微胶囊化蛋白酶在干酪制备中的应用及
干酪成熟过程中电泳分析

张 娜1，郭庆启2，黄文秀1，赵新淮3,*

（1.哈尔滨商业大学 黑龙江省食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；

2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.东北农业大学 教育部乳品科学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

摘 要：将采用冷冻干燥工艺得到的明胶-阿拉伯胶-凝乳酶微胶囊用于干酪制备过程中，在排乳清之后向干酪中添加5.00g微胶囊化蛋白酶，以促进干酪的成熟。在干酪成熟过程中通过三羟甲基氨基甘氨酸-尿素-十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳分析监测干酪中pH4.6不溶性氮部分的变化情况。结果表明：干酪在成熟初期，αs1-酪蛋白较β-酪蛋白先水解，生成αs1-酪蛋白（f102～199）和αs1-I-酪蛋白；干酪成熟21d时，β-酪蛋白开始水解，αs1-酪蛋白继续保持水解，生成的大的水解产物同时也发生二次水解；干酪成熟90d时干酪中β-酪蛋白比αs1-酪蛋白具有更广泛的水解程度，酪蛋白降解的同时，生成大量新的小分子肽。

关键词：干酪；蛋白酶微胶囊；电泳分析；酪蛋白水解；小分子肽

Application of Rennet Microcapsule in the Preparation of Cheese and Electrophoretic Analysis of Cheese Ripening

ZHANG Na1, GUO Qing-qi 2, HUANG Wen-xiu1, ZHAO Xin-huai3,*

(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 3. Key Laboratory of Dairy Science,
Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract: The application of freeze-dried rennet microcapsule entrapped in gelatin blended with arabic gumfor cheese production was studied. Approximately 5.00 g of rennet microcapsules were added to cheese after discharging whey to promote the maturity of cheese. Trincine-Urea-SDS-PAGE and capillary electrophoresis (CE) were employed to analyze pH 4.6-insoluble nitrogen (pH4.6-ISN) fractions, and the results showed that caseins in cheese were degraded during the early stage of ripening, αs1-casein was degraded earlier than β-casein, and αs1-casein (f102–199) and αs1-I casein were produced; while at 21 d of ripening, β-casein was degraded and αs1-casein was still degraded, and the resultant hydrolysate with high molecular weight was and further degraded; while at 90 d, β-casein was degraded more extensively than αs1-casein. The proteolysis of caseins and some peptides with low molecular weight were generated at the same time. The release mechanism of chymosin from the freeze-dried microcapsule may be the hydrolysis of gelatin. The released core material acts on cheese and gelatin at the same time.

Key words: cheese; rennet microcapsules; electrophoretic analysis; casein degradation; low molecular weight peptide

中图分类号：TS201.1；TS252.53 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）05-0134-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201405027

干酪成熟时间较长，导致生产成本增加，因此干酪的促熟受到人们普遍关注。干酪促熟常用的方法有酶法、修饰发酵剂细胞、悬浮液系统、提高成熟温度、高压处理等[1-2]。干酪在成熟过程中经历了一系列复杂的物理和化学变化，而最重要的是蛋白水解，其过程最为复杂，它主要影响干酪质构，包括硬度、流变性、黏结性、断裂性、延展性、熔化性和乳化性，还影响干酪的风味[3-5]。本实验选用明胶和阿拉伯胶作为复合壁材，凝乳酶为芯材，通过冷冻干燥技术进行蛋白酶的微胶囊化[6]，采用凝乳酶微胶囊干酪促熟，并且用三羟甲基氨基甘氨酸-尿素-十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（trincine-urea-sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，Trincine-Urea-SDS-PAGE）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）方法，对添加凝乳酶微胶囊的干酪在成熟过程中蛋白质的降解产物进行分析，为干酪的生产提供理论参数。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

凝乳酶（Maxiren-180，1∶10000，食品级） 荷兰代夫特DSM公司；骨明胶 天津奥凯化工贸易有限公司；阿拉伯胶 德国Willy Benecke公司；低分子质量标准蛋白质（电泳级） 中国科学院上海生化研究所；冰乙酸 天津凯通化学试剂有限公司；甘油、
β-巯基乙醇、溴酚蓝 天津市博迪化工有限公司；酪蛋白-C5890、考马斯亮蓝R-250、四甲基乙二胺、十二烷基磺酸钠、N, N-甲叉双丙烯酰胺 美国Sigma公司；尿素、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺 北京索莱宝科技有限公司。

AL204型电子天平、DELTA 320型精密pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TU-1900型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；LGJ-1型冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；DYCZ-28A型电泳槽、DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；UVP/C8484-05G凝胶成像分析系统 美国UVP公司；Foss2400型全自动凯氏定氮仪 瑞典Foss公司。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶微胶囊的制备

以明胶和阿拉伯胶为壁材，采用冷冻干燥工艺制备凝乳酶微胶囊，具体方法见参考文献[6-7]。

1.2.2 添加凝乳酶微胶囊的干酪的制备工艺

在优化后的毛霉干酪生产工艺的基础上进行改进[8-9]。当采用重力-静止-加热方法排乳清后，在每100g凝乳中添加5g凝乳酶微胶囊，充分混匀后，将凝乳转移至直径15 cm、高30 cm的圆形模具中，0.3 MPa条件下压榨2 h，每隔30 min将干酪翻转，继续压榨。压榨后的凝乳切割成3 cm×1.5 cm×1.5 cm的立方体，然后将干酪样品转移至相对湿度85%～90%、（4±1）℃的干酪成熟室进行成熟。

1.2.3 干酪中蛋白质的降解

1.2.3.1 样品预处理

在干酪成熟1、7、14、21、28、35、60d和90d时，从干酪中心区域和干酪表面区域采样[10]。

pH4.6-可溶性氮（pH4.6-soluble nitrogen，pH4.6-SN）部分和pH4.6-不溶性氮（pH4.6-insoluble nitrogen，pH4.6-ISN）部分，根据Kuchroo[11]、Piraino[12]等所描述的方法提取。

1.2.3.2 化学分析

pH4.6-SN部分采用凯氏定氮法进行测定[13]，并以其占干酪总含氮量的质量百分数来表示（pH4.6-SN/TN）。

1.2.3.3 电泳分析

0.2g pH4.6-ISN与0.2 mL Tris缓冲溶液（0.06mol/L，pH 6.8）混合，其中含β-巯基乙醇（体积分数5%）、甘油（25 g/100mL）、SDS（2 g/100mL）、溴甲酚蓝（0.1 g/100mL），沸水中加热5 min后用于Tricine-Urea-SDS-PAGE分析。标准酪蛋白用6.6mol/L尿素溶解后，取0.2 mL按照干酪pH4.6-ISN样品的操作方法进行标准酪蛋白的电泳上样液的前处理。

Tricine-Urea-SDS-PAGE分析方法：采用三层不连续胶的结构，由分离胶＋夹层胶＋浓缩胶构成，各层胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。49.5 g/100mL丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度（T）-3.0%的交联百分浓度（C）：丙烯酰胺48.0 g，甲叉双丙烯酰胺1.5 g，用蒸馏水定容至100 mL。49.5% T-6.0% C：丙烯酰胺46.5 g，甲叉双丙烯酰胺3.0 g，用蒸馏水定容至100 mL。凝胶缓冲溶液：Tris 36.4 g，用蒸馏水溶解后用HCl调pH值至8.45，再用蒸馏水定容至100 mL。阳极缓冲溶液：Tris 12.11 g，用蒸馏水溶解后用HCl调pH值至8.90，再用蒸馏水定容至500 mL。阴极缓冲溶液：Tris 12.11 g，Tricine 17.92 g，SDS 1.00 g，用蒸馏水定容至1000 mL。凝胶的配制方法如表1所示。

表 1 分离胶、夹层胶和浓缩胶的组成

Table 1 Composition of separating, spacer and stackinggels

3种胶的制胶体积比为4∶1.5∶1。电泳时，先将电压调至80V，待指示前沿到达分离胶时，把电压调制120V，至电泳结束。电泳结束后胶片固定2 h（固定液包含0.5%戊二醛，30%乙醇），染色12 h（染色液含有0.2 g/100mL考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%乙醇）。染色结束用脱色液（包含45%甲醇，10%冰乙酸）对胶片进行洗脱，直到蛋白质条带清晰为止。采用凝胶成像系统软件Labwork 4.5软件进行处理并分析。

CE分析条件：流动缓冲液（50mmol/L）包含14.7mol/L H3PO4、6mol/L尿素溶液和0.05 g/100mL羟丙基甲基纤维素，调整pH值至2.5。上样缓冲液（pH 8.0）包含10mmol/L H3PO4，8 mol/L尿素溶液和10 mmol/L二硫苏糖醇。两种缓冲溶液使用前用0.22 μm微孔膜过滤，所有分析用溶液均用去离子水配制。

不同成熟时间的干酪pH 4.6-ISN部分溶解于上样缓冲液中，终质量浓度达到10 mg/mL，室温下放置1h后用0.22 μm微孔膜过滤。用未涂层的熔融石英柱（60 cm×50 μm，检测窗口为长50 cm的石英柱），样品在阳离子液中进行分离。样品注入压力0.5psi，进样时间5s，分离电压18.5kV，分离温度30 ℃，采用紫外检测器在214nm波长处进行检测，数据收集频率5Hz。每次进样前，将毛细管用0.1 mol/L NaOH、去离子水、0.1 mol/L HCl和流动缓冲溶液分别清洗3、5、3、5 min。用32-Karat软件进行毛细管电泳图的自动记录和数据分析。

2 结果与分析

2.1 Tricine-Urea-SDS-PAGE分析结果

小分子的肽很难通过SDS-PAGE区分，需要借助Tricine-Urea-SDS-PAGE分析技术。Tricine-Urea-SDS-PAGE能够显示酪蛋白水解的程度，根据蛋白质亚基和肽片段分子质量大小的不同将其分成不同的条带，条带颜色的深浅反映出蛋白质和肽类含量的多少，并能具体确定酪蛋白降解产物，尤其能够显示出小分子肽的生成情况。Tricine-Urea-SDS-PAGE电泳结果如图1所示。参照已发表研究结果[14-21]，成熟1 d的干酪中主要含有的是
αs1-酪蛋白（αs1-casein，αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）和
β-酪蛋白（β-CN），其中αs1-CN和αs2-CN的含量明显多于β-酪蛋白。成熟过程中，αs1-CN、αs2-CN和β-CN的条带颜色均减弱，成熟7 d时αs1-CN和β-CN颜色条带变化不明显，αs1-CN水解产物αs1-CN（f102～199）和αs1-I-酪蛋白（αs1-I-CN）出现，但不明显。在成熟7～14 d时，αs1-CN颜色条带减弱，同时发现αs1-CN（f102～199）和αs1-I-CN所对应的两条带颜色显著加深（泳道3），而此过程中β-CN条带颜色变化不明显，说明αs1-CN较β-CN先水解。

由图1可知，21 d时，β-CN条带颜色比成熟14 d时要减弱，此时αs1-CN条带颜色继续保持减少趋势，但是
αs1-CN（f102～199）和αs1-I-CN的增长并不明显，说明此过程中β-CN开始被水解，αs1-CN继续保持水解，生成的大的水解产物同时也发生二次水解，生成分子质量更小的肽类，条带下移，在电泳图中体现为副-κ-酪蛋白（副-κ-CN）以下形成分子质量更小的条带（泳道4）。这种变化一直持续到成熟90 d。90 d时，αs1-CN和β-CN条带颜色同成熟1 d相比颜色极浅，同时在副-κ-CN以下形成的条带颜色更深（泳道7）。αs1-CN和β-CN的变化同样说明添加蛋白酶微胶囊的干酪发生蛋白质的降解，生成新的中分子质量肽及小分子质量肽。

Marker.标准酪蛋白；1～7.成熟1、7、14、21、35、60、90 d的干酪样品。

图 1 添加蛋白酶微胶囊的干酪pH 4.6-ISN部分的Tricine-Urea-SDS-PAGE电泳图

Fig.1 Tricine-Urea-SDS-PAGE profiles of pH4.6-ISN fraction separated from cheese prepared with rennet microcapsules

2.2 CE分析结果

A.成熟1 d的干酪样品；B.成熟28 d的干酪样品；C.成熟60 d的干酪样品；D.成熟90 d的干酪样品；E.标准酪蛋白。

图 2 添加蛋白酶微胶囊的干酪pH 4.6-ISN部分的CE结果

Fig.2 CE profile of pH 4.6-ISN fraction separated from cheese prepared with rennet microcapsules

CE分析印证添加蛋白酶微胶囊的干酪中酪蛋白的水解情况，结果如图2所示。参照已发表研究结果[22-26],对标准酪蛋白CE分析的谱图（图2E）结果进行命名。1号峰为αs1-CN，迁移时间为18.56 min；2号峰为αs0-CN，迁移时间为20.96 min；3、4号峰均为副-κ-CN，迁移时间为23.35～24.84 min；5号峰为β-CN-A1，迁移时间为26.52 min；6号峰β-CN-A2，迁移时间为28.74 min。添加蛋白酶微胶囊的干酪，在成熟1 d时，毛细管区带电泳谱图同标准酪蛋白（图2A）类似，在迁移时间15～30 min内存在5个主要组分，分别为αs1-CN、αs0-CN、副-κ-CN、β-CN-A1、β-CN-A2；除此之外，在迁移时间为51.8 min处也出现一个优势峰，这个峰可能是由于明胶的存在形成的。随着干酪的成熟，整个CE图中各峰的分布发生改变。成熟28 d时，CE谱图中除原有的蛋白峰外，出现更多的的肽类峰图谱，而其中αs1-CN、αs0-CN、副-κ-CN以及β-CN-A2的峰面积明显降低，而β-CN-A1减少幅度最小。迁移时间为51.8 min处的明胶所对应的峰面积也显著减少。说明芯材释放后作用干酪中的蛋白质的同时也水解明胶，再次证明本课题组之前的假设，即蛋白酶微胶囊的芯材释放机制之一可能是通过水解来实现。

蛋白酶微胶囊在干酪中的缓释效果及对酪蛋白的作用显著。这是由于明胶的溶解性与其自身浓度和环境温度关系密切，在低温、低水分含量的环境下，明胶的溶解性能极差。将蛋白酶微胶囊加入到室温下的干酪半成品中后，明胶缓慢地吸水溶胀，不会造成蛋白酶的大量流失。作为典型的“高浓度低黏性”胶体，阿拉伯胶却同时具有高微胶囊化产率、高微胶囊化效率、高水溶性的特点，能很容易地溶于冷、热水中而不结团，配制成50%的水溶液后不结团，具有较好的流动性。当把蛋白酶微胶囊产品在压榨前加入到干酪凝乳中，微胶囊表面的阿拉伯胶能够迅速分散，吸收凝乳中的少量乳清，增加乳清的黏度，阻碍乳清的流动，并以水化的形式保持水分，为明胶溶胀提供充足的水分，使干酪中的微胶囊化蛋白酶能够更快的作用于明胶，并从中释放出来。

3 结 论

本实验通过Trincine-Urea-SDS-PAGE以及CE方法对干酪成熟过程中蛋白质降解分析，结果表明在酪蛋白成熟初期αs1-CN较β-CN先水解，生成αs1-CN（f102～199）和αs1-I-CN；干酪成熟21 d时，β-CN开始水解，αs1-CN继续保持水解，生成的大的水解产物同时也发生二次水解，生成分子质量更小的肽类；干酪成熟90d时酪蛋白降解，生成大量新的小分子肽。芯材释放后作用干酪中的蛋白质的同时也对明胶产生水解作用，因此，推测蛋白酶微胶囊的芯材释放机制之一是水解。

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