真菌毒素人工抗原制备方法研究进展

吴春生1，马 良1,2,3,*，胡媛媛1，张宇昊1,2,3

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400716；

3.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）

摘 要：基于免疫原理的酶联免疫吸附技术和金标免疫层析技术等是目前真菌毒素主要的快速检测技术。人工完全抗原的制备和抗体的性质是免疫快速检测技术中最关键的因素。本文对我国粮油产品危害较大的重点真菌毒素，综述目前国内外其各种人工抗原的制备/合成技术，并分析存在的问题和解决方法，为小分子污染物人工完全抗原的定向制备以及获得高亲和性高效价抗体提供一定的理论基础。

关键词：真菌毒素；半抗原；人工抗原；制备

Recent Progress in the Preparation of Artificial Antigen of Mycotoxins

WU Chun-sheng1, MA Liang1,2,3,*, HU Yuan-yuan1, ZHANG Yu-hao1,2,3

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservations (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400716, China;
3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

Abstract: The main analytical techniques currently available for rapid detection of mycotoxins include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and gold-labeled immunochromatography. The synthesis of artificial antigen and the nature of antibodies are the most critical factors in rapid immunological detection of mycotoxins. This paper reviews the recent progress at home and abroad in the preparation/synthesis of artificial antigens of mycotoxins as hazardous contaminants of cereal and oil products. In addition, some existing problems and corresponding solutions are pointed out. This review will hopefully provide a theoretical basis for preparing artificial antigens of small molecule contaminants and develop the antibodies with high affinity and specificity.

Key words: mycotoxin; hapten; artificial antigen; preparation

中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）05-0239-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201405047

真菌毒素（mycotoxin）是由真菌（青霉属、曲霉属和镰孢属等）产生的具有毒性的次生代谢产物[1-2]，通过直接污染农产品和食品、饲料，间接污染动物产品（乳、肉、蛋）等方式进入食物链，威胁人类健康安全。目前对农产品和食品污染和危害较大、检出率较高的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）[4-5]、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）[6]、伏马菌素（fumonisins）[7]、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，又称F-2毒素）[8]、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON；又称呕吐毒素（vomitoxin，VT））[9]、T-2毒素[10]、链格孢霉毒素[11]。这些毒素大多对人体有致畸、致癌、致突变等毒性作用，因此在越来越多国家的受到严格控制。截至2003年，至少有100个国家针对各种农产品、食品和饲料制定了真菌毒素的限量法规[12]。因此，建立快速、准确有效的检测食品中真菌毒素的技术对人类健康意义重大。免疫检测技术由于具有抗原抗体免疫效应快、特异性强等优点，在真菌毒素高灵敏、快速检测方面显现出快速、高效、低成本等巨大优势，已成为真菌毒素快速检测的主流技术，在现场实地、通关口岸等各种场合发挥着越来越重要的作用。

目前基于免疫学原理的快速检测技术主要包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]、胶体金免疫层析等技术（colloidal-gold immunochromatography assay，GICA）生产的免疫亲和柱（immnuoaffinity chromatography，IAC）[15]、免疫磁性微球（immunomagnetic microspheres，IMMS）等[16]，这些技术能够快速准确地检测粮油中的真菌毒素。在各种免疫速测技术中，抗体的种类和性质决定了免疫分析的灵敏度和特异性。针对真菌毒素、农药等小分子污染物，能否制备优良性状的抗体主要由人工完全抗原的制备和抗原免疫过程决定。人工抗原的制备是免疫检测技术的关键前提条件。本文就农产品和食品安全领域重点真菌毒素的人工抗原制备合成、鉴定及研究方法的国内外研究现状进行了综述，包括抗原制备中涉及的半抗原设计原则、偶联位点和连接臂的选择、载体蛋白的选择、半抗原的偶联方法、人工抗原的纯化与鉴定等，分析了抗原合成技术与抗体性质间的关系，为制备高效价、高特异性、具有自主产权的克隆抗体及相关检测试剂盒等各种快速免疫技术产品提供一定理论支持。

1 半抗原的设计与合成

真菌毒素通常分子质量较小（小于1000D），仅含单个抗原决定簇，是没有免疫原性的半抗原。在真菌毒素的免疫检测应用中，真菌毒素只有进行适当的设计合成、与大分子蛋白进行偶联制备成完全抗原后，才能完成后续的抗体制备和应用。

1.1 半抗原的设计与合成原则

人工抗原的设计与合成是抗体制备以及建立免疫分析方法的前提，对最终人工抗原的结构及特异性起关键作用[17-18]。Goodrow等[19]对半抗原设计要求进行了分析和阐述，认为半抗原设计中必须遵循以下原则：1）在分子结构、立体化学、电子分布和疏水性上应与待测物分子尽可能相似，以便于机体对特征结构进行识别；2）半抗原与载体之间的连接臂具有一定长度的碳链，且连接臂应不易诱导机体产生“臂抗体”；3）修饰后的半抗原分子末端需有可直接与载体蛋白质偶联的活性基团，且活性基团的存在对待测物分子的电子分布应没有影响；4）半抗原与载体偶联后仍应保留待测物分子的基本结构。

基于上述原则，真菌毒素等小分子半抗原与蛋白能否发生偶联的决定因素是真菌毒素小分子半抗原的结构。存在两类情况：第一类是某些真菌毒素本身分子结构中具有能与载体蛋白上的羧基/氨基反应的氨基/羧基；第二类是真菌毒素没有可直接与载体共价连接的基团，或虽有活性基团但需要经过一定的改造或转化才能与载体蛋白偶联，或直接与大分子载体连接后半抗原的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，出现影响机体免疫系统识别等情况。

针对第一类情况，真菌毒素本身分子结构中具有能与载体蛋白上的羧基/氨基反应的氨基/羧基结构，一般可以直接与载体蛋白进行偶合，制备人工抗原。如，OTA本身带有一个游离的羧基（图1），可以直接与蛋白质氨基偶联。黄飚[6]采用EDC法偶联OTA与钥蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH），制备了OTA单克隆抗体。伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1）结构上含有一个游离的氨基（图2），可以与蛋白质羧基端偶联。许金俊等[20]采用戊二醛法使FB1上的氨基与与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上的羧基偶联，并成功制备抗FB1单克隆抗体。

图 1 OTA结构式

Fig.1 Structure of OTA

图 2 FB1结构式

Fig.2 Structure of FB1

图 3 AFB1结构式

Fig.3 Structure of AFB1

图 4 TeA结构式

Fig.4 Structure of TeA

第二类情况中的真菌毒素一般需要重新设计、合成半抗原。如黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）本身性质不活泼，不具有连接蛋白质的活性基团（图3），需通过适当的衍生化方法，引入活性基团。1977年，Chu等[21]以吡啶为催化剂，在甲醇水中，通过回流将（氨氧基）乙酸半盐引入AFB1中，使其转换为AFB1肟化物（AFB1O）。AFB1O通过引入羧基和和载体蛋白质中的氨基等连接，最后成功制备出多克隆抗体。又如，细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）由于分子质量较小且没有芳香环结构（图4），即使通过饱和脂肪链作为间隔手臂偶联载体蛋白，仍很难诱导机体产生特异性抗体[22]。杨星星等[23]采用水合肼和乙醛酸对TeA进行衍生化，设计引入含有半刚性氮杂不饱和共轭双键的间隔手臂与载体蛋白偶联，合成了半抗原TeAH和TeAHGA。

目前半抗原的设计研究主要基于“trial-and-errorassays”，即试错法，这些设计方法工作量大且带有很大的经验性和随意性[24]。近几年来，随着分子模拟技术[25]的开发研究和逐渐应用，研究逐渐开始借助算机对不同的结合位点、连接臂对半抗原进行抗原表位相似度模拟，模拟参数包括空间构型、原子点电荷、疏水常数等，以期寻找最佳偶联位点与连接臂，同时通过分子轨道能隙计算来预测半抗原的分子稳定性。利用分子模拟技术指导半抗原的设计和筛选，可使半抗原的设计更具目标性、省时省力。

1.2 偶联位点和连接臂引入点的选择

图 5 DON结构式

Fig.5 Structure of DON

图 6 T-2结构式

Fig.6 Structure of T-2

在半抗原设计中，连接位点的选择决定了抗体的特异性，因此选择合适的偶联位点非常重要[26]。孙秀兰等[27]利用分子模拟技术，采用分子模拟软件Hyperchem 7.5，对DON（图5）及半抗原的表位决定参数（空间结构、原子点电荷、疏水常数）进行计算分析，通过对其结果参数以及分子轨道的计算比较，发现3位半抗原具有与DON最相似的结构性质，表明3位是DON引入连接臂的最佳位点，这与Casale[28]的免疫实验结果一致。T-2毒素（图6）通常是利用其结构中C-3位置作为引入带有活性基团的某种有机小分子的位点[29]，从而进一步与载体蛋白偶联，经常要用到的小分子物质主要有琥珀酸酐、戊二酸酐或者羧甲基肟[30]。

其次，半抗原设计中，为使真菌毒素半抗原突出于载体表面，易为机体免疫系统识别，在半抗原与载体蛋白之间一般会设计一段连接臂，而偶联较适宜的连接臂的长度为3～6个碳[31]，通常以含末端活性基团（—NH2、
—COOH、—OH、—SH等）的链烷为宜，并且应尽可能避免间隔臂含较强的决定簇（如芳环、共轭双键或杂原子等），以减少所产生的抗体对间隔臂的过度识别而降低对目标分子的识别能力[32]。除长度外，连接臂的结构对抗原的抗原性也有影响。金萍等[33]在3位羟基设计不同的连接臂结构，并将之进行免疫抗体实验，测定抗体效价及抑制率。结果表明B组（顺丁烯二酸酐臂）抗体平均效价1∶256000，A组（丁二酸酐臂）、C组（邻苯二甲酸酐臂）平均效价1∶64000；DON质量浓度为500ng/mL时对抗体的抑制率由大到小排列依次为：A组（66.4%）＞B组（21.1%）＞C组（10.8%）。A组与DON具有最高抗原表位相似度，所得抗体特异性强，抑制率高；B组连接臂中含不饱和键，增强了半抗原的抗原性，产生的抗体效价高；C组含有苯环，但其羧基端与半抗原主体结构非常靠近，半抗原结构可能被载体蛋白屏蔽而导致其未产生高效价的抗体，综合考虑丁二酸酐臂是DON最佳连接臂。

2 载体蛋白的选择

蛋白质由于结构复杂、免疫原性好，可作为大分子载体。它不仅可以增加半抗原的分子质量，而且可以利用其免疫原性诱导免疫应答，对半抗原产生载体效应。目前较常见的载体蛋白有：牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalburmn，OVA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、兔血清蛋白 （rabbit serum albumin，RSA）；人工合成的载体蛋白有多抗原肽系统（multiple antigenic peptide system，MAP）和多聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）[34]等。

BSA由于其物化性质稳定、不易变性、廉价易得，且赖氨酸含量高、分子内有很多自由的氨基、在不同的pH值和离子强度条件下均有较大的溶解度、可在含有机溶剂（如吡啶、N,N-二甲基酰胺等[35]）的情况下进行偶联等优点成为目前最常用的的载体蛋白。KLH虽然与脊椎动物免疫系统具有很好的异源性，但是其价格昂贵。研究表明，MAP能明显增加线性抗原肽的免疫性，其诱导家兔产生的抗体水平明显高于单拷贝短肽和偶联至琥珀酰化钥孔血蓝蛋白载体的肽[36]，未来很有可能用于研制针对多种真菌毒素的人工抗原的制备；而PLL由于经过亲水性氨基酸修饰，相当于在整个分子中插入了T细胞表位，免疫原性得到显著提高[21]。

载体的选择决定了免疫应答的特异性、融合的效率、特异性克隆的数目以及最终得到的抗体效价[37]，同时偶联机制和偶联反应对载体蛋白也有影响。孙秀兰等[38]通过荧光光谱在分子水平上探讨AFB1与BSA载体蛋白的偶联机制及偶联反应对BSA的构象影响，推测黄曲霉毒素和牛血清白蛋白反应的结合部位，同时发生在BSA的酪氨酸残基和色氨酸残基上，使得BSA疏水性增加，肽链伸展程度降低。在ELISA实验中，为避免载体蛋白干扰检测，免疫用人工抗原和包被用人工抗原所采用的载体蛋白也应不同[39]。而目前有关载体蛋白纯度、分子质量等对最终抗体性状的影响等方面报道还非常少，其具体影响情况还有待进一步研究。

3 半抗原与载体蛋白的偶联方法

根据真菌毒素的结构与特性，半抗原偶联的方法是由其活性基团决定的（表1）。当前真菌毒素人工完全抗原的合成方法，可具体分类为含有羧基或者可羧化、含氨基或者可还原为硝基以及含羟基3种情况。

表 1 常见真菌毒素和载体蛋白的偶联方法[40-42]

Table 1 Common methods of coupling mycotoxin with carrier proteins[40-42]

注：交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether，AME），属链格孢霉菌毒素。

对于含有羧基或者可羧化的真菌毒素，可通过碳化二亚胺法、混合酸酐法、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）活性酯法与载体蛋白进行偶联，其中以碳化二亚胺法和混合酸酐法最常用[42]。江湖等[43]采用EDC法先制备了AFB1肟化物，然后用其与C-BSA偶联两步反应制备了AFB1人工抗原。冯倩倩等[54]利用环己基碳化二亚胺（N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）的作用使OTA与NHS的羟基缩合成酯（活性酯），在碱性条件下，活性酯不稳定，易受蛋白质中氨基的亲核攻击，最后形成稳定的肽键，从而与OVA偶联。杨振东等[55]则先以氯甲基异丁酯与含有羧基的ZEN反应形成混合酸酐，然后先后与BSA和OVA上的氨基反应得到较高质量的ZEN人工抗原。

含氨基或者可还原为硝基的真菌毒素，可通过戊二醛法[59]、重氮化法等与载体蛋白进行偶联。钟秋芳[60]、王莹[61]等采用戊二醛一步法制备免疫抗原FB1-KLH和包被抗原FB1- BSA，所得FB1-BSA具有高灵敏度。值得注意的是戊二醛易受光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联能力，操作时应将半抗原溶液缓慢滴加至双功能交联试剂中，保证半抗原完全一对一的与双功能交联试剂偶联。郑其岚等[58]采用重氮化法，用AME与亚硝酸反应形成重氮盐与BSA结合支撑人工抗原免疫家兔，获得了效价较高的抗血清，并初步成功地进行了酶免竞争实验，证明了抗体的特异性和可应用性。但是该方法反应过程中蛋白质易变性产生大量沉淀，目前较少应用于其他真菌毒素的人工抗原制备。

含羟基的真菌毒素则可通过琥珀酸酐[66]、N,N’-羰基二咪唑（N,N’-carbonyldiimidazole，CDI）法等与载体蛋白进行偶联。徐娟等[56]在蒸汽浴条件下，用T-2毒素与琥珀酸酐反应合成了T-2HS，并与BSA和OVA结合生成T-2毒素抗原，紫外扫描分析表明其与BSA和OVA偶联比分别为6.66∶1、10.11∶1，表明此抗原能够用于免疫动物。Maragos等[64]通过CDI法将DON与载体蛋白OVA、BSA偶联成功制备了DON人工抗原。

4 人工抗原纯化

制备高质量的人工抗原，还需要纯化半抗原与载体的偶联物，去除未反应的半抗原分子、盐类及其他杂质。抗原纯化常用的方法有离心、透析和层析，离心和透析方法使用尤其广泛。透析一般所需时间较长（2d以上），纯化较为彻底、操作相对简单。将偶合的反应体系装入透析袋，放入透析液中并定时更换透析液，直至透析外液检测不出小分子。层析所需时间较短，但操作相对复杂，需要对流出组分进行跟踪分析，以确定目标组分[18,40]。近年来超滤技术由于具有通量高、操作条件温和、易于放大等特点，特别适合生物过程及生物活性大分子的分离纯化，广泛应用于生物产品的固液分离、生物产品的精制、蛋白质以及质粒DNA的分离纯化。目前采用超滤技术在食品安全领域中农药人工完全抗原的纯化应用较多，对真菌毒素抗原[61]和抗体[67]纯化方面应用处于起步阶段，但纯化效果较好。王莹等[61]采用先透析后超滤的方法处理合成的伏马菌素人工抗原，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法鉴定得出FB1-BSA和FB1-OVA分别在55kD和70kD左右有清晰单一的蛋白条带，证明人工抗原的纯度较好。

5 抗原鉴定方法

人工抗原鉴定是定性判断半抗原与载体偶联成功与否的关键，同时也可定量测定结合比和蛋白质含量等。最常用的鉴定方法是紫外扫描法[23]。以通过比较游离的半抗原、蛋白质和人工抗原的紫外吸收光谱来判断是否偶联成功。SDS-PAGE凝胶电泳法[68]也是比较常用的鉴定方法，主要是利用偶联后分蛋白质分子质量增大而出现的滞后现象初步判断偶联成功与否，操作简单，使用较为广泛。核磁共振技术[23,69]可直接判断该原子在分子中所处的位置及相对数目，是鉴定偶联成功与否最精确直接的方法，但价格较昂贵，目前应用较少。

定量结合比主要通过紫外分光光度法[70]、红外光谱法[71]、质谱法[72]等进行测定。前两者较为常用，主要根据吸收度的加和性原理，分别测定半抗原、载体、偶联物在吸收峰处吸收度即可计算结合比；质谱法非常适用于精确测定偶联物中半抗原与载体蛋白的结合比，此法简便、快速、且结果准确，值得推广。王莹等[72]采用基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱法（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）对由3种真菌毒素FB1、OTA、DON与两种载体蛋白OVA、BSA分别偶联制备得到的4种小分子-载体蛋白偶联物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA
的偶联结合比进行测定，并与紫外吸收光谱法进行比较，从结果来看，较紫外吸收光谱法更为简便准确。

除上述仪器方法外，动物实验是最有效的鉴定方法，也是抗原制备成功与否的实际验证方法。但该方法缺点是动物产生针对抗原的抗体需要较长的时间。邓舜洲[49]将制得的DON人工抗原免疫3只BALB/c小鼠，经4次免疫后（9周），1号小鼠血清抗体效价达
125600，且小鼠血清抗DON多克隆抗体与DON-HG-OVA的结合能被DON标品阻断，说明DON人工抗原制备成功。

综上，在实际应用中，可根据具体情况，采用一种或多种方法同时鉴定以确保人工抗原合成成功。曹欢等[73]分别采用薄层色谱法、高效液相色谱和液相-质谱联用3种技术进行ZEN半抗原的鉴定，采用紫外光谱法、结合比的测定及免疫学方法进行ZEN全抗原的检测，结果表明目标半抗原和全抗原合成成功。

6 结 语

基于抗原抗体反应的免疫学检测以其简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点已成为主流的真菌毒素快检方法。在小分子真菌毒素制备人工完全抗原方面，国内外进行了大量的研究。通过大量国内外文献资料的查阅，分析了制备真菌毒素人工完全抗原的合成中可能存在的各类问题，并提出了解决问题的途径和今后研究发展的可能方向。

首先，目前半抗原的设计与合成理论还不够完善，对于半抗原结构与免疫效果之间的关系还不够了解且某些真菌毒素结构复杂，在偶联位点的选择与连接臂的设计上存在一定盲目性，还需不断摸索。将3D分子模拟技术应用于真菌毒素人工抗原合成可以快速地确定最佳偶联位点及连接臂，通过实践检验其准确性也取得了较好成果，对半抗原的结构设计具有指导性意义。

另一方面，针对不同的真菌毒素人工抗原的合成虽有诸多偶联方法，但是仍存在交叉反应、受多种因素干扰（缓冲液成分、pH值、离子强度、偶联反应的温度和时间、半抗原载体物、载体蛋白和偶联剂在偶联反应中的相对浓度及其初始的摩尔比等）等缺陷。不同偶联方法和条件与所合成的人工抗原以及免疫后产生抗体性质的相关性还有待进一步探究并逐步优化。

近年来，分子印迹[74-75]、核酸适配体[76]和噬菌体展示肽库[77]等技术的出现为真菌毒素的快速检测提供了新的途径。它们通过人工合成或直接筛选的方法制备出能与小分子化合物具有特异性识别的聚合物、配体或者多肽，从而用于小分子化合物的分析与测定，这些聚合物、配体或多肽虽然与抗体功能类似，但是在亲和力和特异性识别方面还远远不及抗体。要制备好的抗体必须要好的抗原，因此，随着人工抗原制备方法的逐步改进和完善，利用免疫学原理检测真菌毒素将会成为应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测方法，为我国粮油食品的安全生产提供有效保障。

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