纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应
快速检测海产品中副溶血性弧菌

张 蕾1,2，曾 静1,*，魏海燕1，马 丹1，程晋霞2，张西萌1，张海予2

（1.北京出入境检验检疫局，北京 100026；2.北京农学院，北京 102206）

摘 要：采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术，结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法，建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时，对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下，该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL；通过134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试，实时荧光PCR技术具有良好的特异性；在食品基质添加实验中，其检测限为2CFU/25g样品，增菌时间缩短到8h。

关键词：副溶血性弧菌；免疫磁分离；实时荧光聚合酶链式反应

A Novel Method of Nano-Immunomagnetic Separation-Real Time-Polymerase Chain Reaction
for Detecting Vibrio parahaemolyticus in Seafoods

Zhang Lei1,2, Zeng Jing1,*, Wei Hai-yan1, Ma Dan1, Cheng Jin-xia2, Zhang Xi-meng1, Zhang Hai-yu2

(1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China;

2. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Abstract: A novel method using monoclonal antibody of Vibrio parahemolyticus, nano-immunomagnetic separation (Nano-IMS) plus real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for detecting Vibrio parahemolyticus in seafoods. The nano-immunomagnetic beads (Nano-IMB) created showed a capture rate for Vibrio parahemolyticus of 74% at a bacterial concentration of 103 CFU/mL. The sensitivity of Nano-IMS-PCR was 140 CFU/mL under pure culture conditions without enrichment. The RT-PCR method was highly specific for 134 Vibrio parahemolyticu and 74 non-target bacteria. The detection limit of the method reached 2 CFU/25 g in artificial food samples. The enrichment time was shortened to 8 h.

Key words: Vibrio parahaemolyticus; nano-immunomagnetic separation; real time-polymerase chain reaction

中图分类号：TS207.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0107-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404022

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是引起食物中毒的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症，危及生命[1-2]。副溶血性弧菌引起的疾病已成为我国严重的食源性公共卫生问题之一，由该菌引发的食品中毒案例居微生物食源性疾病暴发案例之首，且呈上升趋势[3-6]。目前副溶血性弧菌的检验多采用传统方法，周期长（一般需要5～7d）、过程繁琐。纳米免疫磁珠（nano-immunomagnetic beads，Nano-IMB），又称纳米免疫磁性微球菌，是直径为0.05～4btm、具有超顺磁性的微珠，表面经化学修饰后可与特异性抗体结合。其作为免疫磁性分离（nano-immunomagnetic separation，Nano-IMS）的材料，在分子、细胞和个体水平上为食源性致病菌检测和疾病的诊断等提供新材料、新技术和新方法[7-10]。将Nano-IMS技术与实时荧光聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术结合，可有效的富集菌体、缩短检测时间、提高检出率；同时，由于免疫磁珠可特异性捕获目标菌体，有效去除核酸扩增抑制成分、提高扩增效率。本研究建立了Nano-IMS-RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性和灵敏度进行了验证，旨在缩短副溶血性弧菌检测时间、提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用菌株及编号如下：副溶血性弧菌ATCC 17802、副溶血性弧菌ATCC 1.1997、创伤弧菌ATCC 1758、河流弧菌ATCC 1.1611、拟态弧菌ATCC 1.1969、溶藻弧菌ATCC 1.1607、溶藻弧菌ATCC 1833、费尼斯弧菌ATCC 1.1612、解蛋白弧菌ATCC 1.1826、单增李斯特氏菌ATCC 15313、格氏李斯特氏菌ATCC 700545、西尔李斯特氏菌ATCC 35967、英诺克李斯特氏菌ATCC 33090、默氏李斯特氏菌ATCC 2540、伊氏李希特氏菌ATCC 19119、威氏李斯特氏菌ATCC 35897、肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.1736、阴沟肠杆菌CGMCC 1.57、腊样芽孢杆菌ATCC 11778、表皮葡萄球菌ATCC 12228、甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50001、马红球菌ATCC 6936、福氏志贺氏菌CMCC 51571、痢疾志贺氏菌CMCC 51252、阪崎肠杆菌ATCC 29544、枸橼酸杆菌CMCC 48017、丙型溶血性链球菌CMCC 32206、乙型溶血性链球菌CMCC 32210、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC 52212、大肠杆菌ATCC 25922、肠炎沙门氏菌CMCC 50041、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、铜绿假单胞菌ATCC 15442、粪肠球菌CGMCC 1.2135、副溶血性弧菌自分离株1～132、霍乱弧菌自分离株1～40和75。

TaqMan基因表达混合液（2×） 美国Life Technologies公司；大豆酪蛋白琼脂培养基（trytone soya agar，TSA）、碱性蛋白胨水培养基（alkaline peptone water，APW）、脑心浸液琼脂培养（brain-heart infusion agar，BHI）、弧菌显色培养基 北京陆桥有限责任公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 仪器与设备

磁力架 美国Dynalco公司；7900型实时荧光定量PCR仪 美国Life Technologies公司；恒温加热块、微量移液器 德国Eppendorf公司；恒温培养箱 美国3M公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

10×磷酸缓冲溶液：80g NaCl、29g NaH2PO4•12H2O、2g KCl，2g KH2PO4，先溶于900mL去离子水，待充分溶解后再加去离子水至1000mL，室温保存，使用时进行1∶10（V/V）稀释。

1.3.2 副溶血性弧菌纳米免疫磁珠的制备

采用本实验室制备的副溶血性弧菌单克隆抗体[11]，委托国家纳米中心制备副溶血性弧菌纳米免疫磁珠（Nano-IMB-Vp）。

1.3.3 Nano-IMB-Vp分离副溶血性弧菌

取2.5mg Nano-IMB-Vp于1mL无菌离心管中，置于磁分离架上，吸附1 min，弃上清液，用30 μL磷酸缓冲溶液重悬Nano-IMB-Vp，加入1 mL菌悬液，300r/min条件下室温孵育30 min，置于磁力架上吸附1 min，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲溶液洗涤2次，每次30s，重悬于50 μL无菌水中备用。

1.3.4 平板菌落计数

参照GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验：菌落总数测定》[12]，将副溶血性弧菌ATCC 17802接种到APW培养基，36 ℃过夜培养，制备10倍系列稀释菌悬液。用冷却至46 ℃的TSA琼脂培养基倾注平皿，吸取1 mL菌悬液于无菌平皿内，36 ℃培养（24±2）h后进行计数。每个稀释度做2个平行。

1.3.5 Nano-IMB-Vp捕获效率的测定

按照1.3.4节方法制备参比菌株ATCC 17802菌悬液并进行平板计数。选取102～103 CFU/mL的6种非目标菌株（霍乱弧菌-75、创伤弧菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）菌悬液进行捕获率测定。取1 mL浓度为8.4×102 CFU/mL的Vp菌悬液，分别与0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg和3.5mg的Nano-IMB-Vp结合，吸附后计数上清液的菌落数，Nano-IMB-Vp捕获后的上清液再进行菌落计数，根据以下公式计算其捕获率。每次实验设置3个平行，重复2次。

1.3.6 Nano-IMB-Vp捕获特异性的测定

张蕾等[11]采用74株非目标菌对该Vp单克隆抗体进行了特异性验证。现采用6株非目标菌（霍乱弧菌-7、创伤弧菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）对Nano-IMB-Vp的捕获特异性进行测定。

1.3.7 菌体DNA的提取

采用热裂解法提取DNA，取1 mL菌悬液，10000r/min离心2 min，加入50 μL无菌水，沸水裂解10 min，冰浴5 min，相同条件离心2 min，上清液即为DNA模板，－20 ℃保存备用。

1.3.8 RT-PCR方法的建立

RT-PCR引物：针对副溶血性弧菌tlh基因，用Primer Express 3.0软件设计RT-PCR引物。引物序列为：上游引物Vp-F（5’-CCGCTCATCGTCTGTCGATT-3’）、下游引物Vp-R（5’-GCACCAGACGCTGCACACT-3’）和探针Vp-T（5’-FAM-CATGTACACCCACGCATTGCGCTCT-TAMRA-3’）。

25 μL反应体系：2×TaqMan基因表达混合液12.5 μL，Vp-F、Vp-R、Vp-T各0.4μmol/L，DNA模板3 μL，无菌水6.5 μL。反应程序为：95 ℃，10 min；95 ℃，15s；60 ℃，1 min，共40个循环。

1.3.9 RT-PCR方法的特异性测定

采用134株副溶血性弧菌（实验室分离株、2株ATCC参比菌株）、41株霍乱弧菌实验室分离株、
33株非目标菌株（包括创伤弧菌ATCC 1758、河流弧菌ATCC 1.1611、拟态弧菌ATCC 1.1969、溶藻弧菌ATCC 1.1607、溶藻弧菌ATCC 1833、费尼斯弧菌ATCC 1.1612、解蛋白弧菌ATCC 1.1826），对于RT-PCR引物特异性进行测试。

1.3.10 Nano-IMS-RT-PCR方法的建立和灵敏度的确定

按照1.3.4节方法制备ATCC 17802菌悬液，选取7个连续梯度的菌悬液，每个梯度取10 mL菌液，10000r/min离心2 min，弃上清液，用1 mL无菌生理盐水重悬菌体，用Nano-IMB-Vp富集菌体，煮沸法提取DNA，进行RT-PCR检测（n=2）。同时，将选取的每个稀释度菌悬液划线接种至弧菌显色培养基，按照GB/T 4789.7—2008《食品微生物学检验：副溶血性弧菌检验》[13]方法进行检验。

1.3.11 人工模拟样品的检测

称取经检测无Vp的扇贝样品25g于均质袋中，加入225 mL APW培养基，胃蠕动器击拍混匀30s，制备多份样品匀浆液。每份匀浆液添加1 mL经梯度稀释的Vp菌悬液，添加的菌体浓度分别为23 CFU/mL和2 CFU/mL，另设不添加Vp的样品基质为阴性对照，36 ℃培养，在2、4、6、8、10、12h取样，分别采用Nano-IMS-RT-PCR、Nano-IMS结合GB/T 4789.7—2008方法、RT-PCR以及GB/T 4789.7—2008方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 Nano-IMB-Vp捕获效率的测定

表 1 Nano-IMB-Vp的捕获率

Table 1 Capture rate of Nano-IMB-Vp

随着Nano-IMB-Vp用量的增加，捕获效率不断提高，当其用量为2.5、3.0mg和3.5mg时，捕获效率达到74%左右，表明当磁珠用量为2.5mg以上时，其捕获效率没有大幅增加。因此，后续实验均采用2.5mg Nano-IMB-Vp。

2.2 Nano-IMB-Vp捕获特异性的测定

本实验通过捕获实验对Nano-IMB-Vp特异性的验证结果表明，Nano-IMB-Vp对6株非目标菌的捕获率均在13%以下，因此Nano-IMB-Vp对6种非目标菌不存在特异性吸附。

表 2 Nano-IMB-Vp捕获特异性

Table 2 Specificity of Nano-IMB-Vp

2.3 RT-PCR方法的特异性

RT-PCR引物特异性的测试结果见表3。结果表明，所设计的RT-PCR引物具有良好的特异性，与非目标菌不存在交叉反应。

表 3 RT-PCR方法特异性

Table 3 Specificity of RT-PCR

注：＋.阳性反应；－.阴性反应。下同。

2.4 Nano-IMS-RT-PCR检测灵敏度

横坐标从左到右出现扩增曲线依次是：1.4×105 CFU/mL菌液、1.4×104 CFU/mL菌液、1.4×103 CFU/mL菌液、1.4×102 CFU/mL菌液。

图 1 Nano-IMS-RT-PCR检测灵敏度

Fig.1 Sensitivity of Nano-IMS-RT-PCR

如图1所示，该方法的检测灵敏度为1.4×102 CFU/mL，比传统检测方法高100倍。

2.5 Nano-IMS-RT-PCR检测人工模拟样品

在经传统方法验证不含目标菌的扇贝样品中进行人工添加实验，结果见表4。当添加菌体浓度为23CFU/25g样品时，Nano-IMS-RT-PCR的检出时间是6h，Nano-IMS-Vp结合GB/T 4789.7—2008方法检出时间是8h；在不用Nano-IMB-Vp富集菌体的情况下，RT-PCR检测方法的检出时间是10h，GB/T 4789.7—2008方法检出时间是12h。当添加菌体浓度为2CFU/25g样品时，Nano-IMS-RT-PCR的检出时间是8h，Nano-IMS-Vp结合
GB/T 4789.7—2008方法检出时间是10h；在不用Nano-IMB-Vp富集菌体的情况下，RT-PCR检测方法的检出时间是12h，GB/T 4789.7—2008方法在增菌12h时未检出。

表 4 扇贝模拟样品检测结果

Table 4 Results obtained by Nano-IMS-RT-PCR for the detection of spiked blank samples

3 讨 论

利用具有良好特异性的Vp单克隆抗体制备Nano-IMB-Vp，确定了在菌体浓度为103 CFU/mL时，Nano-IMB-Vp用量为2.5 mg/mL时，对Vp的捕获效率达到74%。采用6株非目标菌株对Nano-IMB-Vp的特异性进行了进一步验证，结果显示非目标菌的吸附率在13%以下，为非特异性吸附。使用2株ATCC Vp菌株、132株本实验室分离的菌株、41株自分离霍乱弧菌和33株非目标菌对RT-PCR方法的引物进行了特异性验证，结果表明所设计的RT-PCR引物具有良好的特异性，与弧菌属内和属外的非目标菌均不存在交叉反应。在纯培养条件下，Nano-IMS-RT-PCR方法的检测灵敏度为140 CFU/mL。基质添加实验结果表明，在低添加水平，即每25g样品中添加2CFU Vp时，Nano-IMS-RT-PCR方法的增菌时间只需8h，Nano-IMS-RT-PCR结合GB/T 4789.7—2008方法的增菌时间需要10h，RT-PCR方法缩短了4h，而在不使用Nano-IMB-Vp富集菌体的情况下，增菌12h时GB/T 4789.7—2008方法未检出。由以上结果得出：Nano-IMB-Vp可以高效、特异性富集副溶血性弧菌，本研究所建立的Nano-IMS-RT-PCR方法缩短了检测时间。

Nano-IMB不仅可以富集目标菌体，亦可有效的去除PCR反应抑制剂，如样品中存在的酚类化合物、脂肪、糖原或微生物代谢产物，这些物质抑制Taq聚合酶的活性，致使RT-PCR检测灵敏度降低[14-17]。但IMS技术本身也存在一些较难克服的问题，例如用于包被磁珠的单克隆抗体的效价，在抗体批次间易出现波动，直接影响Nano-IMB对目标菌的捕获率；其次在不同的标本性状及杂菌污染程度下，Nano-IMB和目标微生物间的相互作用在一定程度上会受到影响，降低捕获率[18]，如杂菌污染较多的牛肉类制品就不宜采用IMS技术分离目标菌[19-25]。

本研究将纳米免疫磁珠与RT-PCR技术相结合，经实验证实，适用于含有食品基质的增菌液检测。下一步将进行大批量实际样品检测，以充分验证Nano-IMS-RT-PCR检测方法在实际检测工作中的应用价值和应用前景。

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