苦瓜提取物抑制3T3-L1脂肪细胞脂肪沉积研究

屈 玮，陈彦光，吴祖强，王 鑫

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

摘 要：研究表明苦瓜具有一定减肥效果，但其确切分子机理尚未阐明，因此本实验研究苦瓜正丁醇提取物抑制脂肪沉积活性及其作用机制。针对3T3-L1脂肪细胞，利用噻唑蓝法检测苦瓜正丁醇提取物对细胞活性影响；采用油红O染色检测苦瓜正丁醇提取物对细胞脂肪沉积的影响；利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测苦瓜提取物对脂肪沉积转录因子和脂肪酸代谢关键基因mRNA转录水平调控作用。结果表明：相对空白对照组，苦瓜提取物能明显减少3T3-L1细胞脂肪沉积，抑制转录因子C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表达，对脂肪酸代谢基因GLUT4、ACC1、Fasn、AP2和LPL的mRNA表达抑制明显（P＜0.05）。总之，苦瓜正丁醇提取物对脂肪沉积具有一定抑制作用，可能通过下调脂肪沉积相关基因mRNA转录水平表达起作用。

关键词：苦瓜；脂肪沉积；3T3-L1细胞

Anti-adipogenic Effects of Bitter Melon Extracts in 3T3-L1 Adipocytes

QU Wei, CHEN Yan-guang, WU Zu-qiang, WANG Xin

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: Bitter melon (Momordica charantia) has been shown to ameliorate high-fat diet-induced obesity, but the underlying molecular mechanisms are still unknown. The objective of this study was to elucidate the effect of bitter melon extracts on adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was used to measure cell viability; Oil red O staining and spectrometric determination were carried out to investigate the effect of bitter melon extracts on adipocyte differentiation.The mRNA expression levels of adipogenic genes were measured by real time-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results revealed that bitter melon extracts markedly inhibited lipid accumulation. The n-butanol fraction blocked the expression of adipogenic transcription factors, including peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein-alpha (C/EBPα) and sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) at the mRNA level. Moreover, the mRNA levels of 5 key lipogenic enzymes including glucose transporter-4 (GLUT4), acetyl-CoA carboxylase (ACC1) fatty acid synthase (Fasn), adipocyte protein 2 (AP2) and lipoprotein lipase (LPL) were down-regulated. These results indicate that the n-butanol fraction of bitter melon suppresses adipocyte differentiation and lipid accumulation through inhibiting the transcription of adipogenic genes and may have applications for the treatment of obesity.

Key words: bitter melon; adipogenesis; 3T3-L1 adipocytes

中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）05-0188-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201405037

肥胖作为一种代谢疾病已成为危害全球公众健康的主要问题之一，它与高血压、二型糖尿病、冠心病和中风等多种疾病的发生密切相关[1]。治疗肥胖的药物主要有西布曲明（Sibutramine）和奥利司他（Orlistat），上述两种药物均具有毒副作用，其中西布曲明可能增加服用者患严重心血管疾病的风险，其制剂和原料药已经停止生产和销售[2]。因此，寻求安全有效的抑制或延缓肥胖发生、发展的天然产物，对解决肥胖防治问题具有十分重要的意义。

脂肪沉积被认为是肥胖发展的关键步骤，控制这一步骤将能够有效地控制肥胖的进程[2]。脂肪沉积包括脂肪组织中脂肪细胞的增殖和前脂肪细胞分化，其中单个脂肪细胞的体积及其分化程度与细胞内甘油三酯积累量密切相关。脂肪的过度沉积是肥胖病理生理过程的核心[3]。3T3-L1脂肪细胞是当前国际上研究脂肪沉积分子机制的重要模型。前脂肪细胞3T3-L1来源于17～19d Swiss 3T3小鼠胚胎成纤维细胞，经克隆扩增而成，在体外诱导后可分化为成熟的脂肪细胞，是目前国际上公认的研究脂肪沉积过程的细胞株，广泛用于天然产物抗肥胖活性研究[4]。

苦瓜（Momordica charantia L.）为葫芦科苦瓜属植物，是一种广为种植的常用蔬菜，富含三萜类化合物、甾体、生物碱、多酚等多类活性次生代谢产物[5]。已有研究表明苦瓜具有减肥作用，苦瓜能够有效抑制高脂饮食小鼠体质量的增加[6]；减少体内脂肪组织的质量和甘油三酯含量[7]；改善肥胖引起的胰岛素抵抗[8-9]；苦瓜提取物能够抑制肥胖大鼠内脏脂肪聚积和附睾脂肪细胞肥大起到减肥作用[10-11]；苦瓜还可以降低肥胖小鼠脂肪组织中巨噬细胞和肥大细胞的募集，减少脂肪组织分泌炎性因子，从而降低脂肪组织和系统炎性[12-13]。苦瓜提取物可以抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖、降低脂肪细胞中甘油三酯含量[14]，但是苦瓜抑制脂肪沉积作用机理尚需进一步确认和完善。因此，本研究利用苦瓜的提取物，研究其对3T3-L1细胞脂肪沉积相关基因的调控作用，为基于苦瓜的抗肥胖功能食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

苦瓜购买于合肥周谷堆蔬菜批发市场，样本经安徽大学资源与环境工程学院周忠泽教授鉴定；小鼠3T3-L1前脂肪细胞株来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培养基、四甲基偶氮唑蓝 美国Sigma公司；逆转录试剂盒 美国Invitrogen公司；Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；C/EBPα、PPARγ、SREBP-1c、
GLUT4、ACC1、Fasn、AP2、LPL和β-actin引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他试剂为分析纯。

Forma 3111 CO2细胞培养箱 美国热电公司；MyiQ2 Real-time PCR仪 美国伯乐公司；TS100-F倒置荧光显微镜 日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 苦瓜提取物制备

将苦瓜冷冻干燥后粉碎，使用乙醇萃取3次，合并乙醇提取液，然后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相旋转蒸发，得到苦瓜正丁醇提取物[8]。

1.2.2 3T3-L前脂肪细胞培养

将3T3-L1前脂肪细胞置于含10%体积分数胎牛血清的DMEM高糖培养基（25mmol/L）中，37℃、体积分数5% CO2饱和湿度，1%双抗（80U/mL青霉素，0.08mg/mL链霉素）条件培养，长满80%时传代，选取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.3 细胞活力检测

采用噻唑蓝法测定细胞活力。取3T3-L1前脂肪细胞按照5×103 个/mL接种于96孔板，100 µL/孔，培养12h后分别加入不同质量浓度的苦瓜提取物溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL），连续培养48h后加入20 µL 5 mg/mL的噻唑蓝培养液，培养4h后将培养液吸干，每孔加入200 µL二甲基亚砜，振荡10 min溶解紫色结晶，然后用酶标仪在550nm波长处测定光密度值（以650nm为参考波长）[15]。

（1）

1.2.4 苦瓜提取物对3T3-Ll前脂肪细胞分化的影响

将3T3-L1前脂肪细胞接种于24孔板，使用DMEM高糖培养基（含10%体积分数胎牛血清）培养，当细胞完全融合后，加入胰岛素分化诱导剂（10 µg/mL胰岛素、0.5mol/L 3-异丁基1-甲基黄磦呤和1µmol/L 地塞米松）诱导48 h；然后更换DMEM高糖培养液（含10 µg/mL胰岛素）培养48 h；随后用DMEM高糖培养基继续培养2次，每次48 h。自诱导开始，实验组加入不同质量浓度（0.2、0.4 mg/mL）苦瓜提取物。最后1d将细胞使用4 g/100 mL多聚甲醛固定后，使用油红O染色观察胞浆中脂肪的聚集，染色后观察拍照；并用无水乙醇洗出油红O，
于脱色摇床摇晃5 min。每孔吸出后加入96孔板中，用酶标仪在510nm波长处测定光密度值，计算分化后脂肪细胞甘油三酯相对含量[14]。

（2）

1.2.5 RNA提取和实时荧光定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）

收集不同质量浓度苦瓜提取物处理8d后的3T3-L1
细胞，使用RNAiso Plus试剂盒提取其总RNA，合成第一链cDNA，然后取合成产物进行RT-PCR实验。使用β-actin作为内参基因，利用比较Ct法分析基因表达，选取空白对照组表达量为1，相对表达量表示为其余喂养条件下表达量与其比值百分比。3T3-L1细胞测定基因包括：C/EBPα基因，上下游引物分别是：5’-CAAGAACAGCAACGAGTACCG-3’和5’-GTCACTGGTCAACTCCAGCAC-3’；PPARγ基因：5’-GCATGGTGCCTTCGCTGA-3’和5’-TGGCATCTCTGTGTCAACCATG-3’；SREBP-1c
基因：5’-GGAGCCATGGATTGCACATT-3’和5’-GGCCCGGGAAGTCACTGT-3’；GLUT4基因：5’-GTGACTGGAACACTGGTCCTA-3’和5’-CCAGCCACGTTGCATTGTAG-3’；ACC1基因：5’-ATCCAGGCCATGTTGAGACG-3’和 5’-AGATGTGCTGGGTCATGTGG-3’；Fasn基因：5’-GCTGGCATTCGTGATGGAGTCGT-3’和5’-AGGCCACCAGTGATGATGTAACTCT-3’；AP2基因：5’-AAGGTGAAGAGCATCATAACCT-3’和5’-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3’；LPL基因：5’-TGTGTCTTCAGGGGTCCTTAG-3’和5’-GGGAGTTTGGCTCCAGAGTTT-3’。β-actin基因上下游引物分别是5’-GACATGGAGAAAATCTGGCA-3’和5’-AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。

1.3 数据分析

每个实验重复3次。采用统计软件SPSS 16.0分析，所得数据采用

±s表示，采用单项方差分析，邓肯氏多重检验用来确定数据间的显著性差异，显著水平设定为
P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 苦瓜提取物抑制3T3-L1前脂肪细胞生长

字母不同表示差异显著（P＜0.05）。图3～5同。

图 1 苦瓜提取物对3T3-L1前脂肪细胞活力影响

Fig.1 Cytotoxic effect of bitter melon extracts on 3T3-L1 cells

如图1所示，苦瓜提取物对3T3-L1前脂肪细胞有明显抑制增殖作用，随着提取物质量浓度的升高（0.1～0.8 mg/mL），其抑制细胞能力增强，剂量效应关系明显；0.2 mg/mL正丁醇提取物处理组细胞存活率为79.2%，0.4 mg/mL质量浓度时存活率为53.2%，与空白对照组相比差异达显著水平（P＜0.05）；其中IC50剂量是（0.54±0.02）mg/mL；因而选择0.2、0.4 mg/mL两个质量浓度进行下一步实验。

2.2 苦瓜提取物抑制3T3-L1细胞分化

3T3-L1细胞在分化成熟后会在细胞内聚集大量脂滴，油红O染色可以直观反应脂肪细胞的分化程度。由图2可知，与空白对照组相比，苦瓜提取物处理可以明显抑制脂肪细胞的分化，成熟的脂肪细胞中油红O染色的脂滴减少显著。对脂肪细胞的油红O染料定量结果表明（图3），苦瓜处理组可以显著减少3T3-L1细胞内甘油三酯含量（P＜0.05），其中0.2 mg/mL苦瓜提取物处理组细胞脂肪含量只有空白对照组的57.1%。以上结果表明苦瓜提取物显著抑制3T3-L1细胞分化，且其抑制作用不是细胞毒性引起的。

a

b

c

a.空白对照组；b. 0.2mg/mL苦瓜提取物组；c. 0.4mg/mL苦瓜提取物组。

图 2 苦瓜提取物对3T3-L1脂肪细胞形态的影响（×100）

Fig.2 Morphological micrographs of 3T3-L1 adipocytes after incubation with bitter melon extracts (× 100)

图 3 不同质量浓度苦瓜提取物对3T3-L1脂肪细胞分化的影响

Fig.3 Effect of different concentrations of bitter melon extracts on differentiation of 3T3-L1 adipocytes

2.3 苦瓜提取物对3T3-L1细胞脂肪沉积相关转录因子的调控

图 4 苦瓜提取物对3T3-L1细胞中脂肪沉积相关转录
因子基因表达的影响

Fig.4 Effects of treatment with bitter melon extracts on mRNA expression of genes associated with transcriptional regulation during differentiation of 3T3-L1 adipocytes

利用RT-PCR，检测苦瓜提取物处理对3T3-L1细胞脂肪沉积相关转录因子mRNA表达作用。如图4所示，C/EBPα和PPARγ是前脂肪细胞分化的关键调节转录因子；苦瓜正丁醇提取物可以显著下调两种基因mRNA表达量，其中0.2 mg/mL苦瓜提取物处理组分别下降为空白对照组的16%和42%，差异显著（P＜0.05）。苦瓜提取物还可以显著降低SREBP-1c基因表达，其中0.2 mg/mL
苦瓜提取物处理组下降为空白对照组的8%，差异显著（P＜0.05）。

2.4 苦瓜提取物对3T3-L1细胞脂肪代谢相关基因的调控

图 5 苦瓜提取物对3T3-L1细胞脂肪代谢相关基因表达的影响

Fig.5 Effects of treatment with bitter melon extracts on mRNA expression of genes associated with lipid metabolism during differentiation of 3T3-L1 adipocytes

如图5所示，与空白对照组相比，不同质量浓度苦瓜提取物处理均可显著下调细胞脂肪代谢相关基因mRNA表达，差异显著（P＜0.05）。其中0.4 mg/mL苦瓜提取物处理组对脂肪酸合成基因GLUT4（为空白对照组8%）、ACC1（为空白对照组13%）和Fasn（为空白对照组21%）的mRNA表达抑制明显；对脂肪酸吸收基因AP2（为空白对照组11%）和LPL（为空白对照组14%）下调显著。通过抑制脂肪酸合成基因表达，减少脂肪的形成；同时，抑制脂肪酸吸收关键基因AP2和LPL表达可以减少机体对饮食来源的脂肪酸的吸收。

3 讨 论

近年来研究表明，苦瓜具有明显减肥功效，其中正丁醇相提取物具有抑制脂肪沉积活性。苦瓜正丁醇提取物主要活性成分是三萜类化合物，而三萜类化合物具有抗炎、抗糖尿病、抗肥胖、抗氧化、抗菌等生物和药理活性[16]。本研究中，苦瓜正丁醇提取物主要含有各种三萜类化合物[11]，它可以显著降低3T3-L1前脂肪细胞的增殖；并显著减少分化的脂肪细胞中脂肪沉积，降低细胞内甘油三酯含量。脂肪沉积包括脂肪组织中脂肪细胞的增殖和前脂肪细胞分化，抑制脂肪沉积可以有效减少细胞内甘油三酯含量，起到减肥的效果[2]。Popovich等[14]流式细胞术研究表明苦瓜正丁醇提取物能将3T3-L1前脂肪细胞阻滞在G2/M期，从而抑制脂肪沉积；而苦瓜种子提取物可以抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖和减少脂肪细胞中的脂肪沉积[17]；Nerurkar等[18]证实苦瓜汁可以显著降低人脂肪细胞中脂肪含量。

在3T3-L1细胞分化研究已发现，脂肪沉积是一个高度精细的调控过程，多种转录因子（如C/EBPα、PPARγ、SREBP-1c等）和脂质代谢蛋白（如Fasn、ACC1、GLUT4、LPL和AP2等）[3,18]在其中发挥重要的作用。其中C/EBPα和PPARγ的过表达可以诱导并加快脂肪细胞分化，而SREBP-1c在前脂肪细胞分化早期发挥重要作用[3]。本研究中，苦瓜正丁醇提取物可以显著抑制脂肪细胞中C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表达，从而一定程度抑制了前脂肪细胞的分化；而Popovich等[14]研究表明PPARγ基因表达下调可能引起3T3-L1细胞内脂肪沉积减少。Fasn、ACC1、GLUT4和LPL是脂肪酸合成途径中关键酶，在脂肪沉积中发挥了重要作用[19]，石榴皮提取物可以通过抑制FAS酶活力而起到减肥效果[20]。本研究结果表明，苦瓜正丁醇提取物在mRNA水平对Fasn、ACC1和GLUT4表达下调显著，从而显著减少细胞内三酰甘油脂滴生成；同时抑制脂肪酸吸收关键基因AP2和LPL表达，从而减少细胞对外界环境中脂肪酸的吸收。

总之，实验结果表明苦瓜正丁醇提取物具有一定减肥效果。苦瓜正丁醇提取物能够显著抑制3T3-L1细胞分化，减少细胞脂肪沉积，可能通过减少转录因子
C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表达量，下调脂肪酸代谢基因GLUT4、ACC1、Fasn、AP2和LPL的mRNA表达实现。因而推测苦瓜正丁醇提取物通过调节脂肪酸代谢途径相关基因和转录因子mRNA表达，从而抑制脂肪沉积，同时提示苦瓜在肥胖的预防治疗中具有潜在的价值。

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