氧化电位法评价皂苷抗氧化活性

苏 伟1，赵 利1，袁美兰1，刘 华1，陈 钢2

（1.江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330013）

摘 要：应用电化学技术研究不同皂苷的氧化还原电位（oxidation-reduction potential，ORP）与清除自由基能力的相关性。结果表明：氧化还原电位低的皂苷溶液清除DPPH自由基、•OH与O2－•的能力弱，氧化还原电位高的皂苷溶液清除DPPH自由基、•OH与O2－•的能力强，皂苷溶液清除自由基的能力与其ORP值呈正相关。

关键词：皂苷；氧化还原电位；电化学技术；自由基

Evaluation of Antioxidant Activity of Saponin by Oxidation-Reduction Potential

SU Wei1, ZHAO Li1, YUAN Mei-lan1, LIU Hua1, CHEN Gang2

(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China;

2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330013, China)

Abstract: Oxidation-reduction potential (ORP) of different saponins and its correlation with free radical scavenging capacity were studied electrochemically. Results indicated that saponin solutions with low ORP values displayed a weak scavenging capacity against free radicals (DPPH radical, •OH and O2－•), and vice versa. The free radical scavenging capacity of saponins was found to be positively correlated with ORP values.

Key words: saponin; oxidation-reduction potential; electrochemical technology; free radical

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）05-0116-03

doi:10.7506/spkx1002-6630-201405023

现代研究表明：体内自由基反应与一些疾病的发生、发展和老化进程密切相关[1-2]。皂苷是常见的天然抗氧化剂，已被广泛应用于医药和食品等领域[3-4]。目前关于皂苷抗氧化活性的研究通常采用的方法是对其成分进行分离、纯化、活性评价，确定其功能作用[5]。但由于皂苷成分多、不易分离纯化，从而导致评价结果不准确且操作繁琐[6]。

氧化还原电位（oxidation-reduction potential，ORP）在物理化学及无机化学中均占有重要的地位[7]。它可以计算电动势和平衡常数、判断反应的方向和进行的程度[8-9]。因此，物质的氧化还原电位与药理活性的关系越来越受到重视。据研究表明皂苷化合物的ORP值与其直接或间抗氧化活性有着密切的关系[10-11]。

本实验前期研究中应用电化学技术测定不同质量浓度的苦瓜皂苷的ORP值，发现溶液ORP值与其清除自由基的能力呈正相关性。为探讨不同皂苷的ORP值与清除自由基的能力的相关性，本实验测定了多种皂苷相同质量浓度条件下的氧化还原电位值与清除自由基能力，并找出其关联性。该法快速、可行，对进一步发展电化学技术在评价抗氧化活性平台上的应用具有重要的理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、苦瓜、黄芪、三七、人参的皂苷提取物 本实验室制备。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、蛋氨酸、核黄素、氮蓝四唑（nitro-bluetetrazolium，NBT）、邻二氮菲、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HHS-21电热恒温水浴锅 上海百典仪器设备有限公司；3540-1振荡恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；LGJ-18型真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；RE-52 旋转蒸发仪 上海洪纪仪器设备有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 济南博华仪器有限公司；Cintra 6紫外-可见分光光度仪 北京东西分析仪器有限公司；TU-1901紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TM-39型ORP计 德国迈格公司。

1.3 方法

1.3.1 电化学法测皂苷提取物溶液ORP值[12]

将黄豆、苦瓜、黄芪、三七、人参皂苷5种提取物分别配成质量浓度为1mg/mL的溶液，用氧化还原电位去极化法自动测定系统测定各溶液的氧化电位。具体方法为：一端用甘汞电极，另一端用白金电极插入配制好的各皂苷溶液中，中间用KCl琼脂为盐桥连接二液体，二液体连接电位计（皂苷溶液通氮气），测定通风搅拌下的各皂苷溶液的ORP值。

1.3.2 皂苷提取物溶液对DPPH自由基的清除能力[13-14]

用无水乙醇配成6×10–5 mol/L的DPPH自由基溶液，黄豆、苦瓜、黄芪、三七与人参皂苷提取物依次配成质量浓度为1 mg/mL溶液进行测定。取4 mL DPPH自由基溶液，加入0.2 mL乙醇作为空白，于517 nm波长处测其初始吸光度，记为A1；另取4 mL DPPH自由基溶液，加入0.2 mL样品，在3.5h内每30 min测定其在517 nm波长处测吸光度，记为A2；根据测得的吸光度的变化可以由式（1）计算出其对DPPH自由基的清除率。

（1）

1.3.3 皂苷提取物溶液对•OH的清除能力[8,15]

将5种提取物依次配成质量浓度为1 mg/mL溶液进行实验。在10 mL的具塞比色管中依次加l.0 mL 1.865mmol/L邻二氮菲、2.0 mL 0.2mol/L、pH7.40的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）和l.0 mL蒸馏水，充分混匀后，加入l.0 mL 1.865mmol/L硫酸亚铁溶液混匀后，再加入l.0 mL 0.025% H2O2，37 ℃水浴10、20、30、40、50、60 min，于536 nm波长处测得损伤管吸光度（A损）。未损伤管以l.0 mL蒸馏水代替损伤管中的H2O2，操作方法同损伤管，可测得536 nm未损伤管的吸光度（A未）。样品管以l.0 mL样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536 nm样品管的吸光度（A样）。每个样品平行测6次，取峰值平均值进行定量。

（2）

1.3.4 皂苷提取物溶液对O2－•的清除能力[16-17]

将5种皂苷提取物依次配成质量浓度为1 mg/mL溶液进行实验。依次取0.5 mL蛋氨酸（0.1mol/L）、NBT（1×10-3 mol/L）、核黄素（3×10-5 mol/L）加入容量瓶中，然后加入0.5 mL样品，用PBS定容至5 mL，反应在装有20W节能灯，四周衬有铝箔的盒子中进行，调节反应物离灯的距离，使受光强度均匀，反应5、10、15、20、25、30 min，于560 nm波长处测吸光度。每个样品平行测6次，取峰值平均值。

以无光照的试液作校正，在560 nm波长处测得其吸光度（A），可表示为O2－•的含量。加清除剂后能清除O2－•，抑制了NBT的还原，测得其吸光度（A0）。

（3）

2 结果与分析

2.1 电化学法测皂苷提取物溶液ORP值

表 1 1 mg/mL不同皂苷溶液的ORP值

Table 1 ORP values of different saponin solutions at the concentration of 1 mg/mL

由表1可知，相同质量浓度的人参、三七、黄芪、苦瓜、黄豆的皂苷提取液，ORP值并不相同，说明其有效成分、含量的差异会导致其ORP值发生改变，会影响其氧化还原活性，这与已报道的研究结果具有一致性[18-19]。

2.2 不同ORP值皂苷溶液对DPPH自由基清除率的影响

图 1 不同ORP值的皂苷溶液对DPPH自由基清除率随时间变化曲线

Fig.1 Time-dependent DPPH radical scavenging activity of saponin solutions with different ORP values

由图1可知，5种皂苷溶液样品都有较强的清除DPPH自由基的能力，且ORP值越大，皂苷溶液清除DPPH自由基的能力越强。在测定时间范围内，DPPH自由基清除率随时间增长而递增，并且差距随着时间的延长更加显著。

2.3 不同ORP值皂苷溶液对•OH清除率的影响

图 2 不同ORP值的皂苷溶液对•OH清除率随时间变化曲线

Fig.2 Time-dependent hydroxyl radical scavenging activity of saponin solutions with different ORP values

由图2可知，5种皂苷溶液样品都有清除•OH的能力，且在测定时间内随时间呈递增趋势。ORP值越大，皂苷溶液清除DPPH自由基的能力越强。但差距随时间变化不大，始终保持较稳定的增长水平。

2.4 不同ORP值皂苷溶液对O2－•清除率的影响

图 3 不同ORP值的皂苷溶液对O2－•清除率随时间变化曲线

Fig.3 Time-dependent superoxide anion radical scavenging activity of saponin solutions with different ORP values

由图3可知，5种皂苷溶液样品都有清除O2－•的能力，并且在30 min内其清除O2－•的能力随时间递增。ORP 值越大，皂苷溶液清除O2－•的能力越强，但差距随时间变化不大，始终保持较稳定的增长水平。

3 结 论

相同质量浓度的不同皂苷溶液由于成分、含量不同，其清除自由基的能力、氧化还原的能力也不相同。通常情况下，是通过大量的体外氧化还原实验比较其清除自由基的能力，进而确定其在动物体内的抗氧化功能。本实验结果通过检测相同质量浓度的不同皂苷溶液的ORP值确定其清除自由基、抗氧化能力的大小，为筛选抗氧化物质提供了一种新的研究方法。

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