肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立

颜成英1,2，汤晓艳2,*，王 敏2，康大成2，李朋颖2，郑 锌1,2

（1.南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏 南京 210095；

2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

摘 要：将荧光染料叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide，EMA）与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术相结合，用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明，当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时，可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增；活菌灵敏度检测结果显示，EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL，说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现，添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗，且当样品中全是死菌时，没有目标条带出现；而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化，当样品中全是死菌时，目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的，EMA-PCR方法只检测样品中的活菌，避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。

关键词：叠氮溴乙锭；聚合酶链式反应；肠炎沙门氏菌

Detection of Viable Cells of Salmonella enteritidis by EMA-PCR

YAN Cheng-ying1,2, TANG Xiao-yan2,*, WANG Min2, KANG Da-cheng2, LI Peng-ying2, ZHENG Xin1,2

(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,

Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality
Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Abstract: The combination of ethidium monoazide (EMA) and PCR was used for detecting viable cells of Salmonella enteritis. The optimization of experimental parameters showed that a final EMA concentration of 50 μg/mL and exposure time of 10 min could restrain DNA amplification of dead bacteria in 107 CFU/mL of Salmonella enteritis. EMA-PCR and direct PCR methods showed the same detection limit of 27.5 CFU/mL for viable cells, suggesting that neither DNA amplification from viable cells nor PCR sensitivity is affected by the addition of EMA. As we observed for mixtures of viable and dead cells by the EMA-PCR method, the brightness of DNA stripes turned darker with reducing the proportion of viable cells, and when all bacteria were dead, no target stripe appeared. As for the control group without added EMA, the brightness of DNA stripe had no change, and even though the bacteria were all dead, the target stripe remained distinct. Therefore, the EMA-PCR method can distinguish dead bacteria from live ones, thereby avoiding false positive detection.

Key words: ethidium monoazide bromide (EMA); polymerase chain reaction (PCR); Salmonella enteritidis

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0090-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406018

肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）是引起人类肠胃炎的重要致病菌，也是导致禽蛋及其相关产品污染的主要原因[1]。据统计，由肠炎沙门氏菌引起的食物中毒占沙门氏菌食物中毒总数的17%[2]，从患者身上分离出肠炎沙门氏菌血清型的频率仅次于鼠伤寒沙门氏菌[3]。传统分离纯化法是肠炎沙门氏菌检测常用方法，该方法虽然准确率高，但过程繁琐、耗时耗力[4-5]，不能满足快速检测的要求。随着分子生物学和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术的发展，多种快速检测方法[6-7]应运而生并发展成熟，其中针对各类致病菌特异性基因建立的PCR方法，因灵敏度高、速度快而被广泛用于目标菌的检测[8-10]。但是单一PCR检测技术无法区分样品中的死菌和活菌[11]，因为死亡菌体的DNA会长时间残留在环境中[12]，PCR在以活菌DNA为模板进行扩增的同时也会扩增死菌的DNA，而使得检测值高于样品中活菌的数量，甚至出现假阳性结果。研究发现荧光染料叠氮溴乙锭（ethidium monoazide，EMA）可以特异性结合游离DNA、死菌DNA和细胞膜不完整或受损细胞的DNA，使其不能发生PCR反应[13]，将EMA与PCR技术联用可以达到克服传统PCR无法区分死活菌缺点的目的。EMA-PCR方法已用于多种致病菌的检测[14-15]，其中EMA浓度[16]及曝光时间[17]是影响死菌DNA扩增抑制效果的关键因素，因为EMA浓度过低、曝光时间过短均达不到完全抑制的目的，浓度过高又会对活菌DNA扩增产生影响[18]。本实验以肠炎沙门氏菌为研究对象，优化抑制肠炎沙门氏菌死菌DNA扩增的最小EMA质量浓度和最佳曝光时间，分析EMA-PCR方法的灵敏度及验证EMA区分肠炎沙门氏菌死菌和活菌的效果，以期为将该方法应用于肠炎沙门氏菌检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肠炎沙门氏菌 中国医学细菌保藏管理中心；EMA 美国Sigma公司；2×Power Taq PCR Master Mix 北京百泰克生物技术有限公司；DL 2000 DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司。

DEC-810 PCR仪 东胜创新生物科技公司；全能台式高速冷冻离心机 德国Thermo公司；NanoDrop 2000C紫外-可见分光光度计 美国Thermo Fisher公司；卤钨灯（500W） 飞利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 肠炎沙门氏菌活菌和死菌的制备

肠炎沙门氏菌接种LB培养基，37 ℃、200 r/min过夜培养，12 000 r/min离心10 min收集菌体，沉淀用灭菌生理盐水悬浮，紫外-可见分光光度计调整OD600 nm为0.40（菌液浓度为107 CFU/mL），得到活菌菌悬液。活菌菌悬液95 ℃水浴加热30 min得到死菌菌悬液。平板培养活菌菌悬液及死菌菌悬液，分别用于菌落计数和灭活效果检验。

1.2.2 抑制肠炎沙门氏菌死菌DNA扩增的最小EMA质量浓度

取0.5 mL灭活菌悬液至离心管中，加入EMA至终质量浓度分别为1、5、10、50、100、200 μg/mL，37 ℃黑暗处放置5 min，然后将离心管开盖放置冰上，在距离灯管12 cm处曝光5 min，离心收集菌体，试剂盒法提取DNA，DNA提取物定容为500 μL。

1.2.3 抑制肠炎沙门氏菌死菌DNA扩增的最佳曝光时间

取0.5 mL灭活菌悬液至离心管中，加入EMA至终质量浓度为50μg/mL，37 ℃黑暗处放置5 min，然后将离心管开盖放置冰上，在距离灯管12 cm处曝光，曝光时间分别为2、5、10、20 min，DNA提取同上。

1.2.4 EMA-PCR方法检测灵敏度分析

灭菌生理盐水梯度稀释OD600 nm为0.40的活菌菌悬液，使菌液浓度为107～101 CFU/mL，每个稀释度取0.5 mL，各取两管，一管加入EMA（终质量浓度为50 μg/mL、曝光10 min）处理后再提取DNA，一管不做处理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.5 不同活菌比例的混合菌液的EMA-PCR扩增

分别配制含有100%、75%、50%、20%、10%、5%、3%、1%、0%的肠炎沙门氏菌活细胞的菌悬液，分别取0.5 mL至离心管中，各取两管，一管加入EMA（终质量浓度分别为50 μg/mL、曝光10 min）处理后再提取DNA，一管不做处理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.6 引物序列及PCR反应

引物序列为沙门氏菌属通用引物[19]，引物序列上游：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGG GCAA-3’，下游：5’-TCATCGCACCGTCAAA GGAACC-3’，产物大小为284 bp，引物由上海生工合成。25 μL的扩增体系包括：12.5 μL PCR Master Mix，1.5 μL模板DNA，上下游引物各1.5 μL（8 μmol/L）、8 μL ddH2O。PCR反应体系：95 ℃预变性5 min，35个循环每个循环95 ℃变性30 s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 抑制死菌DNA扩增的EMA质量浓度的确定

M. DL 2 000 DNA Marker；1～6. EMA质量浓度分别为1、5、10、50、100、200 μg/mL。

图 1 肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法中EMA质量浓度的优化

Fig.1 Optimization of EMA concentration

活菌菌悬液平板计数结果为2.75×107 CFU/mL，死菌菌悬液培养平板无菌落长出，说明灭活较彻底。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，目标条带大小为284 bp。当菌液浓度为2.75×107 CFU/mL时，DNA条带亮度随着EMA质量浓度的增大逐渐变暗直至消失，当EMA质量浓度为50 μg/mL时即可完全抑制107 CFU/mL死菌的DNA扩增。

2.2 最佳曝光时间的确定

不同曝光时间对EMA抑制肠炎沙门氏菌死菌DNA扩增结果如图2所示。当菌液浓度为2.75×107 CFU/mL时，DNA条带亮度随着曝光时间的延长逐渐变暗直至消失，曝光时间为5 min时，条带基本消失，为了达到完全抑制目的，后续实验曝光时间设为10 min。

M. DL 2000 DNA Marker；1～4.曝光时间分别为2、5、10、20 min。

图 2 不同曝光时间抑制死菌DNA扩增

Fig.2 Optimization of exposure time

2.3 EMA-PCR方法对肠炎沙门氏菌活菌检测灵敏度分析

A.添加EMA

B.不添加EMA

M. DL 2000 DNA Marker；1～7.菌液浓度依次为107～10 CFU/mL。

图 3 EMA对肠炎沙门氏菌活菌的影响

Fig.3 Effect of EMA on viable salmonella enteritis cells

EMA质量浓度为50 μg/mL、曝光时间为10 min时，EMA-PCR方法对肠炎沙门氏菌活菌灵敏度检测结果如图3所示。EMA实验组（图3A）随着菌液浓度的降低，DNA条带亮度逐渐变暗，当稀释度为10-6即菌液浓度为27.5 CFU/mL时，依然有目标条带出现，所以其灵敏度检测最低限为27.5 CFU/mL。此外，对比EMA实验组（图3A）与对照组（图3B），当菌液浓度相同时，两组 DNA条带亮度基本一致，说明EMA处理不会影响肠炎沙门氏菌活菌DNA的扩增。

2.4 不同活菌比例混合菌液的EMA-PCR扩增

如图4所示，不添加EMA的对照组虽然活菌比例不同，但是死菌和活菌的总量是一样的，所以DNA条带的亮度是一致，即使活菌比例是0%时依然有目标条带出现；而添加EMA的实验组，因为EMA会与死菌的DNA结合使其不能发生扩增反应，所以参与扩增反应的初始模板的量是不一样的，故条带的亮度是不同的，且当活菌比例是0%时没有目标条带出现。

M. DL 2000 DNA Marker，条带大小由上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100 bp；1～9.添加EMA，活细胞比例依次为100%、75%、50%、20%、10%、5%、3%、1%、0%；1’～9’.不添加EMA，活细胞比例依次为100%、75%、50%、20%、10%、5%、3%、1%、0%。

图 4 EMA-PCR对肠炎沙门氏菌混合菌液的检测

Fig.4 Detection of mixed bacteria by EMA-PCR

3 讨 论

EMA与PCR联用的方法已用于多种目标菌的检测[20-21]，但是不同种属死菌DNA扩增被完全抑制所需EMA的浓度是不同的，EMA渗透到不同种属的活菌细胞的能力也是不一样的[22]，可能是由不同种属菌细胞膜的流动性或渗透性不同所造成的[23]。Lee等[16]发现，若曝光时间定为10 min时，0.8 μg/mL的EMA即可抑制浓度为5×107 CFU/mL的腐败菌死菌的DNA扩增，质量浓度为10 μg/mL的EMA对活菌的DNA扩增没有影响，当质量浓度达到50 μg/mL则会显著影响活菌的DNA扩增；伦镜盛等[24]研究表明，曝光时间为10 min时，2 μg/mL的EMA能有效的抑制1×108 CFU/mL副溶血弧菌死菌PCR反应，EMA质量浓度为5 μg/mL时对活菌靶基因的扩增没有明显抑制，当质量浓度高于10 μg/mL时，PCR反应被显著性抑制。Nocker等[23]利用SYTO9/EMA对活细胞进行染色时发现，EMA会将大肠杆菌O15∶H7等活菌细胞染成红色，且50μmol/mL EMA处理链球菌、微球菌、金黄色葡萄球菌活菌时会导致DNA提取量损失60%甚至更多，但是50μmol/mL EMA不会对鼠伤寒沙门氏菌及黏质沙雷氏菌的DNA提取量造成损失。赵瑜等[25]研究发现，EMA质量浓度为从0 μg/mL增加到18 μg/mL时，样品PCR条带亮度无明显减弱，表明低于18 μg/mL的EMA不会抑制沙门氏菌活菌的扩增。本实验中当曝光时间为5 min时，50 μg/mL
的EMA即能达到抑制2.75×107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA扩增的目的，且对活菌没有影响。

另外，曝光时间也是影响EMA抑制死菌PCR反应的关键因素。Helen等[26]使用EMA RT-PCR方法检测果汁中的结合酵母，曝光时间从1 min延长至5 min时，EMA抑制5×107 CFU/mL死菌DNA扩增的Ct值从29.7±0.179增加到37.9±1.817；Shi Hui等[27]证明曝光时间延长至20 min时ΔCt值会明显大于曝光时间为5、10、15 min时的ΔCt值，而Lee等[16]研究发现，曝光时间为1 min时，目标条带即消失。本实验中，曝光时间为5 min时，目标条带不再出现，但是为了实验更加准确，将曝光时间定为10 min。

建立的EMA-PCR方法的灵敏度分析结果显示，该方法的灵敏度与单一PCR方法相同，且用该方法检测不同活菌比例的混合菌液时，目标DNA条带亮度会随着活菌所占比例的降低逐渐变暗，当活菌比例为0%时，没有目标条带出现，说明EMA-PCR方法在不影响检测灵敏度的基础上，可以克服死菌造成假阳性的缺点，为将该方法用于实际样品检测奠定了基础。但是普通PCR无法对菌落数进行准确定量，后续研究可以将EMA与RT-PCR技术相结合，达到准确定量活菌数量的目的。

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