SPME-GC-MS法分析金华火腿风味
物质的条件优化

李 鑫1，刘登勇1,2，李 亮1，徐幸莲1，周光宏1,*

（1.南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏 南京 210095；

2.渤海大学食品科学研究院，辽宁 锦州 121013）

摘 要：采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用法分析金华火腿风味成分，并对其分析条件进行优化，为监测金华火腿加工中的风味变化提供合适方法。选用75 μm CAR/PDMS萃取头，TG-wax MS色谱柱，利用Plackett-Burman设计法从可能影响响应值的因素中筛选出显著因素（P＜0.05），对显著影响因素进行单因素和正交试验，确定优化条件。确定适宜分析条件为萃取温度55 ℃、萃取时间55min、样品质量4.5g/15mL样品瓶，对金华火腿的风味物质分析得到55种成分，分别为烷烃、醛类、酮类、醇类、酸类、酯类和含硫含氮等化合物。

关键词：固相微萃取；气相色谱-质谱；金华火腿；风味物质；条件优化

Optimization of Condition for SPME-GC-MS Analysis of Flavor Compounds in Jinhua Ham

LI Xin1, LIU Deng-yong1,2, LI Liang1, XU Xing-lian1, ZHOU Guang-hong1,*

(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, China; 2. Food Science Research Institute, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Abstract: The aim of this work was to determine the optimal conditions for the analysis of flavor compounds in Jinhua ham. The volatile compounds were extracted by solid phase microextraction (SPME) and detected by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The method was suitable for studying the flavor ingredients and monitoring quality changes of Jinhua ham during manufacturing. Using 75 μm carboxen/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) extraction fiber and TG-wax MS column, Plackett-Burman design was used to select significant factors (P ＜ 0.05) from the ones that might influence total area of main peaks. Single factor and orthogonal array experiments were conducted on the significant factors to determine the optimal conditions. The optimal extraction parameters were determined as follows: 4.5 g of sample subjected to extraction at 55 ℃ for 55 min. Fifty-five compounds including hydrocarbons, aldehydes, ketones, alcohols, acids, esters, sulfur compounds, nitrogen compounds and others were identified in Jinhua ham.

Key words: solid phase microextraction (SPME); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); Jinhua ham; flavor compounds; optimization

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0122-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404025

金华火腿是我国传统干腌肉制品，具有俏丽的外形、鲜艳的肉质、独特的芳香，在国内外享有盛名[1]。其中芳香类气味是评价火腿质量最重要的指标[2]，火腿质量分级传统方法是对“三签头”闻香鉴定，但对评级师要求高且鉴定效率低下，因此通过现代仪器分析方法提取并分析金华火腿风味物质对研究其独特风味和质量监测均有重要作用。近年来对金华火腿风味研究有大量报道，主要集中在风味形成机理、香味主成分和分析方法3方面：如金华火腿加工中不同工艺点风味物质含量变化比较[3-4]、不同等级火腿风味物质含量的对比[5]，脂肪和蛋白质氧化降解和风味物质变化的相关性研究[6-7]等；利用气相色谱-质谱联用法结合气相色谱-嗅闻法、感觉阈值等确定金华火腿香味主成分[8-9]；采用不同的前处理方法提取金华火腿风味物质[10]。这些研究从不同角度分析了金华火腿风味相关问题，为日后研究奠定了基础。风味物质提取方法有热脱附法[11]、同时蒸馏萃取法、溶剂辅助蒸发法、固相微萃取法[12]等。固相微萃取法由于快速简便、无溶剂萃取、使用温和的提取条件[13]，并能与气相色谱、气-质联用、高效液相色谱、液-质联用连接实现直接进样[14]，因此在金华火腿风味物质前处理中应用广泛。固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法测定金华火腿风味物质的研究较多，但针对前处理和检测方法进行系统性研究还较少。田怀香等[15]已对SPME法不同萃取头、萃取时间和萃取温度3方面进行了研究。

本实验拟用SPME-GC-MS法分析金华火腿风味物质，针对SPME法进行系统性研究，对影响该方法的因素进行统计学分析得到显著影响因素，并优化金华火腿风味物质分析条件，确立用于检测金华火腿风味物质的较好条件，为以后检测和研究工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金华火腿购自金字火腿股份有限公司。样品为外形一致的真空包装带骨分割块，取回后置于－20 ℃的冷柜冻藏，直至分析时处理。

Trace Ultra气相色谱-DSQ II质谱联用仪器、Triplus自动进样器 美国Thermo公司；75 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；GRINDOMIX GM200刀式混和研磨仪 德国Retsch公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

将解冻后的火腿去除皮、骨、可见脂肪和肌肉表面氧化层，剩余肌肉用刀式混合研磨仪捣碎，捣碎条件3000 r/min，时间5s。然后迅速称量一定量样品置于15mL样品瓶，压盖封口。一般在测定样品前，加一瓶以上的环境空白样，用以消除干扰。

1.2.2 金华火腿风味检测条件

SPME条件：进针深度20 mm、进样量1μL，根据不同要求设定萃取温度、萃取时间和解吸时间。萃取头使用前应于280 ℃老化1h。

GC条件：TG-wax MS（30m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱；升温程序：初始温度35 ℃，保持4 min；以8 ℃/min升温至180 ℃；再以15 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min；进样口温度根据实验需要设定；分流进样，分流比：10∶1；载气：高纯氦气；载气流速：1.2mL/min；MS传输线温度：230 ℃。

MS条件：离子源温度200 ℃，电离电压70eV，扫描方式为全扫描，扫描范围m/z 33～350。

1.2.3 定性与定量方法

挥发性和半挥发性物质运用Xcalibar（Thermo Scientific）软件进行检测，将检测到的质谱信息与NIST和Wiley质谱数据库中的数据进行匹配，正反匹配度大于800（最大值为1000），并且配合手动检索校对进行定性；采用峰面积归一化法进行定量，风味成分以峰面积计算相对含量。

1.2.4 条件优化试验设计

1.2.4.1 Plackett-Burman设计法筛选显著性影响因素

首先利用Plackett-Burman设计法[16]，对影响响应变量（Y）的7个因素进行考察，从中筛选出对结果有显著影响（P＜0.05）的因素作为后续试验目标因素。这7个因素分别为预热温度（X1）、预热时间（X2）、萃取温度（X3）、萃取时间（X4）、解吸温度（X5）、解吸时间（X6）、样品质量（X7）。每个因素取两水平，即低水平（－1）和高水平（＋1）。作为评价指标的响应变量为主峰总峰面积，其中主峰总峰面积是去除环境空白、萃取头解吸产生的含硅杂质和饱和烷烃后，其余峰的总峰面积。高、低水平取值根据前期实验结果确定。

1.2.4.2 单因素试验

通过Plackett-Burman试验得到影响结果的显著影响因素，分别对其进行单因素试验，以主峰总峰面积为重要考察指标，以物质出峰数为辅助参考，综合评价试验条件。对主峰总峰面积进行单因素方差分析，比较各水平之间是否存在显著性差异。

1.2.4.3 最陡爬坡试验

对显著影响因素不同水平组合进行最陡爬坡试验，以便快速得到较好的因素组合，为正交试验选择水平提供参考。

1.2.4.4 正交试验

对显著影响因素水平进行组合试验，综合分析不同条件对结果的影响，并进行验证实验，最终确定SPME-GC-MS法分析金华火腿风味物质的分析条件。

1.3 数据处理

使用Minitab16软件分析Plackett-Burman试验结果；使用SAS Version 9.1.3软件进行数理统计分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验筛选显著性影响因素

Plackett-Burman试验设计方案和结果见表1，因素高低水平和试验结果分析见表2。Plackett-Burman试验设计利用较少的试验次数来考察较多的影响因素，只考虑各因素引起的主效应，忽略因素之间交互作用，因此该试验用于筛选显著影响因素（P＜0.05）作为后续试验研究重点，非显著影响因素（P＞0.05）根据试验情况确定取值。

该试验模型中因素的主效应P值为0.012，说明在统计学上具有显著性；R2Adj为88.87%，说明此模型解析了输出流程88.87%的变异；T值则反映了因素随着水平取值增加而引起的正负效应，本试验中只有解吸温度呈现负效应，即260 ℃解吸时没有得到更好的响应值。不同影响因素对应P值反映了该因素的显著性（P＜0.05），表2中萃取温度、萃取时间、样品质量3个因素为显著影响因素（P＜0.05），通过后续试验进一步说明其对萃取效果的影响；其余因素为非显著影响因素（P＞0.05），说明这些因素对响应值影响不显著（P＞0.05），在试验设定的条件范围内选取条件即可，具体取值为预热温度45 ℃、预热时间10 min、解吸温度240 ℃、解吸时间3 min。

表 1 Plackett-Burman试验设计和结果

Table 1 Design and results of Plackett-Burman

表 2 Plackett-Burman试验中的因素水平编码和影响

Table 2 Coded levels and significance of factors in
Plackett-Burman experiments

注：*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01；此结果仅说明限定高低水平下的显著性。

2.2 单因素试验

2.2.1 样品质量对萃取效果的影响

图 1 样品质量对萃取效果的影响

Fig.1 Influence of sample mass on extraction efficiency

样品质量取3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0g 6个水平，萃取温度55 ℃、萃取时间50 min。样品质量对萃取效果的影响见图1。一般不同种类样品所需要的最佳样品质量不尽相同。以主峰总峰面积为重要考察指标，通过单因素方差分析结果为3.5ab、4.0ab、4.5a、5.0ab、5.5b、6.0c g，其中不同字母代表存在显著性差异（P＜0.05），后续试验单因素方差分析说明与此相同。当取用4.5g样品时得到较高响应值和合适的出峰数，因此样品质量应选择4.5g。

2.2.2 萃取温度对萃取效果的影响

图 2 萃取温度对萃取效果的影响

Fig.2 Influence of extraction temperature on extraction efficiency

萃取温度取45、50、55、60、65、70 ℃ 6个水平，样品质量4.0g、萃取时间50 min。萃取温度对萃取效果的影响见图2。萃取温度不同水平方差分析结果为45c、50b、55a、60a、65ab、70b ℃。萃取温度达到60 ℃时，响应值最大，但有效成分峰数却在减少，这是由于温度高使萃取头固有涂层脱附，增加了杂质峰数。因此较高温度不利于样品中风味物质提取，还可能使物质之间发生一些热反应。综上分析，最佳温度应选55 ℃。

2.2.3 萃取时间对萃取效果的影响

图 3 萃取时间对萃取效果的影响

Fig.3 Influence of extraction time on extraction efficiency

萃取时间取40、45、50、55、60、65 min 6个水平，样品质量4.0g、萃取温度55 ℃。萃取时间对萃取效果的影响见图3。固相微萃取法原理是一个分配平衡过程，当达到动态平衡时，萃取头涂层吸附待测物质的量与其初始质量浓度呈正比[17]，因此在合适时间范围内，准确控制每次试验的萃取时间，结果具有可比性。萃取时间的方差分析结果为40b、45a、50a、55a、60a、65a min。萃取开始时，响应值随萃取时间延长而迅速增大，45 min后响应值增加不显著（P＞0.05）；从峰数上看，萃取时间对出峰数影响很小。综合考虑萃取时间应选择45 min。

2.3 最陡爬坡试验

表 3 最陡爬坡试验方案

Table 3 Steepest ascent experiments

图 4 最陡爬坡试验对萃取效果的影响

Fig.4 Influence of the steepest ascent experimental design on extraction efficiency

最陡爬坡试验方案见表3，试验对萃取效果的影响见图4。对各组间进行方差分析得到如下结果：1d、2c、3a、4c、5b、6ab。爬坡试验中第3组条件即4.5g、55 ℃、50 min的组合效果最好，且与其他组的试验有显著性差异（P＜0.05），以此结果作为正交选择水平的依据，但最终选定的水平要通过多次试验确定。

2.4 正交试验

表 4 正交试验因素水平表

Table 4 Coded levels for factors used in orthogonal array design

正交因素水平排序抽签决定，以萃取时间、样品质量、萃取温度为因素，主峰总峰面积作为评价指标，具体内容见表4，试验方案及对结果见表5。萃取温度对于主峰总峰面积影响最大，萃取时间次之，样品质量影响最小，优组合应为A3B3C1即4.5g、60 ℃、55 min。但从出峰数上分析，萃取温度60 ℃比55 ℃有效峰数要少，而主峰总峰面积相差不大。综合分析，确定萃取温度为55 ℃。通过多角度评价条件，最终确定优组合为4.5g、55 ℃、55 min。将理论优组合与正交表中第5组进行比较验证，得到理论组合平均值为6963404428，证实理论组有更好效果。

表 5 正交试验方案的结果

Table 5 Orthogonal array experimental design and results

2.5 金华火腿风味物质成分分析

在最优条件下测定金华火腿风味物质，其总离子流色谱图见图5，物质成分见表6。分析得到55种风味成分，其中烷烃3种、醛类11种、酮类5种、醇类11种、酸类11种、酯类6种、含硫含氮等化合物8种。刘登勇等[9]检测对金华火腿风味贡献较大成分12种，在工作条件下，可检出10种，（E）-2-癸烯酸和（E）-2-辛烯醛未检出；田怀香等[19]检测金华火腿风味活性化合物22种，在工作条件下，可检出18种，其余4种化合物中甲基硫醇时而检出，但正反匹配度较低；丙酮、2-甲基丁酸和3-甲硫基丙醛未检出，但本实验中检出了3-甲硫基丙醇，该化合物的氧化产物为3-甲硫基丙醛。因此，检出化合物存在差别可能与样品本身有关，本实验方法能较好检出对金华火腿风味有重要贡献的化合物。

图 5 金华火腿风味物质的气-质联用总离子流色谱图

Fig.5 Total ion current chromatogram of flavor compounds in Jinhua ham

表 6 金华火腿风味成分（n=4）

Table 6 Flavor compounds in Jinhua ham (n = 4)

注：香味描述分别引用了他人已研究的金华火腿、宣威火腿、法国Bayonne火腿和西班牙Iberian火腿中对香味活性物质的描述；—.感觉阈值较高，在食品中对风味几乎没有贡献；百分含量为对于同一保留时间出峰的物质百分含量计算在一起，以平均值±标准差表示。

3 结 论

本实验运用Plackett-Burman、单因素、最陡爬坡等试验设计对影响固相微萃取法的7个因素进行考察，其中样品质量、萃取温度和萃取时间3个因素对萃取效果有显著影响（P＜0.05）。在正交试验中，萃取温度影响最大，萃取时间次之，样品质量最小。最终确定金华火腿风味物质检测条件为样品质量4.5g/15mL样品瓶、预热温度45 ℃、预热时间10 min、萃取温度55 ℃、萃取时间55 min、解吸温度240 ℃、解吸时间3 min。该检测条件下分析得到
55种风味成分，其中烷烃3种、醛类11种、酮类5种、醇类11种、酸类11种、酯类6种、含硫含氮等化合物8种。

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