerariae Lobatae Radix (Pueraria lobata (Wild. ) Ohwi) with response surface methodology[J]. Phytochemical Analysis, 2012, 23(5): 513-519.

[15] LIU Yingkun, YAN Enguo, ZHAN Hanying, et al. Response surface optimization of microwave-assisted extraction for HPLC-fluorescence determination of puerarin and daidzein in Radix Puerariae thomsonii[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2011, 1(1): 13-19.

[16] 欧阳玉祝, 吴道宏, 雷刚. 茵陈总多酚的超声提取工艺研究[J]. 应用化工, 2010, 39(12): 1827-1829.

[17] 吕程丽, 欧阳玉祝, 梅杰, 等. CO2超临界萃取葛根总黄酮的研究[J]. 食品与发酵科技, 2009, 45(5): 21-23.

[18] 崔玮, 李玉兰, 杨爱梅. 超声辅助提取甘青虎耳草总黄酮工艺及其抑菌作用[J]. 食品科学, 2012, 33(12): 108-113.

[19] 朱春燕, 王雪莉, 石峰. 葛根总黄酮缓释片药动学研究[J]. 世界科学技术: 中医药现代化, 2007, 9(6): 58-60.

[20] 陈利梅. 超声波辅助双水相提取条斑紫菜黄酮类物质及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2012, 33(4): 41-46.

[21] 欧阳玉祝, 魏燕, 李雪峰, 等. 响应面优化钙离子沉淀分离田基黄槲皮素[J]. 林产化学与工业, 2013, 33(6): 116-121.

[22] 徐岩, 张清溪, 袁其朋, 等. 响应面法优化超声提取光果甘草中光甘草定的工艺研究[J]. 食品科技, 2009, 34(12): 235-239.

[23] 张丽晶, 林向阳, 彭树美, 等. 响应面法优化绿茶微波真空干燥工艺条件[J]. 食品科学, 2009, 30(22): 122-125.

[24] 刘莹, 袁岩, 雷霄宇, 等. 响应面法优化超声波辅助提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的工艺[J]. 食品科学, 2013, 34(10): 31-35.

[25] 刘奉强, 肖鉴谋, 刘太泽. 应用响应面法优化超声波提取荆芥中总黄酮的工艺[J]. 南昌大学学报, 2011, 33(2): 149-155.

[26] 郭元亨, 马李一, 郑华, 等. 响应曲面法优化微波辅助提取胭脂虫红色素工艺[J]. 林产化学与工业, 2011, 31(4): 87-92.